Ce travail a été soutenu par la Fondation Coulter, Beyster Fondation, l&#39;opportunité recherche de premier cycle (PIRPC) programme d&#39;été pour ATA et la National Science Foundation des étudiants diplômés de la bourse de recherche (subvention no 0718128 DGE; Identification:. 2010101926) pour JBW.

1. Caractérisation Phase System: seuils déterminant pour la séparation de phase <ol><li> Préparer des solutions contenant du PEG et DEX dans le tampon désiré ou milieu de culture cellulaire comme le montre la figure 1 (points violets) dans 15 ml ou 50 ml tubes coniques. Ci-après, le PEG et DEX se référeront à 35 kDa PEG et 500 kDa DEX; cependant, les concentrations critiques vont changer en fonction des deux polymères utilisés. Noter la masse de PEG et de DEX dans chaque solution. Forte concentration des solutions de polymères peut prendre plusieurs heures à se dissoudre. Vortex peuvent être utilisées pour des solutions sans sérum. Pour les médias contenant des protéines ou du sérum, placer les tubes sur une scène à bascule jusqu&#39;à ce que les deux polymères sont complètement dissous. Noter le poids des médias utilisés pour dissoudre les polymères et prendre note des concentrations initiales. </li><li> Une fois que les polymères sont complètement dissous, les solutions doivent apparaître nuageux. C&#39;est la première indication que la séparation de phase a eu lieu. Pour confirmer cela, permettre à l&#39;des solutions de polymère au repos dans une position verticale à la température ambiante pendant 20 min. Centrifugation à 1000 xg peut être utilisé pour accélérer le processus de séparation de phase. La phase inférieure dense sera DEX-riche et la phase supérieure sera PEG-riche. </li><li> Ajouter lentement tampon supplémentaire ou un support pour les tubes. Petits incréments doivent être utilisés de manière à ne pas dépasser le point de séparation des phases. </li><li> Lorsque la solution devient limpide et non plus en phase sépare après centrifugation, le seuil de séparation de phase a été atteint. Enregistrer le poids final du tube. </li><li> En utilisant les pondérations précédentes enregistrées dans les polymères, en même temps que le poids final après ajout de médias, déterminer le% en poids / poids de chacun des deux polymères au cours de laquelle la séparation de phase ne se produit plus. </li><li> Tracer ces valeurs en% en poids / poids de PEG sur l&#39;axe des y et% en poids / poids DEX sur l&#39;axe des abscisses. Cette courbe, appelée courbe binodale, peut être utilisé pour déterminer la concentration de seuil de séparation de phase pour différentes concentrations dModules de PEG / DEX dans un milieu de culture cellulaire spécifique. </li></ol> 2. Configuration 1: Modélisation Exclusion (96 puits Format de plaque) <ol><li> Préparer des solutions séparées de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire. Utiliser des solutions de l&#39;ATPS au moins deux fois le point critique pour s&#39;assurer que l&#39;ATPS reste après que les polymères s&#39;équilibrer par rapport à l&#39;autre. Il ya une petite quantité de flux de DEX dans la phase riche en PEG et vice-versa, par conséquent, travailler trop près de la concentration critique peut entraîner la perte du système de phase en baisse des concentrations inférieures à point critique. De même, le transfert de la boîte de culture cellulaire à un incubateur à humidité et à température contrôlée peut modifier les propriétés de deux phases et de faire les deux solutions miscibles. Note: Certaines cellules peuvent être plus efficaces avec les formulations de l&#39;ATPS autres. Formulations acceptables peuvent être choisis en fonction des courbes binodale déterminées à partir de la partie 1. </li><li> Récolter les cellules à utiliser pour l&#39;exclusion patterning. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles. En option: marquer les cellules avec CellTracker ou d&#39;autres non-cytotoxiques étiquettes pour la microscopie de fluorescence. </li><li> Sédimenter les cellules et resuspendre le culot dans un volume approprié de 5,0% PEG pour atteindre le nombre désiré de cellules d&#39;exclusion. Par exemple, un puits d&#39;une plaque de 96 puits nécessite 37.500 cellules de fibroblastes d&#39;être remis en suspension dans 200 ul de PEG pour produire confluence le jour suivant. L&#39;échelle de ces chiffres en fonction de d&#39;autres types cellulaires et tailles substrat de culture. </li><li> Utiliser une micropipette, distribuer 0,5 pi de gouttelettes DEX sur un substrat de culture cellulaire sec. Gouttelettes plus grand volume de production plus grandes zones d&#39;exclusion. Gouttelettes dont la taille varie de 0,1 à 1 ul sont recommandés pour micromodelage exclusion. En option: DEX gouttelettes peuvent être déposées 24 heures à l&#39;avance et laisse se déshydrater à la température ambiante. Cela peut produire des modèles plus propres. </li><li> Distribuer 200 l de suspension cellulaire PEG dans til en bonne santé pour couvrir les gouttelettes DEX. </li><li> Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Assurez-vous que le plat n&#39;est pas incliné lors de la manipulation et qu&#39;il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes. </li><li> Retirer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 ul de milieu de culture. </li><li> Ajouter milieu de culture frais et revenir à l&#39;incubateur. </li><li> Surveiller les cultures périodiquement pour observer le mouvement des cellules dans la zone d&#39;exclusion. </li></ol> 3. Configuration 2: Modélisation Island (Format de plaque de 96 puits) <ol><li> Préparer des solutions de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire, comme ci-dessus. </li><li> Récolter les cellules à utiliser pour des motifs île. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles. </li><li> Granulés et remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de 12,8% DEX pour obtenir la concentration désirée de cellules pour la modélisation île. Les concentrations de 5000 CElls / ul ou moins sont recommandées pour les types de cellules fortement adhérentes. Pour les cellules qui ont de la difficulté de fixer ou de cellules qui adhèrent faiblement, les concentrations de jusqu&#39;à 10.000 cellules / ul peut être envisagée. </li><li> En travaillant rapidement pour éviter le dessèchement, Pipeter 0,5 pi de gouttelettes DEX sur un substrat de culture cellulaire sec, tel que décrit ci-dessus. Ne pas laisser sécher les gouttelettes. En option: 200 pi de solution de PEG peut être ajouté à la bien à l&#39;avance. DEX gouttelettes peuvent alors être déposés dans la solution de PEG où ils se déposent au fond et contact avec la surface de culture. Cela peut produire des modèles plus propres îles. </li><li> Couvrir les gouttelettes DEX avec 200 ul de PEG. </li><li> Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Assurez-vous que le plat n&#39;est pas incliné lors de la manipulation et qu&#39;il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes. </li><li> Retirer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 ul de milieu de culture. </li><li> Ajouter culture fraîchemoyen et retour à l&#39;incubateur. </li><li> Surveiller les cultures périodiquement pour observer le mouvement vers l&#39;extérieur des cellules et la prolifération des îles. </li></ol> 4. Configuration 3: Exclusion des co-cultures (format plaque de 96 puits) <ol><li> Préparer des solutions de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire, comme ci-dessus. </li><li> Récolter les cellules à utiliser pour l&#39;exclusion et de motifs île. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles pour chaque type de cellule. En option: Certaines paires de cellules peuvent afficher des indices de prolifération radicalement différents. Pour éviter que les cellules exclus de la surpopulation des cellules insulaires configuration (en particulier pour les cultures à long terme), le traitement des cellules utilisées pour l&#39;exclusion de la mitomycine C pendant 2 heures ou les irradier avant la récolte. Cela permettra d&#39;éviter la prolifération. Colorants fluorescents CellTracker peut être utilisé pour distinguer les deux populations de cellules si nécessaire. </li><li> Sédimenter les cellules et remettre en suspension le culot de exclusion de motifs dans un volume approprié de PEG 5,0% pour atteindre le nombre désiré de cellules, comme ci-dessus. Reprendre le culot pour la modélisation île dans un volume approprié de 12,8% DEX pour obtenir la concentration désirée de cellules, comme ci-dessus. </li><li> Utiliser une micropipette, distribuer 0,5 gouttelettes ul de suspension cellulaire DEX sur un substrat de culture cellulaire sec. Ne pas laisser sécher les gouttelettes. </li><li> Couvrir les gouttelettes DEX avec 200 pi de suspension cellulaire PEG. </li><li> Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Assurez-vous que le plat n&#39;est pas incliné lors de la manipulation et qu&#39;il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes. </li><li> Retirer la solution de PEG et laver trois fois dans 200 pi de milieu de culture. </li><li> Ajouter milieu de culture frais et revenir à l&#39;incubateur. </li><li> Surveiller les co-cultures d&#39;observer l&#39;interaction entre les populations de cellules. En option: Les contrôles peuvent être préparés en effectuant l&#39;exclusion ou de la modélisation île individually, par co-culture des cellules qui n&#39;interagissent pas ou en bloquant les voies d&#39;intérêt dans une ou les deux populations de cellules avant ou après formation de motif. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

La méthode de l&#39;ATPS micromodelage cellule nécessite une expertise très peu au-delà de la maîtrise des techniques de culture cellulaire et peut être rapidement maîtrisé. Les avantages de cette approche est qu&#39;elle est peu coûteuse, rapide et compatible avec une variété de types de cellules et les formats de la culture. Pour ces raisons, notre protocole devrait être facilement adoptée par les sciences de la vie, en particulier ceux qui étudient la prolifération cellulaire, la migration et la chimio...

Aqueuses systèmes à deux phases (ATPSs) se forment lorsque des solutions de deux polymères incompatibles sont mélangés à des concentrations suffisamment élevées. Séparation de phase est influencée par divers facteurs, dont la masse moléculaire et la polarité des polymères, la température de la solution, le pH et la composition ionique de la solution aqueuse de solvant 1, 2. Le point où les deux solutions de polymère séparés est déterminée par les propriétés physico-chimiques du système de phase choisi, mais se produit généralement à des concentrations faibles de polymère (moins de 20% en poids / poids) sous des conditions non dénaturantes, permettant ATPSs à être utilisé pour la biotechnologie applications 3-9. De loin, l&#39;ATPS plus étudiés est le polyéthylène glycol (PEG) / dextran (DEX) du système. Les ATPS formés par ces polymères biocompatibles et peu coûteux a été décrit pour la purification de biomolécules au moyen de partitionnement moléculaire 2, 10. Partitionnementse produit lorsque les molécules ou particules supplémentaires qui ne contribuent pas au système de phase sont mélangés avec du PEG et DEX. Sur la base de leurs affinités relatives pour chaque DEX ou PEG, les molécules ou particules seront de préférence résider dans une des deux phases ou à l&#39;interface. Une autre propriété de l&#39;ATPS PEG / DEX est l&#39;existence de la tension interfaciale entre les phases polymères deux. ATPSs formés par PEG et DEX affichent généralement des tensions interfaciales qui sont beaucoup plus bas que les autres liquide-liquide à deux phases des systèmes tels que le pétrole et l&#39;eau, mais les forces de tension interfaciale encore exercer des effets sur de petites particules telles que les virus, les cellules et les agrégats de protéines 2 , 11-13. Enfin, depuis le plus haut poids moléculaire du PEG et DEX séparé à de faibles concentrations (moins de 5% en poids / poids de polymères de haut poids moléculaire variétés) en présence de concentrations physiologiques de sels, il ya peu ou pas d&#39;effets délétères sur les cellules de mammifères incorporé au sein de ces systèmes14-16. Récemment, les propriétés interfaciales et des effets de partitionnement de ATPSs ont été appliquées par notre laboratoire pour 14 patron de cellules, 16-20. Cela a été accompli par micromodelage une solution plus dense DEX sur des substrats de culture cellulaire en présence de PEG. Lorsque les cellules sont incorporées dans la phase PEG, ils sont exclus de pénétrer dans les gouttelettes de DEX en raison de PEG / DEX tension interfaciale 20. Lorsque les cellules sont en motif dans la phase DEX, ils sont conservés à la surface du substrat de culture cellulaire par tension interfaciale et de cloisonnement 16, 17, 19. Contrairement à d&#39;autres méthodes pour la modélisation cellulaire, patron de cellules ATPS est facile à apprendre et ne nécessite que des connaissances rudimentaires sur les polymères eux-mêmes, et la possibilité d&#39;effectuer une culture cellulaire et d&#39;utiliser une micropipette. D&#39;autres méthodes pour la modélisation cellulaire impliquent souvent un équipement spécialisé et de formation qui ne sont pas facilement convertis en ee sciences de la vie. Par exemple, certaines méthodes (microcontact impression ou impression jet d&#39;encre), les cellules motif indirectement par l&#39;application de modèles de biomolécules d&#39;adhésion cellulaire à un substrat de culture que par la suite servir de sites de fixation 21 cellules, 22. Bien que les approches indirectes sont utiles pour certains types de cellules, elles exigent un haut degré de compétences de l&#39;utilisateur et de l&#39;équipement spécialisé pour la fabrication de l&#39;outil de structuration, et peuvent manquer de spécificité en fonction du type de cellule / biomolécules modèle particulier. Alternativement, les cellules peuvent être déposés auprès de la spécificité modèle haut au moyen d&#39;approches de structuration directs qui comprennent flux laminaire motifs, pochoirs et 23-26 impression jet d&#39;encre. Cependant, ces techniques nécessitent en outre l&#39;expertise des utilisateurs et des équipements spécialisés, et peuvent endommager les cellules au cours du processus d&#39;impression. Bien que ces approches produisent généralement des modèles précis de cellules, de patron de cellules pour être un outil utile dans les sciences du vivant, il doit être rentable unee simple à mettre en œuvre. Nous rapportons ici un protocole détaillé pour la production des cultures de cellules en utilisant les motifs ATPSs décrits dans nos applications précédemment publiées. Utilisation Micropipettes seulement, les utilisateurs peuvent générer des zones d&#39;exclusion de cellules ou des îles de cellules pour des essais de migration. Ce résultat est obtenu au moyen de PEG / DEX tension interfaciale qui conserve soit des cellules dans la phase DEX ou exclut les cellules déposées dans la phase PEG de DEX. En combinant ces deux techniques de dessin fondamentales, il est possible de générer rapidement des co-cultures de cellules comme les fibroblastes de cellules de foie co-cultures. Méthodes de structuration, les paramètres de l&#39;ATPS et les résultats attendus sont décrits en détail.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Fabricant </td></tr><tr><td> Dextran 500.000 kDa </td><td> Pharmacosmos, Danemark </td></tr><tr><td> Polyéthylène Glycol 35.000 kDa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Hela </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> Tracker cellule </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

Technologies patron de cellules qui sont rapides, faciles à utiliser et abordables seront nécessaires pour le développement futur des hauts dosages de cellules débit, plates-formes pour l&#39;étude des interactions cellule-cellule et des systèmes de l&#39;ingénierie tissulaire. Ce protocole détaillé décrit une méthode pour générer des co-cultures de cellules en utilisant des solutions biocompatibles de dextrane (DEX) et de polyéthylène glycol (PEG) que phase séparée lorsqu&#39;ils sont combinés au-dessus des seuils de concentration. Cellules peut être configurée en une variété de configurations en utilisant ce procédé. Un motif d&#39;exclusion de cellules peut être réalisée par des gouttelettes d&#39;impression DEX sur un substrat et à les recouvrir avec une solution de PEG contenant des cellules. La tension interfaciale entre la solution formée polymère provoque deux cellules de tomber à l&#39;extérieur de la gouttelette DEX et former un dégagement circulaire qui peut être utilisé pour les essais de migration. Îlots de cellules peut être modelée par la distribution d&#39;une phase riche en cellules DEX dans une solution de PEG ou en recouvrant le DEXde gouttelettes avec une solution de PEG. Co-cultures peuvent être formées directement par la combinaison d&#39;exclusion de cellules avec DEX île de motifs. Ces méthodes sont compatibles avec une variété d&#39;approches de manipulation des liquides, y compris micropipetage manuel, et peut être utilisé avec n&#39;importe quel type de cellules adhérentes.

Pour sélectionner une combinaison appropriée de PEG et de DEX pour la modélisation cellulaire, il est important de déterminer la courbe binodale. Cette courbe délimite les points au niveau desquels peuvent se former une ATPS et peut varier d&#39;un ensemble donné de polymères sur la base de la température, le pH et la teneur ionique. Pour la culture de cellules qui nécessitent formulations de milieu personnalisés, il peut être nécessaire de déterminer expérimentalement la courbe binodale. Ceci est accompli...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Aqueuses systèmes biphasiques ont été utilisés pour les populations de motif simultanément de multiples cellules. Cette méthode est simple et rapide pour un patron de cellules tire parti de la séparation de phases de solutions aqueuses de glycol de polyéthylène et de dextrane et la tension interfaciale qui existe entre les deux solutions de polymères.

La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

cell-co-culture-patterning-using-aqueous-two-phase-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K vues.  University of Michigan. Aqueuses systèmes biphasiques ont été utilisés pour les populations de motif simultanément de multiples cellules. Cette méthode est simple et rapide pour un patron de cellules tire parti de la séparation de phases de solutions aqueuses de glycol de polyéthylène et de dextrane et la tension interfaciale qui existe entre les deux solutions de polymères.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Recherche

Bio-ingénierie

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Une boîte à outils pour permettre la conversion d&#39;hydrocarbures en milieu aqueux

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Modélisation simple, abordable et modulaire des cellules à l’aide de l’ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Contrôle de l’adhérence des cellules à l’aide de techniques de modelage d’hydrogel pour des applications en microscopie à force de traction

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...