Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du professeur Anthony Windebank pour partager leur expertise sur les DRG dissection et la culture, ainsi que le professeur Chen Shaochen des discussions utiles sur la configuration de la DMD. Cette recherche a été financée en partie par l&#39;Université Tulane et des subventions du Conseil des régents en Louisiane (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) et le NIH (NS065374).

1. Configuration DMD <ol><li> Le conseil DMD, guide de lumière UV (avec collimateur) et objectif 4x sont tous montés à la verticale sur une table anti-vibrations. </li><li> Le guide de lumière UV devrait être ajusté afin que la lumière frappe le miroir array à un angle de 45 ° par rapport au plan des miroirs, et 24 ° en dessous du plan des miroirs (figure 1). </li><li> L&#39;objectif est monté de telle sorte que la distance de la DMD de la lentille de l&#39;objectif correspond à la longueur focale associée à la lentille. </li><li> Un microscope inversé est placé sous la lentille de l&#39;objectif, tel que la lumière réfléchie par le concentré DMD peut être visualisée à travers le microscope. La distance entre la lentille de l&#39;objectif à la surface de polymérisation doit correspondre à environ la distance de travail de la lentille. La scène sur le microscope peut alors être utilisé pour ajuster finement cette distance à focaliser l&#39;image. Cette distance peut varier en fonction de la surface de polymérisation choisi. </li></ol> 2. Construit hydrogel double pour des cultures d&#39;explants de tissus L&#39;adhérence A. explant DRG <ol><li> Enduire les murs de 6 puits revêtues de collagène inserts de culture cellulaire (Corning) avec Rain-X, en prenant soin d&#39;éviter la membrane elle-même. (Sinon, un stylo barrière hydrophobe peut être utilisé.) </li><li> Inserts Hydrater la nuit avec 1,5 mL de milieu d&#39;adhérence dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. L&#39;adhérence est moyenne milieu neurobasal avec 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine, 0.5mm L-glutamine, et 20 ug / ml de NGF. </li><li> Récolte des ganglions de la racine dorsale embryonnaire (DRG) de chiots E-15 chez le rat. GHM devrait être plaqué sur revêtues de collagène de 6 puits inserts, autant que quatre par plaquette. </li><li> Incuber inserts pendant 2 heures pour permettre l&#39;adhésion DRG à la membrane. </li></ol> Photopolymérisation B. masque dynamique Un dispositif micromiroirs numériques (DMD) est une matrice 1024 x 768 de miroirs individuels, semblable à celui de téléviseurs à projection, ce qui reflète la lumière de façon sélective basée sur la position miroir. Pour nos besoins, le DMD est utilisée pour l&#39;ultraviolet motif (UV) sur des hydrogels photoréticulables, la création de géométries hydrogel spécifiables d&#39;une manière simple et rapide. La figure 1 illustre la configuration de la voie la DMD et la lumière UV. Bien que notre DMD est une unité autonome, l&#39;appareil peut également être intégré pour une utilisation avec de nombreux microscopes existants. <ol><li> Retirez tous les excès de liquide d&#39;insertion, et ajouter 500 ul de milieu de polymérisation à l&#39;intérieur de l&#39;insert. Milieu de polymérisation contient du PEG à 10% (1000 MW) et de 0,5% Irgacure 2959 dissous dans un milieu de neurobasal complété avec 20 ug / ml de NGF et de Pen 1% / Strep. </li><li> Placer l&#39;insert sous le dispositif DMD sur une lame de Rain-X en verre traité. </li><li> Charger l&#39;image appropriée en noir et blanc pour être utilisé comme un &quot;photomasque&quot; sur le DMD, grâce à l&#39;utilisation du programme inclus GUI ALP-3 de base. Pour nos besoins, une forme bifurcation a été choisi pour permettre la mise en œuvre de systèmes d&#39;orientation des neurites. </li><li> En utilisant un microscope inversé pour la visualisation, d&#39;aligner les explants de tissu à l&#39;emplacement approprié sur le photomasque utilisant une source de lumière visible se reflétant sur la DMD. </li><li> Mettez la source de lumière visible pour la source de lumière UV, et d&#39;éclairer la solution de PEG jusqu&#39;à réticulation est suffisante. (Pour les conditions indiquées et 5,0 Watts / cm 2 d&#39;incident sur ​​le DMD, la réticulation peut être complétée en aussi peu que 55 secondes.) Répétez l&#39;opération pour tous les GHM quatre sur l&#39;insert. </li><li> Laver chaque insérer trois fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep. </li><li> Ajouter un milieu de croissance de 1,5 ml sous les inserts de culture cellulaire, et permettent d&#39;équilibrer dans un incubateur pendant 30 minutes. Le milieu de croissance est moyen neurobasal contenant B-27 à 2%, 1% Pen / Strep, 0.5mm L-glutamine et 20 ug / ml de NGF. </li></ol> C. hydrogel secondaire Puramatrix <ol><li> Pour des applications neuronales, Puramatrix 1% est dilué conformément aux instructions du fabricant à 0,15% en H 2 O stérile et complété avec 1 ug / ml de laminine soluble. </li><li> Tous les médias en excès doit être retiré de la PEG vides, qui contiennent les explants DRG, en utilisant un applicateur de coton stérile pointe, Kimwipe, ou micropipette. </li><li> Puramatrix est ajouté à la vides PEG avec une micropipette, afin de combler l&#39;espace vide, sans débordement. Selon le volume de vide, généralement ~ 1 ul est utilisé par la construction. </li><li> Puramatrix commence le processus d&#39;auto-assemblage immédiatement après le contact avec une solution salée physiologique, à savoir le PEG enflée, mais de 1,5 mL de milieu de croissance est ajouté au-dessous de l&#39;insert et placés dans l&#39;incubateur pendant une heure afin d&#39;assurer la gélification totale. </li><li> Initialement, Puramatrix est légèrement acide, donc changer le support après une heure pour permettre le pH à s&#39;équilibrer. </li><li> Changements des médias sont priés environ toutes les 48 heures. Veillez à ce que tous les médiasajouté en dessous de l&#39;insert, pour protéger l&#39;intégrité de Puramatrix mécaniquement faible. </li></ol> Agarose <ol><li> Pour des applications neuronales, l&#39;agarose est dilué à une solution à 1% en milieu de croissance et placé dans un bain d&#39;eau à 60 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose dissout complètement (~ 1 h). La solution est alors complété par 1 ug / ml de laminine soluble. </li><li> Tous les médias en excès doit être retiré de la PEG vides. </li><li> L&#39;agarose est ajouté à la PEG vides afin de combler l&#39;espace vide, sans débordement. Selon le volume de vide, généralement ~ 1 ul est utilisé par la construction. </li><li> 1,5 ml de milieu de croissance est pré-frais (8 ° C) dans une plaque à 6 puits, et les inserts d&#39;agarose contenant sont transférés aux médias réfrigérée et maintenue dans un réfrigérateur à 8 ° C pendant au moins trois minutes pour permettre à l&#39;agarose gel. </li><li> Enfin, les inserts sont transférés à 1,5 mL de milieu de croissance pré-chauffée (37 ° C) et maintenu dans l&#39;incubateur à 37 ° C, avec les changements de supports nécessaires toutes les 48 heures. </li></ol> 3. Double encapsulation cellulaire Hydrogel 3D Encapsulation hydrogel double est appropriée lorsque vous utilisez un gel de l&#39;auto-assemblage. Le gel photoréticulables, dans ce cas, le PEG, sert de support structurel pour la présentation géométrique du gel de l&#39;auto-assemblage, par exemple Puramatrix ou d&#39;agarose. Certaines de ces méthodes, en particulier le type de gel et le choix du photomasque, dépendra de l&#39;application particulière désirée. <ol><li> Charger un masque approprié sur la DMD. Pour notre survie cellulaire d&#39;application, nous avons simplement choisi une présentation cylindrique de Puramatrix à l&#39;aide de l&#39;imagerie des cellules. Les chercheurs qui étudient la signalisation cellulaire pourraient être intéressés à une géométrie parcellaire pour permettre la diffusion de molécules chimiotactiques. De plus, une approximation grossière d&#39;une artère a été montré pour représenter une éventuelle application à la recherche des vaisseaux sanguins. </li><li> Traiter les murs d&#39;un insert de culture cellulaire de polyester avec Rain-X, et les placer sous DMD sur Rain-X lame revêtue. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de polymérisation à l&#39;insert. Provoquer réticulation PEG par l&#39;exposition à la lumière UV pendant 55 secondes. </li><li> Laver trois fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep. </li><li> Retirez tous les supports vides en excès de la PEG. </li><li> Isoler les cellules à la densité désirée dans une pastille. Des précautions doivent être prises pour éliminer tous les moyens à partir du culot cellulaire avant de les mélanger, comme Puramatrix commence l&#39;auto-assemblage immédiatement après le contact avec une solution saline. Suspendre l&#39;intérieur des cellules Puramatrix 0,15% dilué dans H 2 O stérile complété avec 10% de saccharose. </li><li> Injecter l&#39;Puramatrix / cellule / saccharose mélange à l&#39;intérieur des vides dans le PEG. </li><li> Ajouter 1,5 mL de milieu de croissance en dessous de l&#39;insert, et de permettre au gel de l&#39;intérieur incubateur pendant une heure. </li><li> Changer les médias après une heure, et ~ toutes les 48 heures après. </li></ol> 4. Simple encapsulation cellulaire Hydrogel 3D Une encapsulation hydrogel unique serait approprié pour toute situation où les cellules peuvent être examinées à l&#39;intérieur d&#39;un hydrogel photoréticulables. <ol><li> Charger un masque approprié sur la DMD. Pour les études de survie cellulaire, nous avons de nouveau choisi un masque de base circulaire, pour représenter un cylindre. Masques similaires à celles indiquées dans la méthode 4 pourrait de nouveau être appliquée pour le champ de recherche approprié. </li><li> Traiter un insert de culture cellulaire de polyester avec Rain-X, et les placer sous DMD sur Rain-X lame revêtue. </li><li> Cellules à toute concentration désirée peut être ajouté directement à la solution de PEG 10%, en mélangeant bien pour assurer une distribution homogène. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de polymérisation à l&#39;insert. Provoquer réticulation PEG par l&#39;exposition à la lumière UV pendant 55 secondes. </li><li> Laver trois fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep. </li><li> Remplir avec un milieu de croissance au-dessous et au-dessus de l&#39;insert, en changeant tous les 2 jours ~. </li></ol> 5. Mince polymérisation du film d&#39;hydrogel <ol><li> Charger un masque approprié sur la DMD. </li><li> Traiter un revêtus de collagène insert de culture cellulaire de polyester avec Rain-X, et les placer sur Rain-X lame revêtue. </li><li> Ajouter milieu de polymérisation suffisant pour simplement couvrir le fond de l&#39;insert (~ 250-300 uL pour les inserts plaque à 6 puits). Autoriser les médias à travers la membrane d&#39;insertion pour 30-45 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer l&#39;excès de milieu de polymérisation l&#39;insert avec une micropipette ou Kimwipe. Ajouter une quantité suffisante d&#39;UV-transparente d&#39;huile pour recouvrir complètement le fond de l&#39;insert. Autoriser l&#39;insertion de s&#39;asseoir pendant 15-30 minutes à température ambiante, assez longtemps pour que l&#39;huile pour former une couche distincte au-dessus du milieu de polymérisation saturer la membrane d&#39;insertion. </li><li> Placer l&#39;insert et de glisser sous la DMD. Provoquer réticulation PEG par l&#39;exposition à la lumière UV. En raison de la minceur de la couche de PEG, la réticulation peut être complétée en aussi peu que 15 secondes à 5,0 W / cm 2 d&#39;incident sur ​​la DMD. </li><li&gt; Lavez les trois fois avec du DPBS insertion stérile et 1% de Pen-Strep. (Si la persistance d&#39;un résidu huileux est une préoccupation, un détergent doux tel que le Tween 20 (1%) peut être ajouté au tampon de lavage.) </li><li> Magasin de l&#39;insert dans une plaque de 6 puits de culture de tissu. Ajouter un milieu de croissance pour les cellules en suspension, dans la concentration désirée, et la pipette un volume suffisant de la suspension cellulaire dans l&#39;insert de culture cellulaire afin d&#39;obtenir la densité cellulaire désirée. Ensuite, ajoutez un milieu de croissance assez en dessous de la insérez complètement à maintenir la viabilité des cellules (~ 1,5 ml). </li><li> Après 48 heures se sont écoulées, se laver les trois insérer des fois avec du DPBS stérile et 1% de Pen-Strep pour déloger les cellules non collées. Changer les médias environ une fois toutes les 48 heures. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Exemples d&#39;hydrogel double constructions contenant des explants DRG sont présentés dans la figure 2. Remarquez que la migration cellulaire et l&#39;extension des neurites est limitée à la région de cellules permissives de l&#39;hydrogel double construire. La figure 3 représente cellules dissociées de la même encapsulée à l&#39;intérieur du construit hydrogel double. En raison de la nature dynamique du photomasque DMD, la géométrie disponibles pour l&#39;encapsulation est seulement limité par les dimensions et la résolution de l&#39;optique. Encapsulation des cellules est également possible à l&#39;intérieur d&#39;un hydrogel seule photopolymérisables, PEG, et un test de viabilité vivants / morts a été réalisée, comme en témoigne la figure 4. Encapsulation dans le PEG est destinée uniquement à titre d&#39;exemple, que le PEG ne représentent pas un environnement idéal pour des cellules neurales. Par conséquent, la viabilité cellulaire réalisé dans nos constructions PEG est compréhensible faible. Enfin, des exemples de l&#39;utilisation des films minces de PEG comme une couche à motif contraignant pour l&#39;adhésion cellulaire sur les inserts de culture cellulaire sont présentés dans la Figure 5. En outre, les exemples de possibles «mauvais» résultats sont proposés dans la Figure 6. Les résultats ne représentent qu&#39;une petite fraction des utilisations possibles des méthodes développées dans notre laboratoire. Ils sont destinés à démontrer la facilité, une polyvalence et la viabilité de notre approche, et pourrait être traitée comme une «preuve de principe» pour les chercheurs à développer leurs propres adaptations possibles. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Illustration schématique de la voie de lumière utilisée pour la photolithographie. En médaillon: La lumière UV illumine le DMD à un angle de 45 °, et 24 ° en dessous du plan du tableau miroir. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Étiqueté la croissance et la prolifération des DRG hydrogel contenant des constructions double. JC) les images qui illustrent les constructions polymérisé PEG (gris) avec neurites étiquetés avec Bêta III tubuline (vert), les noyaux de cellules DAPI colorés (bleu). Les explants DRG sont contenues dans Puramatrix et situés dans les régions circulaire du modèle, avec des neurites croissante vers la bifurcation (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Construit hydrogel contenant Double cellules marquées à la calcéine AM, un marqueur de cellules vivantes, après 48 heures dans un milieu de croissance. JC) PEG formes variées, remplies de Puramatrix contenant dissocié neurones DRG (~ 5x10 3 cellules / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Hydrogel simple construction contenant des cellules vivantes étiquetés avec calcéine AM (vert) et les cellules mortes étiquetés d&#39;éthidium homodimère-1 (rouge) après 24 heures dans un milieu de croissance (5x10 3 cellules / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figure 5" /> PEG cellulaire Figure 5. Restrictives polymérisé comme un film mince en utilisant un &quot;modèle de test« de façon sélective adhèrent cellules dissociées à la membrane de collagène revêtement de supports perméables. A, B) Les cellules vivantes sont marquées après 48 heures avec AM calcéine (vert), tandis que les cellules mortes sont étiquetés avec éthidium homodimère-1 (rouge). Adhésion cellulaire minimale se produit dans la zone contenant le film PEG mince. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Images représentant des résultats indésirables. A) polymérisation partielle du PEG, conduisant à une PEG inutilisable construire. Polymérisation incorrecte peut se produire en raison de la présence d&#39;un ménisque dans le milieu pré-polymère, des quantités insuffisantes de milieu de polymérisation, l&#39;exposition aux UV insuffisante ou inadéquate attention de l&#39;optique. B) l&#39;image dépeignant polymérisé construit PEG (gris) avec neurites étiquetés avec Bêta III tubuline (vert), les noyaux de cellules DAPI colorés (bleu). Les neurites ont pu croître en dehors des canaux PEG motifs. Cela se produit souvent dans la condition qui déborde Puramatrix sur le dessus de la partie PEG pendant l&#39;injection.

<ol>
	<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li><li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+three+dimensions:+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine.">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li><li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses.">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li><li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+neural+constructs:+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation.">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li><li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties.">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures.">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li><li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties.">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li><li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li><li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration.">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li><li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel.">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li><li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds.">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li><li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture.">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li><li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method.">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li><li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels.">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li><li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tectonics:+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems.">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li><li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex,+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds.">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li><li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays.">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li></ol>

Le procédé décrit ici pourrait être utilisée par tout enquêteur cherchant simple et reproductible des systèmes de culture cellulaire. Théoriquement, en raison de la grande variété d&#39;hydrogels photopolymérisables disponibles, l&#39;environnement pourrait être adapté pour permettre une utilisation avec n&#39;importe quel type cellulaire, y compris les explants de tissu ensemble. De plus, le système dual d&#39;hydrogel permet de contrôler spatiale améliorée dans la présentation de l&#39;auto-polymérisant hydrogels, qui ont tendance à former des formes amorphes sur leurs propres. Le résultat &quot;2.5D&quot; construit hydrogel micropatterned fournir une matrice 3D de croissance neuronal présenté dans une configuration 2D qui permet facilement l&#39;évaluation microscopique. Le substrat sur lequel les gels sont polymérisés peuvent également être variés, permettant un meilleur contrôle de la conception expérimentale. Nos méthodes sont optimisées pour une utilisation avec des supports de cellules perméables culture, comme nous avons vu la viabilité améliorée (figure 4) par rapport à la polymérisation sur des lames de verre (données non présentées). Toutefois, les surfaces de polymérisation d&#39;autres peuvent être plus applicable pour différentes applications: fabrication sur lames de verre utilisées dans les expériences de la microfluidique ou formations agrégat de cellules, par exemple. Notre expérience avec ces systèmes de culture a conduit à l&#39;identification des domaines potentiels de la difficulté. Tout d&#39;abord, les techniques de soin sont nécessaires pour maintenir la stérilité des constructions. En raison de la nature encombrante de la configuration de la DMD, il est difficile d&#39;opérer étapes de polymérisation dans des conditions stériles. Pour lutter contre ce problème, l&#39;étape de rinçage décrit dans les méthodes sont utiles, et les antibiotiques doivent être utilisés dans tous les médias. De plus, l&#39;épaisseur et la forme finales de la construction polymérisé est fortement dépendante du comportement des fluides du mélange de pré-polymère, et la présence d&#39;un ménisque peut se traduire par des constructions de gel qui sont trop minces ou incomplète polymérisé (figure 6). Deux mesures peuvent être prises pour minimiser la formation d&#39;un ménisque intérieur inserts de culture cellulaire. Pour hydrogels épais (&gt; 200 um), une simple couche de Rain-X autour de la paroi intérieure de l&#39;insert est suffisant. Cependant, comme décrit brièvement ci-dessus, pour les constructions minces (&lt;200 um), une couche d&#39;huile est nécessaire pour minimiser à la fois le ménisque et nient trempe oxygène de la polymérisation radicalaire. Résolution a été trouvé à être dépendante de l&#39;épaisseur, avec une diminution de la taille caractéristique réalisé avec des gels plus épais. La résolution a également varié selon que la fonction a représenté un relief positif ou négatif dans l&#39;hydrogel. Toutefois, nous avons obtenu une résolution suffisante pour des constructions avec des tailles de fonction minimale sur l&#39;échelle de ~ 100 um en utilisant des objectifs de microscope seulement comme une optique de focalisation. Nos expériences ont montré que les constructions à double hydrogel décrit ici représentent une excellente base pour la formation de base in-vitro des modèles de croissance des neurites et d&#39;orientation. La technique employée micropatterning est une adaptation des méthodes existantes 18,19, mais notre set-up a souligné un simple à mettre en œuvre la conception et a été optimisé pour la production de constructions hydrogel double sur inserts de culture cellulaire; inserts de culture cellulaire ont été essentiels pour améliorer la viabilité des cellules ainsi que réticulation autour d&#39;explants de tissus préalablement adhérentes. La portée des résultats présentés est limité par les intérêts de notre laboratoire, mais nous croyons que les méthodes décrites dans cette publication sera utile aux chercheurs la recherche d&#39;un relativement bon marché, méthode rapide et facile à utiliser pour la fabrication de culture cellulaire 3D modèles.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

De plus en plus, les environnements à motifs de culture de cellules deviennent une technique pertinente pour étudier les caractéristiques cellulaires, et de nombreux chercheurs croient en la nécessité pour les environnements en 3D pour représenter des expériences in vitro qui permettent de mieux imiter les qualités de vivo 1-3. Des études dans des domaines tels que le cancer de recherche 4, 5 neurones d&#39;ingénierie, physiologie cardiaque 6, et interactions cellule-matrice 7,8 ont montré le comportement des cellules diffère considérablement entre les cultures traditionnelles et les constructions monocouche 3D. Les hydrogels sont utilisés comme des environnements 3D en raison de leur variété, la polyvalence et la capacité à adapter la composition moléculaire grâce à la fonctionnalisation 9-12. De nombreuses techniques existent pour la création de constructions que des cellules de soutien des matrices, y compris électrofilage 13, timbres élastomère 14, impression jet d&#39;encre 15, 16 photopatterning additif, photomasque statiques de projection-lithographie 17, et microstéréolithographie masque dynamique 18. Malheureusement, ces méthodes impliquent de multiples étapes de production et / ou équipements ne sont pas facilement adaptables à la cellule conventionnelle et méthodes de culture tissulaire. La technique employée dans ce protocole s&#39;adapte aux deux dernières méthodes, en utilisant un dispositif de micromiroirs numériques (DMD) pour créer des masques dynamiques de réticulation géométriquement spécifiques poly-(éthylène glycol) (PEG) hydrogels, induite par UV polymérisation initiée par les radicaux libres. Le résultat &quot;2.5D&quot; structures offrent un environnement contraint 3D pour la croissance neuronale. Nous employons une approche bi-hydrogel, où PEG sert une structure cellulaire région restrictive fourniture d&#39;une autre cellule, mais informes permissive d&#39;auto-assemblage de gel fait à partir de Puramatrix ou d&#39;agarose. Le processus est un moyen rapide simple d&#39;une fabrication étape qui est hautement reproductible et facilement adaptable pour une utilisation avec les méthodes classiques de culture cellulaire et des substrats. Explants de tissus entiers, tels que ganglions de la racine dorsale embryonnaire (DRG), peuvent être incorporés dans les constructions d&#39;hydrogel double pour les essais expérimentaux tels que la croissance des neurites. En outre, les cellules dissociées peuvent être encapsulés dans l&#39;hydrogel photoréticulables ou auto polymérisant, ou de manière sélective collé à la membrane cellulaire support perméable à l&#39;aide restrictive photopatterning. Utilisation de la DMD, nous avons créé des constructions hydrogel jusqu&#39;à ~ 1 mm d&#39;épaisseur, mais en couches minces (&lt;200 um) des structures de PEG ont été limités par la trempe d&#39;oxygène de la réaction de polymérisation radicalaire. Nous avons ensuite développé une technique utilisant une couche d&#39;huile au dessus du liquide de polymérisation qui a permis à la structure fine de polymérisation PEG. Dans ce protocole, nous décrivons la création rapide de systèmes d&#39;hydrogel 3D pour la production de cellules neurales microfabriqué et cultures de tissus. Les constructions d&#39;hydrogel double démontré ici représentent polyvalent des modèles in vitro qui peuvent s&#39;avérer utiles pour les études en neurosciences impliquant la survie cellulaire, la migration et / ou la croissance des neurites et d&#39;orientation. Par ailleurs, comme le protocole peut travailler pour de nombreux types d&#39;hydrogels et les cellules, les applications potentielles sont à la fois varié et vaste.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography at JoVE.com

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Des techniques simples sont décrites pour la production rapide de systèmes de culture microfabriqué neurones en utilisant un dispositif micromiroirs numériques pour la lithographie masque de projection dynamique sur réguliers des substrats de culture cellulaire. Ces systèmes de culture peut être plus représentatif de l&#39;architecture biologique naturel, et les techniques décrites peuvent être adaptées pour de nombreuses applications.

Fabrication d&#39;hydrogels pour les systèmes de culture Micropatterned neuronaux utilisant la photolithographie dynamique projection de masque

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.6K vues.  Tulane University. Des techniques simples sont décrites pour la production rapide de systèmes de culture microfabriqué neurones en utilisant un dispositif micromiroirs numériques pour la lithographie masque de projection dynamique sur réguliers des substrats de culture cellulaire. Ces systèmes de culture peut être plus représentatif de l'architecture biologique naturel, et les techniques décrites peuvent être adaptées pour de nombreuses applications.

Vidéo: Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Recherche

Bio-ingénierie

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Les hydrogels d&#39;alginate de culture d&#39;organe en trois dimensions des ovaires et des trompes

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabrication et implantation de miniatures à double élément jauges de contrainte pour mesurer<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastro contractions chez les rongeurs.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection génique vers les cellules Spheroid sur microélectrodes plaques de culture destinés à la transplantation de cellules génétiquement modifiées

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymère Microneedle tableau Fabrication par photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidique génipine dépôt Technique de la culture avancée de microélectrodes vasculaires musculaires Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...