Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM070736) zu H. Fölsch finanziert. SF Ang wurde von einem A * STAR Graduate Scholarship Award unterstützt, und RS Kang wurde von der Cellular and Molecular Basis of Disease Training Program (GM8061) unterstützt

1. Isolierung von Plasmid-DNA <ol><li> Verwenden Sie einen Sigma-Aldrich Endotoxin-freie Maxiprep Kit Endotoxin freie DNA nach dem Protokoll des Herstellers vorzubereiten. Dieses Kit arbeitet für uns, denn es entfernt zuverlässig alle Endotoxinen aus DNA-Präparationen. Endotoxine, die mit der DNA in den Zellkern gespritzt wird zum Zelltod führen. </li><li> 100 l Phenol / chlorofom / Isoamylalkohol (25:24:1), um die isolierten DNA-, Vortex-und Spin für 1 min bei 13.000 rpm in einer Eppendorf Mikrozentrifuge. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen und 100 ul Chloroform / Isoamylalkohol (24:1), Vortex-und Spin wie oben. Übertragen Sie die obere wässrige Phase mit der DNA in ein neues Röhrchen. Dieser Schritt ist notwendig, um ein Protein aus der DNA, die aus der Mikroinjektion Verstopfen der Nadel verhindert zu entfernen. </li><li> Fällung der DNA durch Zugabe von Na-Acetat (pH 6,0) auf eine Endkonzentration von 300 mm und 2 x Vol. 100% Ethanol. Inkubation bei -20 ° C über Nacht. Spin DNA für 20 min bei 13.000 rpm in einer Eppendorf Mikrozentrifuge, einmal waschen mit 70% Ethanol und resuspendieren in 300 ul Endotoxin-freiem Wasser (Sigma-Aldrich). </li><li> Bestimmen DNA-Konzentration. Ein typisches DNA-Konzentration reicht von 1 bis 5 ug / ul. </li></ol> 2. Kultur von MDCK-Zellen <ol><li> Split MDCK-Zellen. Zählen von Zellen und Saatgut 4 X 10 5 Zellen auf klare 12-mm Transwell-Filter (0,4 um Porengröße, Corning Costar, 3460). Für ein Experiment mit einem Mock-Einspritz-und zwei verschiedene mutierte Rab-Proteine ​​müssen Sie Samen drei Filter. </li><li> Kultur MDCK-Zellen in MEM-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 0,1 mg / ml Penicillin / Streptomycin und 7% (vol / vol) fötales Rinderserum (= MEM Nährmedien) bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Medien in der basolateralen Kammer jeden Tag. Dies hilft bei der Polarisation Prozess, weil es die Situation der Epithelzellen in Tiere nachahmt. </li><li> 2 Tage post-Seeding überprüfen in einem Mikroskop, ob die Zellen werden in einer geschlossenen Monolage wachsen. Wenn Sie nicht erkennen kann keine Löcher in die Monoschicht, führen Sie das Experiment an Tag 3. Wenn es noch Löcher, führen das Experiment an Tag 4. </li></ol> 3. Mikroinjektion Verfahren und Post-Injektion Inkubationen <ol><li> Am Tag der Vorbereitung des Experiments 5 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES in einer 60 x 15 mm-Platte für jeden Filter und in einen 39 ° C Inkubator. Darüber hinaus, bis eine Vertiefung einer 12-well-Platte mit 1 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES und 0,1 mg / ml Cycloheximid pro Filter, und in einen 31 ° C Inkubator gesetzt. </li><li> Schalten Sie Ihren Mikroinjektion Mikroskop und setzen Sie den Heiztisch bis 39 ° C. Wir verwenden ein inverses Mikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) mit einer beheizten Bühne, 10X und 32X Ziele und ein Eppendorf FemtoJet (InjectMan NI2). Schließlich, öffnen Sie das Stickstoff-Gas-Tank, der Luft-Tabelle liefert mit Stickstoff. </li><li> Verdünnen DNA mit gefiltertem Wasser (benutzen 0,2 um-Filter), um eine endgültige Konzentration von 0,2 mg / ml in einem Gesamtvolumen von 10 bis 100 ul. Anschließend Spin DNA in Eppendorf Mikrozentrifuge bei 13.000 rpm für 30 min. Entfernen oberen Teil und in einen neuen Schlauch. Dieser Schritt stellt sicher, dass, wenn Sie Ihre verdünnt DNA Last in die Mikroinjektionsnadel können Sie genau load &quot;clean&quot; DNA. Ihre DNA ist nun bereit für die Mikroinjektion. </li><li> Bereiten Sie Ihre Zellen, indem sie den ersten Filter aus der Kulturschale. Mit einem Skalpell (Feather Surgical Blade, Edelstahl, Nr. 11), den Filter aus dem Filterhalter und Ort geschnitten in 5 ml, 39 ° C warmen MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES (60 x 15 mm-Platte). Beschweren sie die Filter in der Kulturschale mit dem chirurgischen Messer zum Schneiden Sie es aus verwendet werden. Legen Sie es auf dem Filter, so dass die Bohrung des Skalpells der Mitte des Filters umgibt. Zeigen Sie mit der Kultur Platte auf die beheizte des Mikroskops. </li><li> Legen Sie 2-3 ul der verdünnten DNA (in diesem Fall Plasmiden VSVGts045-GFP = mock Injektion control) in eine Mikroinjektionsnadel (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), drehen Sie die Schutzkappe von der Nadel und ließ ihn auf den Boden fallen . Nun die Nadel ist bereit, in die Halterung geschraubt werden. Dazu drücken Sie die Menü-Taste Ihrer InjectMan und vergewissern Sie sich das Ventil abgeschaltet ist. Schrauben Sie die Nadel in die Halterung, Vorsicht, nicht in die Nadel zu fest Schraube, die zum Bruch führen kann. Nun drücken Sie die Menü-Taste erneut, wird die angelegte P c die Medien nicht in die Nadel während der microinjeciton Verfahren gesaugt zu verhindern. Schließlich, tippen Sie auf den Joystick, um gespeicherte Homing löschen. </li><li> Zum Absenken der Nadel auf die Zellen, die 10X-Objektiv und bringen Sie die Nadel in den Lichtstrahl über der Flüssigkeit. Jetzt konzentrieren sich auf die Zellen, bringen den Fokus wieder auf, indem der Fokus Rad um 180 ° auf, und finden Sie die Nadel. Anschließend langsam Nadel in den Fokus, dann bringen unscharf wieder (hinzuarbeiten bringen die Zellen in den Fokus wieder), bringen Nadel in fürKunden wieder. Wiederholen, bis die Nadel berührt die Oberfläche der Medien, an welcher Stelle alles, was Sie sehen, ist ein Heiligenschein. Wenn Sie einen Punkt, an dem die Zellen im Fokus zu erreichen, aber die Nadel ist noch unklar (dh aus der Brennebene) Änderung des 32X objektive und fein grob Einstellungen. </li><li> Stellen Sie die z-Grenze durch Berühren der apikalen Membran mit der Spitze der Nadel und Subtrahieren etwa 10 um die Kerne sind über ca. 10 pm unterhalb der apikalen Membran. </li><li> Nachdem Sie die z-Limit setzen, finden Sie den richtigen Einspritzdruck. Start bei 95 PSI. Wenn der Druck zu hoch ist, werden Ihre Zellen die Luft zu sprengen. Wenn Ihr Druck zu niedrig ist, werden Sie sehen, ein weißer Punkt, dass Aufenthalte, aber sonst nichts passiert. Mit einer erfolgreichen Injektion, sehen Sie einen Phasenwechsel ohne eine Zelle zu ändern. Für die Injektion, bringen Sie die Nadel ein paar Mikrometer aus der Bildebene so schnell wie möglich. Zielen Sie mit der Nadel über dem Zellkern (dh der Mitte einer einzelnen Zelle) und drücken Sie die Injektion Button Ihres Joystick, aber nicht die Taste gedrückt halten. </li><li> Inject 100-500 Zellen in das Loch des Skalpells, die auf Ihrem Zellen liegt. Wenn Sie fertig sind, legen Sie Ihre Zellen mit der Kulturschale und chirurgische Klinge in einem 39 ° C Inkubator, und inkubieren für 2 h. Während dieser Zeit ist VSVGts045-GFP exprimiert und sezerniert in das ER. Doch bei 39 ° C, kann VSVGts045-GFP nicht korrekt zu falten und kann somit nicht aus dem ER. In der Zwischenzeit wird die kleine GTPase von Interesse im Cytosol in Co-Injektion Experimente zu sammeln. </li><li> Nach 2 h, platzieren Sie Ihre Zellen in 1 ml MEM Wachstum Medien plus 50 mM HEPES und 0,1 mg / ml Cycloheximid in einer 12-Well-Platte und Inkubation für 2 h bei 31 ° C. Während dieser Jagd Zeitraum wird VSVGts045-GFP korrekt zu falten, lassen Sie das ER und wird an die Zelloberfläche geliefert. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1 bis 3,10 für Filter zwei (injizieren Plasmiden VSVGts045-GFP und zum Beispiel Rab13T22N V5-Tag) und drei (injizieren Plasmiden VSVGts045-GFP und zum Beispiel Rab13Q67L V5-Tag). Jede Injektion wird etwa 20 nehmen - 60 min. Allerdings ist es absolut entscheidend, um alle Filter die gleiche Weise in der gesamten Temperatur-Shift Inkubationen und Oberflächenbeschmutzung behandeln, bis Sie die Zellen zu fixieren. Nach der Fixierung, können Sie durchführen den Rest Ihres Färbeprotokoll für alle Filter gleichzeitig. </li></ol> 4. Oberflächenbeschmutzung für Immunfluoreszenz-Analyse Beachten Sie, um zu vermeiden, Ausbleichen der GFP-Signal von VSVGts045-GFP, zum Schutz der Proben vor Licht durch Abdecken mit Alufolie bei allen nachfolgenden Verfahren. <ol><li> Wenn Sie Oberflächenbeschmutzung durchführen möchten, platzieren Sie Ihre Zellen in einer Kulturschale auf eine Metallplatte auf dem Eis und waschen Sie Ihre Zellen 1x mit eiskaltem PBS 2 + (PBS [0,2 g / l KCl, 0,2 g / l KH 2 PO 4, 8 g / l NaCl und 2,17 g / l Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O] plus 0,1 g / l CaCl 2 und 0,1 g / l MgCl 2 x 6 H 2 O). Anschließend werden 30 ul eines Antikörpers, der Ektodomäne des Protein erkennt, in diesem Fall die monoklonalen Maus-Antikörper TK1 (IgG 1, erhalten aus dem späten Thomas Kreis), auf saubere Parafilm auf die Metallplatte auf Eis gelegt. Setzen Sie den Filter mit Ihren Zellen kopfüber auf dem Tropfen und ein paar Tropfen von Antikörpern auf die Rückseite des Filters. Inkubation für 1 h auf Eis. </li><li> Legen Sie Zellen in einer 12-Well-Platte 3x mit eiskaltem PBS 2 + (oder RT warmen PBS 2 + ohne vorherige Oberfläche Färbung) und fix mit 3% Paraformaldehyd für 15 min bei RT. </li><li> Wash Zellen einmal mit PBS 2 + und verlassen in PBS 2 + für 5 min. </li><li> Inkubieren Zellen zu blockieren / Permeabilisierung Puffer (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] Saponin in PBS 2 +) mit 10% [v / v] Ziegenserum. Inkubieren 1 h bei RT. </li><li> Verdünnen primären Antikörper gegen das ausgedrückt Rab GTPase erkennen, in diesem Beispiel anti-V5 (monoklonalen Maus-Antikörper IgG 2a, Invitrogen), 1:200 in BPB. Spin verdünnt Antikörper in einer Eppendorf Mikrozentrifuge für 10 min bei 13.000 Umdrehungen pro Minute. Platz 30 ul der Antikörper-Lösung auf saubere Parafilm in eine feuchte Kammer. Legen Sie die Zellen auf Filterpapier kopfüber auf den Antikörper drop und Inkubation für 1 h bei RT. </li><li> Legen Zellen zurück (rechts oben) in einer 12-Well-Platte und waschen mehr als 30 min mit BPB bei RT 5X. </li><li> Verdünnen entsprechenden Sekundärantikörper, in diesem Fall Ziege anti-Maus IgG 1 Alexa 594-markierten (für VSVG Erkennung auf der Oberfläche, Invitrogen) und Cy5-markierten Sekundärantikörper Ihre Rab GTPase zu erkennen, in diesem Beispiel Ziege anti-Maus IgG 2a Cy5-markierten (Jackson ImmunoResearch), 1:200 in BPB und Spin wie oben. Platz 30 ul Antikörper-Lösung auf die saubere Parafilm in einer feuchten Kammer und geben dazu Zellen auf Filter kopfüber auf den Antikörper fallen. Inkubieren 1 h bei RT. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.6. </li><li> Dip-Zellen auf Filterpapier 3X in deionisiertem Wasser und Ort right Seite nach oben auf Mikroobjekttragerglaschen. Add 10-15 ul Halterung (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] Glycerin in destilliertem Wasser) auf der Oberseite der Zellen. Legen 18x18 mm micro Deckglas auf und mit Kosmetiktücher sanft drücken Sie die Mikro-Deckglas auf die Zellen. Seal mit Nagellack. </li><li> Analysieren Proben mit einem konfokalen Mikroskop. Wir verwendeten eine Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., die mit einem 63X Eintauchen in Wasser-Objektiv ausgestattet war. </li><li> Für die Herstellung von Figuren, anpassen und kombinieren Bilder mit Programmen wie Adobe Photoshop und Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Beispiele, wie die Co-Expression von kleinen GTPasen stört VSVG Sortierung verweisen wir auf veröffentlichte Artikel entweder apikale missorting 3, 4 oder Hemmung der Oberfläche Lieferung 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. In dem Modell-Injektion, dh eine Injektion von nur das Plasmid kodiert VSVGts045-GFP, ist das Protein an der basolateralen Oberfläche gut polarisierten MDCK-Zellen geliefert, wie Oberflächen-Färbung (in rot, Abbildung 1 A) beurteilt. Beachten Sie, dass nicht alle der VSVGts045-GFP in der basolateralen Membran wird während der Verfolgungsjagd auf 31 geförderte ° C durch das umfangreiche intrazelluläre Signal für den Gesamt-Protein nachgewiesen (in grün, Abbildungen 1 A und B). In Zellen, die nicht gut polarisiert VSVGts045-GFP wird auch der apikalen Membran (Abbildung 1 B) geliefert werden. Wenn das Steuerelement Exemplare wie die Zelle in Abbildung 1 B anschaut, kann man nicht vertrauen Ihre Daten und haben das Experiment mit einer besseren polarisierten Zellen wiederholen. Scale-Bars sind 5 um.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Mikroinjektion Experiments sind die Qualität und Reinheit der DNA und die Polarität der Zellen. Ohne polarisierten Zellen, wird die Injektion Kontrolle bereits VSVG mistargeted haben und das Experiment kann nicht verwendet werden. Wenn die DNA ist von schlechter Qualität, kann die DNA verstopfen die Injektionsnadel, die zu schlechte oder gar keine Expression des gewünschten Proteins an alle. Auch ist es ratsam, Expressionsplasmide, die bekanntermaßen eine hohe Express...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Mikroskop mit Heiztisch </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Auftragsbezogene </td></tr><tr><td> InjectMan NI2 FemtoJet Mikromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> Auftragsbezogene </td></tr><tr><td> Femtotips II (Mikroinjektion Nadeln) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader Tipps </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Klare 12-mm Transwell-Filter unterstützt </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxin-freie Plasmid Maxiprep kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

Epithelzellen polarisieren ihrer Plasmamembran in biochemisch und funktionell unterschiedliche apikalen und basolateralen Bereichen, in denen die apikale Domäne Gesichter der &quot;freien&quot; Flächen und der basolateralen Membran in Kontakt mit dem Substrat und den benachbarten Zellen. Sowohl Membran-Domänen sind durch Tight Junctions, die eine Diffusionsbarriere Form getrennt. Apical-basolateralen Polarisation kann erfolgreich in Kultur rekapituliert werden, wenn Epithelzellen wie Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen in hoher Dichte auf Polycarbonat-Filtern ausgesät und kultiviert für mehrere Tage 1 2. Aufbau und Pflege von Zellpolarität ist durch eine Reihe von kleinen GTPasen der Ras-Superfamilie wie Rala, Cdc42, Rab8, RAB10 und Rab13 3 4 5 6 7 geregelt. Wie alle GTPasen diese Proteine ​​Zyklus zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen Zustand und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand. Spezifische Mutationen in der Nukleotid-bindenden Regionen stören mit diesem Rad 8. Zum Beispiel ist Rab13T22N dauerhaft in der GDP-Form gesperrt und damit Beinamen &quot;dominant negative&quot;, während Rab13Q67L nicht mehr hydrolysieren können GTP und ist somit in eine &quot;beherrschende active &#39;Zustand 7 gesperrt. Zur Analyse ihrer Funktion in Zellen sowohl dominant negative und dominant aktiven Allele GTPasen sind in der Regel auf einem hohen Niveau zum Ausdruck gebracht, mit der Funktion der körpereigenen Proteinen 9 eingreifen. Eine elegante Methode zur hohen Überexpression in kürzester Zeit zu erreichen, ist die Plasmide der entsprechenden Proteine ​​direkt in den Kernen der polarisierten Zellen auf Filterpapier unterstützt die Verwendung von Mikroinjektionstechnik gewachsen einzuführen. Dies ist oft mit dem Co-Injektion von Reporter-Plasmide, die Plasmamembran-Rezeptoren, die speziell auf die apikalen oder basolateralen Domäne sortiert kodieren kombiniert. Eine Ladung häufig verwendet, um Fracht zu analysieren Sortierung der basolateralen Domäne ist eine temperaturempfindliche Allel des vesikulären Stomatitis Virus Glycoprotein (VSVGts045) 10. Dieses Protein kann nicht richtig falten bei 39 ° C und wird somit in das endoplasmatische Retikulum (ER) zurückgehalten werden, während das regulatorische Protein von Interesse im Cytosol zusammengebaut wird. Eine Verschiebung um 31 ° C lassen sich dann VSVGts045 richtig falten, verlassen das ER und Reisen in die Plasmamembran 11. Diese Jagd ist in der Regel in Gegenwart von Cycloheximid durchgeführt, um weitere Proteinsynthese, was zu saubereren Ergebnisse zu verhindern. Hier haben wir im Detail beschreiben das Verfahren der Mikroinjektion Plasmide in polarisierten Zellen und anschließender Inkubation wie Temperatur verschiebt sich, dass eine umfassende Analyse von regulatorischen Proteinen in basolateralen Sortierung beteiligt zu ermöglichen.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells at JoVE.com

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren in Überexpression und Analyse von kleinen GTPasen in polarisierten Epithelzellen mit Mikroinjektionstechnik beteiligt.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

analyzing-function-small-gtpases-microinjection-plasmids-into

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Aufrufe.  Northwestern University. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren in Überexpression und Analyse von kleinen GTPasen in polarisierten Epithelzellen mit Mikroinjektionstechnik beteiligt.

Serie: Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Forschung

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video