Ce travail a été financé par une subvention des National Institutes of Health (GM070736) à H. Fölsch. SF Ang a été soutenue par un prix A * STAR bourses d&#39;études supérieures, et RS Kang a été soutenue par la base cellulaire et moléculaire du programme de formation des maladies (GM8061)

1. L&#39;isolement de l&#39;ADN plasmidique <ol><li> Utilisez une endotoxine de Sigma-Aldrich kit maxiprep pour préparer l&#39;ADN endotoxines libres selon le protocole du fabricant. Ce kit fonctionne pour nous, car elle élimine de manière fiable toute endotoxines des préparations d&#39;ADN. Endotoxines qui sont injectés avec de l&#39;ADN dans les noyaux des cellules entraîne la mort cellulaire. </li><li> Ajouter 100 ul de phénol / chlorofom / alcool isoamylique (25:24:1) à l&#39;ADN isolé, vortex et spin pendant 1 min à 13000 rpm dans un microcentrifugeuse Eppendorf. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube et ajouter 100 ul de chloroforme / alcool isoamylique (24:1), vortex et spin comme ci-dessus. Transférer la phase aqueuse supérieure contenant l&#39;ADN à un nouveau tube. Cette étape est nécessaire pour éliminer toute protéine de l&#39;ADN, ce qui empêche le colmatage de l&#39;aiguille de microinjection. </li><li> Précipiter l&#39;ADN par addition d&#39;acétate de Na (pH 6,0) à une concentration finale de 300 mm et 2 X vol d&#39;éthanol 100%. Incuber à -20 ° C la nuit. Spin ADN pendant 20 min à 13000 rpm dans un microcentrifugeuse Eppendorf, se laver une fois avec 70% d&#39;éthanol, et remettre en suspension dans 300 ul sans endotoxine de l&#39;eau (Sigma-Aldrich). </li><li> Déterminer la concentration d&#39;ADN. Une concentration de l&#39;ADN typique varie de 1 à 5 ug / ul. </li></ol> 2. Culture de cellules MDCK <ol><li> Fractionner les cellules MDCK. Compter les cellules et les graines de 4 X 10 5 cellules sur des filtres clairs Transwell de 12 mm (0,4 um taille des pores, Corning Costar, 3460). Pour une expérience de contrôle contenant une injection maquette et deux différentes protéines Rab mutant dont vous avez besoin pour ensemencer trois filtres. </li><li> Cellules MDCK culture dans un milieu MEM avec 2 mM de L-glutamine, 0,1 mg / ml de pénicilline / streptomycine et 7% (vol / vol) de sérum bovin foetal (= milieux de croissance MEM) à 37 ° C et CO 2 5%. </li><li> Changement des médias dans la chambre basolatérale chaque jour. Ceci facilite le processus de polarisation, parce qu&#39;elle imite la situation des cellules épithéliales chez l&#39;animal. </li><li> 2 jours après l&#39;ensemencement vérifier dans un microscope si les cellules se multiplient en monocouche fermée. Si vous ne pouvez pas détecter tous les trous dans la monocouche, effectuez votre expérience au jour 3. S&#39;il ya encore des trous, effectuer votre expérience sur 4 jours. </li></ol> 3. Procédure microinjection et post-injection incubations <ol><li> Le jour de l&#39;expérience de préparer 5 ml de milieu MEM de croissance et 50 mM d&#39;HEPES dans un plateau 60 x 15 mm pour chaque filtre et le placer dans un incubateur à 39 ° C. En outre, mis en place un puits d&#39;une plaque 12 puits avec les médias 1 ml de croissance MEM et 50 mM d&#39;HEPES et 0,1 mg / ml de cycloheximide par filtre, et le placer dans un incubateur 31 ° C. </li><li> Allumez votre microscope microinjection et mis son stade chauffé à 39 ° C. Nous utilisons un microscope inversé (Axiovert 200, Carl Zeiss, Inc) avec une scène chauffée, 10X et 32X objectifs, et une FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Enfin, ouvrez le réservoir d&#39;azote qui alimente la table de l&#39;air à l&#39;azote. </li><li> Diluer l&#39;ADN avec de l&#39;eau filtrée (utiliser filtre de 0,2 um) à une concentration finale de 0,2 mg / ml dans un volume total de 10 - 100 pi. Par la suite, le spin de l&#39;ADN dans microcentrifugeuse Eppendorf à 13000 rpm pendant 30 min. Retirer la partie supérieure et le placer dans un nouveau tube. Cette étape assure que lorsque vous chargez votre ADN dilué dans l&#39;aiguille de microinjection vous pouvez exactement la charge &quot;propre&quot; ADN. Votre ADN est maintenant prêt pour la microinjection. </li><li> Préparez vos cellules en prenant la sortie de son premier filtre boîte de culture. Avec une lame chirurgicale (Lame Plume chirurgical, acier inoxydable, n ° 11), découper le filtre du porte-filtre et le placer dans 5 ml, 39 ° C au chaud milieux de croissance MEM et 50 mM HEPES (60 x 15 mm Plaque). Courbez le filtre dans la plaque de culture avec la lame chirurgicale que vous avez utilisé pour le découper. Placez-le sur le filtre tel que le trou de la lame chirurgicale entoure le milieu du filtre. Placez votre plaque de culture sur la scène chauffée du microscope. </li><li> Charge 2-3 ul de votre ADN dilué (dans le cas des plasmides cet encodage VSVGts045-GFP = contrôle d&#39;injection maquette) dans une aiguille de microinjection (Femtotip II, Eppendorf, 930 000 043), tournez le couvercle de protection de l&#39;aiguille et le laisser tomber sur le plancher . Maintenant que l&#39;aiguille est prête à être vissée dans son support. Pour ce faire, appuyez sur la touche menu de votre InjectMan et s&#39;assurer que le robinet est fermé. Vissez l&#39;aiguille dans son support, méfiez-vous de ne pas visser l&#39;aiguille trop serré car cela pourrait conduire à la rupture. Maintenant, appuyez sur la touche menu, l&#39;application P c sera empêcher les médias d&#39;être aspirée dans l&#39;aiguille lors de la procédure microinjeciton. Enfin, appuyez sur le joystick pour effacer homing stockées. </li><li> Pour abaisser l&#39;aiguille sur les cellules, utilisez l&#39;objectif 10X et amener l&#39;aiguille dans le faisceau de lumière au-dessus du liquide. Maintenant se concentrer sur les cellules, mettre l&#39;accent à nouveau en tournant la molette de mise en place de 180 °, et de trouver l&#39;aiguille. Par la suite, se déplacer lentement l&#39;aiguille dans le foyer, puis sortir de concentrer à nouveau (travailler à amener les cellules en se concentrer à nouveau), ramener l&#39;aiguille dans desUC à nouveau. Répétez jusqu&#39;à ce que l&#39;aiguille touche la surface du support, à quel point tout ce que vous allez voir est un halo. Lorsque vous atteignez un point où les cellules sont en discussion, mais l&#39;aiguille est encore floue (c&#39;est à dire hors du plan focal) modification de l&#39;objectif 32X et fine des paramètres grossiers. </li><li> Régler la limite de z-en touchant la membrane apicale avec la pointe de l&#39;aiguille et en soustrayant environ 10 um que les noyaux sont la pose d&#39;environ 10 um sous la membrane apicale. </li><li> Après avoir défini le z-limite, trouver la pression d&#39;injection de droite. Départ à 95 PSI. Si la pression est trop élevé, vos cellules vont exploser. Si votre tension est trop basse, vous verrez un point blanc qui reste, mais rien ne se passe. Avec une injection réussie, vous verrez un changement de phase sans changer la taille des cellules. Pour l&#39;injection, amener l&#39;aiguille de quelques microns de la plan focal aussi vite que possible. Visez avec l&#39;aiguille au-dessus du noyau (ie au milieu d&#39;une cellule individuelle) et appuyez sur le bouton d&#39;injection de votre joystick, mais ne pas maintenir le bouton enfoncé. </li><li> Injecter 100 à 500 cellules dans le trou de votre lame chirurgicale qui se trouve sur vos cellules. Lorsque vous avez terminé, placez vos cellules avec la boîte de culture et d&#39;une lame chirurgicale dans un incubateur à 39 ° C, et incuber pendant 2 h. Pendant ce temps, VSVGts045-GFP est exprimée et sécrétée dans le RE. Cependant, à 39 ° C, VSVGts045-GFP ne peut pas se replier correctement et donc ne peuvent pas quitter la salle d&#39;urgence. En attendant, la petite GTPase d&#39;intérêt va s&#39;accumuler dans le cytosol des expériences de co-injection. </li><li> Après 2 h, placez vos cellules dans 1 ml de croissance des médias MEM et 50 mM d&#39;HEPES et 0,1 mg / ml de cycloheximide dans une plaque de 12 puits et incuber pendant 2 h à 31 ° C. Durant cette période, chasse, VSVGts045-GFP se replier correctement, laisser la salle d&#39;urgence et est livré à la surface cellulaire. </li><li> Répétez les étapes 03.01 à 03.10 pour les filtres à deux (injecter des plasmides codant pour la GFP et VSVGts045-par exemple-V5 taggés Rab13T22N) et trois (injecter des plasmides codant VSVGts045-GFP et par exemple V5-taggés Rab13Q67L). Chaque injection durera environ 20 - 60 min. Cependant, il est absolument crucial pour traiter tous les filtres de la même façon tout au long du incubations changement de température et une coloration de surface jusqu&#39;à ce que vous fixer les cellules. Après fixation, vous pouvez effectuer le reste de votre protocole de coloration pour tous les filtres dans le même temps. </li></ol> 4. Coloration de surface pour analyse par immunofluorescence Remarque, afin d&#39;éviter le blanchiment du signal GFP de VSVGts045-GFP, protéger les spécimens de la lumière en couvrant avec du papier d&#39;aluminium pendant toutes les procédures ultérieures. <ol><li> Si vous souhaitez effectuer une coloration de surface, placez vos cellules dans une boîte de culture sur une plaque de métal sur la glace et lave-toi les cellules 1X avec PBS glacé 2 + (PBS [0,2 g / litre de KCl, 0,2 g / litre de KH 2 PO 4, 8 g / litre de NaCl et 2,17 g / litre de Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] et 0,1 g / litre de CaCl 2 et 0,1 g / litre de MgCl 2 x 6 H 2 O). Par la suite, placer 30 pl d&#39;un anticorps qui reconnaît l&#39;ectodomaine de vos protéines, dans ce cas, l&#39;anticorps monoclonal de souris TK1 (IgG 1, obtenu à partir de la fin des années Kreis Thomas), sur du parafilm nettoyage placé sur la plaque de métal sur la glace. Placez le filtre avec vos cellules à l&#39;envers sur la goutte et ajouter quelques gouttes d&#39;anticorps sur la face arrière du filtre. Incuber pendant 1 h sur la glace. </li><li> Cellules de lieu dans une plaque de 12 puits, laver 3x avec PBS glacé 2 + (ou RT chaude PBS 2 + sans coloration de surface avant), et fixer avec du paraformaldéhyde 3% pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules une fois avec du PBS 2 + et de laisser en PBS 2 + pendant 5 min. </li><li> Incuber les cellules dans un tampon bloquant perméabilisation / (BPB) (2% [poids / vol] BSA, 0,4% [p / v] saponine dans le PBS 2 +) avec 10% [vol / vol] du sérum de chèvre. Incuber 1 h à température ambiante. </li><li> Diluer anticorps primaires pour détecter la GTPase Rab exprimé, dans cet exemple anti-V5 (monoclonal de souris d&#39;anticorps IgG 2a, Invitrogen), 1:200 dans BPB. Spin anticorps dilué dans une microcentrifugeuse Eppendorf pendant 10 min à 13000 rpm. Placer 30 ul de la solution d&#39;anticorps sur du parafilm propres placés dans une chambre humide. Placez les cellules sur le filtre à l&#39;envers sur la baisse des anticorps et incuber pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Remettre les cellules (côté droit) dans une plaque de 12 puits et laver 5 fois en 30 min avec BPB à la température ambiante. </li><li> Diluer appropriée anticorps secondaire, dans ce cas, de chèvre anti-souris IgG 1 Alexa 594-étiquetées (pour VSVG détection sur la surface, Invitrogen), et Cy5-anticorps secondaires marqués à reconnaître vos GTPase Rab, dans cette chèvre par exemple IgG anti-souris 2a Cy5-étiquetées (Jackson ImmunoResearch), 1:200 dans BPB et de spin comme ci-dessus. Placer 30 ul de solution d&#39;anticorps sur des parafilm propre dans une chambre humide et les cellules de lieu à l&#39;envers du filtre vers le bas sur la baisse des anticorps. Incuber 1 h à température ambiante. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.6. </li><li> Tremper les cellules sur le filtre en 3X eau déminéralisée et le lieu rSide Up ight sur microslides. Ajouter 10-15 ul montage (10% [poids / vol] DABCO, 50% [poids / volume] du glycérol dans l&#39;eau distillée) sur le dessus des cellules. Placez 18X18 mm couvercle en verre micro sur le dessus et en utilisant des tissus du visage appuyez doucement sur le couvercle en verre sur le micro-cellules. Sceller avec du vernis à ongles. </li><li> Analyser les échantillons avec un microscope confocal. Nous avons utilisé un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss, Inc qui a été équipé d&#39;une lentille à immersion d&#39;eau 63X. </li><li> Pour la préparation des figures, ajuster et de combiner des images en utilisant des programmes comme Adobe Photoshop et Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Pour des exemples sur la façon dont la co-expression des petites GTPases interfère avec le tri VSVG veuillez vous reporter aux articles publiés soit pour missorting apicale 3, 4 ou l&#39;inhibition de 7 de livraison de surface. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Dans l&#39;injection maquette, c&#39;est à dire une injection de seulement le plasmide codant pour la GFP-VSVGts045, la protéine est livré à la surface basolatérale de bien-polarisée des cellules MDCK en juger par la coloration de surface (en rouge, la figure 1 A). Notez que tous les VSVGts045-GFP est livré à la membrane basolatérale pendant la poursuite à 31 ° C comme en témoigne le signal intracellulaire vaste pour les protéines totales (en vert, les figures 1 A et B). Dans les cellules qui ne sont pas bien polarisée VSVGts045-GFP sera livré aussi à la membrane apicale (figure 1 B). Si vos échantillons de contrôle ressemble à la cellule de la figure 1 B, vous ne pouvez pas faire confiance à vos données et à répéter l&#39;expérience avec une meilleure polarisation des cellules. Barres d&#39;échelle sont de 5 um.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Les étapes les plus critiques pour une expérience réussie de microinjection sont la qualité et la pureté de l&#39;ADN et la polarité de vos cellules. Sans cellules polarisées, votre commande d&#39;injection aura déjà mistargeted VSVG et l&#39;expérience ne peut pas être utilisé. Si l&#39;ADN est de mauvaise qualité, l&#39;ADN peut obstruer l&#39;aiguille d&#39;injection entraînant peu ou pas d&#39;expression de la protéine désirée du tout. Aussi, il est conseillé d&#39;utiliser des plasmides d&#39;expr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscope à platine chauffante </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Afin personnalisé </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet micromanipulateur </td><td> Eppendorf </td><td> Afin personnalisé </td></tr><tr><td> Femtotips II (aiguilles microinjection) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader astuces </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Clair 12 mm transwell filtre prend en charge </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxines-libres Bluetooth plasmide maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Les cellules épithéliales polarisent leur membrane plasmatique dans biochimiquement et fonctionnellement distinctes domaines apical et basolatéral où le domaine apical face à la «libre» des surfaces et la membrane basolatérale est en contact avec le substrat et les cellules voisines. Les deux domaines membranaires sont séparés par des jonctions serrées, qui forment une barrière de diffusion. Apicale-basolatérale polarisation peut être récapitulé avec succès dans la culture lorsque les cellules épithéliales rénales canines telles que Madin-Darby (MDCK) sont ensemencées à haute densité sur des filtres de polycarbonate et cultivées pendant plusieurs jours 1 2. Création et maintien de la polarité cellulaire est régulée par un ensemble de petites GTPases de la superfamille Ras, comme RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 et Rab13 3 4 5 6 7. Comme tous ces protéines GTPases cycle entre une inactifs PIB lié état et un actif lié au GTP Etat. Des mutations spécifiques dans les régions de fixation du nucléotide interférer avec ce vélo 8. Par exemple, Rab13T22N est définitivement verrouillée dans le PIB-forme et donc surnommé «dominant négatif», alors que Rab13Q67L ne peut plus hydrolyser le GTP et est donc bloqué dans un état ​​«dominante active» 7. Afin d&#39;analyser leur fonction dans les cellules à la fois dominante et dominante négative allèles active de GTPases sont habituellement exprimés à des niveaux élevés d&#39;interférer avec la fonction des protéines endogènes 9. Une manière élégante d&#39;atteindre des niveaux élevés de la surexpression dans un court laps de temps est d&#39;introduire les plasmides codant pour les protéines pertinentes directement dans les noyaux des cellules polarisées cultivées sur filtre prend en charge en utilisant la technique de microinjection. Ceci est souvent combiné avec la co-injection de plasmides qui codent les récepteurs journaliste de la membrane plasmique qui sont spécifiquement triés sur le domaine apical ou basolatéral. Une cargaison fréquemment utilisés pour analyser les cargaisons de tri pour le domaine basolatéral est un allèle thermosensible de la glycoprotéine du virus de stomatite vésiculaire (VSVGts045) 10. Cette protéine ne peut pas se replier correctement à 39 ° C et sera donc retenue dans le réticulum endoplasmique (RE), alors que la protéine de régulation d&#39;intérêt est assemblé dans le cytosol. Le passage à 31 ° C permettra alors de plier VSVGts045 correctement, laisser la salle d&#39;urgence et de voyage à la membrane plasmique 11. Cette chasse est généralement effectuée en présence de cycloheximide pour empêcher la synthèse des protéines supplémentaires menant à l&#39;assainissement de résultats. Ici nous décrivons en détail la procédure de micro-injection des plasmides dans les cellules polarisées et incubations ultérieures, y compris les changements de température qui permettent une analyse complète des protéines de régulation impliqués dans le tri basolatérale.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Cet article détaille les procédures impliquées dans la surexpression et l&#39;analyse des petites GTPases dans les cellules épithéliales polarisées en utilisant la technique de microinjection.

Analyse de la fonction des petites GTPases par micro-injection de plasmides dans les cellules épithéliales polarisées

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

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11.3K vues.  Northwestern University. Cet article détaille les procédures impliquées dans la surexpression et l'analyse des petites GTPases dans les cellules épithéliales polarisées en utilisant la technique de microinjection.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

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Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.