Ce travail a été financé par l&#39;Institut canadien de recherche en santé (IRSC) (RdP-97 774) et en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, subvention n °: 480619). KS est un bénéficiaire d&#39;une bourse de nouveau chercheur KRESCENT (un prix conjoint de la Fondation canadienne du rein, du Canada Société de néphrologie et l&#39;Institut canadien de recherche en santé) et une bourse de nouveau chercheur du ministère ontarien de la recherche et l&#39;innovation. FW est soutenu par une bourse Li Ka Shing.

1. Transformation de E. coli avec le pGEX-RhoA (G17A) Construct <ol><li> Préparer LB-agar en dissolvant 2,5 g et 1,5 LB gélose g dans 100 ml dH 2 O. Autoclave et laisser refroidir à environ 50-55 ° C, ce qui en règle générale, c&#39;est quand le ballon peut être tenu confortablement. </li><li> Préparer l&#39;ampicilline (Amp) de bouillon de par dissolution de 50 mg / ml dans dH 2 O. Seringue filtre et de geler les aliquotes inutilisées. Ajouter 100 ul de stock Amp (concentration finale 50 pg / ml) à la LB-Agar, passant de 1,1. Agiter pour mélanger et verser dans des plats de 10 cm bactériennes (15-20 ml / boîte). Laisser se solidifier (15-30 min.) Et de stocker les plaques inutilisées inversés à 4 ° C pendant 2-3 semaines. </li><li> Pour transformer E. Coli, rapidement dégeler une partie aliquote de cellules compétentes DH5a dans un bain de glace. Ajouter 1 ul de pGEXRhoA (G17A) d&#39;ADN dilué à 25-50 ng / ul. Flick le tube pour mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Le choc thermique à 42 ° C pendant 45 secondes et le lieu de retour sur la glace pendant 2 minutes. Ajouter 900 &amp; mu; L milieu SOC et de grandir pendant une heure à 37 ° C avec agitation. </li><li> Fais 50-100 ul des bactéries transformées sur une plaque LB-Agar-Amp en utilisant un penchant pipette Pasteur stérile. Incuber la plaque latérale droite dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 minutes, puis retourner et se développer du jour au lendemain. </li><li> Un colonie unique sera choisi à partir de la plaque pour la préparation de la protéine TPS-marqué (étape 2.1). Pour une utilisation future, plaques enveloppement et un magasin inversé à 4 ° C pendant environ 3 semaines. En outre, les stocks bactériennes peuvent être préparées pour le stockage de plus longue durée par la croissance des colonies individuelles dans 2 ml de LB-Amp stérile nuit à 37 ° C avec agitation. Mélanger une partie aliquote avec le glycérol 80% stérile dans un rapport de 1:1 et congeler à -80 ° C. </li></ol> 2. Préparation de la TPS-RhoA (G17A) Perles <ol><li> Préparer LB en ajoutant 25 g à 1 LB L dH 2 0 et l&#39;autoclavage. Une fois refroidi, ajouter 50 Amp ul du stock à 50 ml de LB (50 pg / ml de concentration finale). Inoculer avec un col bien isoléony de bactéries transformées et faire croître pendant une nuit à 37 ° C sous agitation. Quand la densité totale (OD 600&gt; 1,0) diluer avec 450 ml de LB-Amp et de croître pendant encore 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Préparer une solution 100 mM stock de isopropylique BD-thiogalactopyranoside (IPTG) en dissolvant 0,238 g dans 10 ml dH O. 2 Magasin en aliquots à -20 ° C. Induire une bactérie pour produire une protéine Rho par adjonction 500 pl 100 mM IPTG à 500 ml de culture (une concentration finale de 100 pM). Réduire la température à 22-24 ° C et se développer pendant des heures de ~ h 16. </li><li> Spin culture à 3600 g pendant 10 minutes à 4 ° C. Si nécessaire, la culture de 500 ml peut être divisé en tubes de 50 ml pour la centrifugation. Gel culot (s) pendant au moins 1 heure (ou, de préférence pendant la nuit) à -80 ° C. </li><li> Préparer 200 ml de tampon de lyse contenant 20 mM d&#39;HEPES (0,95 g) / pH 7,5, 150 mM de NaCl (1,75 g), 5 mM MgCl 2 (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Préparer les solutions mères de 1M TNT (1,542 g dans 10 ml dH O 2) Et 100 mM de PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Pour préparer + tampon de lyse, supplément 10 ml avec 1 mM DTT (10 pl de stock) et 1 mM de PMSF (100 pl de stock) et un comprimé complet inhibiteur de protéase Mini. </li><li> De travail sur la glace, ajouter 10 ml de tampon de lyse + pour les pastilles de l&#39;étape 2.3. Resuspendre soigneusement au vortex douce et de pipetage. Éviter de faire mousser. Soniquer sur la glace pendant 1 minute à la position 4 avec un pouls de 50%. Faites tourner la lysat soniqué à 15.000-20.000 g pendant 15 minutes à 4 ° C, et retirez le sonicat clarifié (surnageant) à un stérile plafonné tube de 15 ml. </li><li> Préparer le glutathion sépharose par mélangeant doucement le tube original contenant une suspension de 75% et 335 ul de transfert dans un tube de 15 ml. Utiliser un embout large alésage à pipeter perles. Ajouter 10 ml PBS froid, et faire tourner 500 g pendant 5 minutes à 4 ° C. Jeter le surnageant, ajouter 1 ml de tampon de lyse + aux perles et de spin que pour le lavage précédent. Jeter le + lyse surnageant et ajouter un tampon pour faire une suspension de 50%. </li><li> Ajouter 250 pi de EQUILibrated suspension bourrelet au surnageant de l&#39;étape 2.5. Tourner à 4 ° C pendant 45 minutes. </li><li> Préparer 500 ml contenant 20 HBS (HEPES 2,38 g) / pH 7,5 et 150 mM de NaCl (4,38 g) dans dH 2 O. Préparer les solutions mères de 1M MgCl 2 (0,952 g dans 10 ml dH O 2) et 1M TNT (1,542 g dans 10 ml dH 2 O). Pour préparer HBS +, 100 ml de compléter juste avant l&#39;utilisation avec 5 mM MgCl 2 (50 pi de stock) et 1 mM (100 pi de stock) TNT. </li><li> Faites tourner les perles de l&#39;étape 2.7 à 500 g pendant 5 minutes à 4 ° C. Jeter des perles surnageant et lavage 2x avec 10 ml de tampon de lyse +, et 2x avec 10 ml HBS +. Après le lavage final, faire une bouillie de 50% par remise en suspension des billes dans HBS + de supplémentés avec BD BaculoGold inhibiteur de la protéase (20 pi de 50x BD BaculoGold / ml). </li><li> Diluer 10 ul de la préparation finale des billes avec un tampon échantillon de Laemmli 2x contenant β-mercaptoéthanol. Assurez-Sérum Albumine Bovine (BSA) des normes. Utiliser un dose de 2 mg / ml de bouillon (0,02 g de BSA dans 10 ml dH 2 O). Mélanger 10 ul de stock avec 10 pi Laemmli (20 pg final); 5 pi de stock avec 5 pi de dH 2 O et 10 pi de Laemmli (10 ug final) et 2,5 stock de pi avec 7,5 ul dH 2 O et 10 pi de Laemmli (5 ug final). Faire bouillir tous les échantillons (5 min). Spin de l&#39;échantillon de perles et de fonctionner avec les normes surnageant BSA et des marqueurs de poids moléculaire sur un 10% SDS-gel de polyacrylamide. </li><li> Préparer le bleu Comassie tache (0,1 g dans 10 ml d&#39;acide acétique, 40 ml de méthanol et 50 ml dH 2 O) et la solution Destain (500 ml dH 2 O, 400 ml de méthanol et 100 ml d&#39;acide acétique). Stocker à température ambiante. Colorer le gel pendant 20-30 minutes, retirer le colorant (il peut être réutilisé plusieurs fois) et rincer avec une solution Destain deux fois. Continuer à décolorer en agitant doucement pendant plusieurs heures jusqu&#39;à ce que les bandes sont clairement visibles. </li><li> Estimer la concentration de la TPS-RhoA (G17A) couplé à des billes en utilisant les normes BSA comme une référence (figure 2). Aliquot un volume égal de billes contenant des protéines ~ pg 10-15 dans des tubes de 1,5 ml à centrifuger micro. Perles Conserver à 4 ° C à utiliser dans une journée. Congeler à -80 ° C dans HBS + / glycérol dans un rapport de 3:1 à utiliser dans quelques jours. </li></ol> 3. FEM test déroulant avec Nucleotide-libres RhoA (G17A) Perles <ol><li> Cultiver les cellules dans des boîtes de 10 cm à la confluence. Sérum priver pendant au moins 3 heures et traiter si nécessaire. </li><li> Préparer un tampon de lyse + comme dans l&#39;étape 2.4. Préparez suffisamment de tampon de lyse pour 700 pl / plat, plus un certain montant supplémentaire pour permettre erreurs de pipetage. Ajouter les inhibiteurs de la protéase, juste avant utilisation. </li><li> De travail sur la glace, enlever milieu de culture de la vaisselle et laver avec de la glace froide HBS. Retirez tout le HBS et ajouter 700 + pl de tampon de lyse à chaque plat. Plaques de remous pour couvrir tous les domaines, gratter et de recueillir dans des tubes numérotés lysats de 1,5 ml. Centrifuger à 15000 g pendant 1 min à 4 ° C. Le surnageant est utilisé pour le dosage. </li><li> Si votre numéro de cellulaire est équivalente dans tous lesplats mis à l&#39;essai, vous pouvez omettre de faire un dosage de protéines, et passer à l&#39;étape 3.5. Sinon mesurer la concentration en protéine de chaque surnageant à l&#39;aide de Bio-Rad protein assay rapide et égaliser le surnageant pour le volume et la concentration. La quantité de protéine totale dépend des types cellulaires utilisés (typiquement de 1 à 1,5 mg de protéine pour LLC-PK1 cellules). </li><li> Retirer 30 pi de chaque surnageant et mélanger avec 30 pl 2x réduire l&#39;échantillon du tampon de Laemmli, portez à ébullition et mettre de côté pour l&#39;étape 3.7. Ajouter surnageants restant à des aliquotes des TPS-RhoA (G17A) perles de l&#39;étape 2.12. Tourner pendant 45 minutes à 4 ° C. </li><li> Spin perles à 6800 g pendant 10 secondes à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver les billes 3x avec un tampon de lyse, la filature de la même manière entre les lavages. Enlever complètement le lavage final à l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 cc munie d&#39;une aiguille 30 G et ajouter 20 ul 2x réduire tampon échantillon de Laemmli. Faire bouillir pendant 5 min. Spin à des billes de granulés et soit exécuter immédiatement le surnageant (préférable) ou enregistrer unt -80 ° C pour une analyse ultérieure. </li><li> Exécuter 20 pi lysats cellulaires totaux et tous les échantillons de protéines précipitées sur le pourcentage de SDS-polyacrylamide gel approprié pour la taille du FEM que vous étudiez. Détecter votre FEM de choix par Western blot en utilisant un anticorps spécifique. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Partie 1 et 2 du protocole décrit la préparation de la TPS-RhoA (G17A) couplé à la GSH-sépharose perles et de son test par SDS-PAGE (voir le plan du protocole sur la figure 1). Un gel coloré au bleu de Coomassie typique est montré sur la figure 2. L&#39;échantillon avec la protéine éluée devrait contenir une seule bande à environ 50 kDa (Fig. 2, piste 6). La concentration de la protéine peut être estimée en utilisant des échantillons de référence de BSA. Dans l&#39;exemple sur la figure 2, la concentration de RhoA (G17A) est estimée à 15 μg/10 ul. Ainsi, des aliquotes de 10 pl / tube ont été préparés. Le rendement typique<html> dans notre main est de 15-20 g de protéine de 10 ml lyse bactérienne. Partie 3 du protocole décrit l&#39;essai de précipitation par affinité (voir vue d&#39;ensemble sur la figure 1). Un test réussi du FEM détecter l&#39;activation du facteur d&#39;échange du FEM-H1 est représenté sur la figure 3. La RhoA (G17A) protéine capturé certains FEM-H1 de la commande (non traitée) lysats cellulaires, suggérant que le FEM-H1 possède une activité basale. Le montant précipité mais augmente dans les cellules traitées avec le Tumor Necrosis Factor-cytokine inflammatoire α (TNF α-), compatibles avec la notion que le TNF-α active FEM-H1 5,7. Surtout, les lysats cellulaires totaux montrent des quantités similaires de FEM-H1 dans le contrôle et l&#39;échantillon traité, ce qui suggère que le traitement n&#39;a pas modifié le FEM-H1 les niveaux et l&#39;entrée utilisée dans le dosage est égale. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble du protocole. ove_content &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> Figure 2. Résultat Représentant du protocole de préparation de perles. Un gel coloré au bleu de Coomassie avec succès la TPS-RhoA (G17A) préparation des billes est montré. Échantillon de billes et les normes de protéines BSA ont été séparées par SDS-PAGE en utilisant un gel d&#39;acrylamide 10%. Pour tester les perles, 10 pi de la suspension finale contenant cordon TPS-RhoA (G17A) est dilué à 1:1 avec la réduction de tampon d&#39;échantillon Laemmli et bouilli pendant 5 minutes. Les perles ont été filés brièvement et le surnageant chargé sur le gel. Les exemples suivants ont été chargés: Piste 1: marqueur de poids moléculaire (MW) (FroggaBio BluEye précolorés échelle des protéines); Lanes 2-4: pg 5, 10 et 20 Bovine Serum Albumin (BSA); piste 5 est vide; Lane 6: 10 ul des fraîchement préparés RhoA (G17A) perles. Après la séparation est terminée, le gel est coloré à l&#39;aide du bleu de Coomassie et par la suite décolorés pour révéler les protéines. Le poids moléculaire de la TPS-RhoA (G17A) protéine est d&#39;environ 50<html> kDa et fonctionne près du niveau du marqueur 48 kDa. La concentration de la protéine GST-Rho dans cet échantillon particulier est estimé à environ 15 μg/10 suspension ul. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> Figure 3. Test Représentant activation du FEM montrant TNF-α induite par l&#39;activation du FEM-H1. Confluent LLC-PK1 cellules ont été traitées avec 10 ng / ml de TNF-α pendant 5 minutes. Après le traitement des cellules ont été lysées et GEFs actifs ont été capturées à l&#39;aide TPS-RhoA (G17A) perles liés. La présence du FEM-H1 dans les protéines précipitées (Blot en haut) et le total des échantillons lysat cellulaire (blot en bas) a été détecté en utilisant Western blot avec un anticorps anti-FEM-H1 (Signalisation cellulaire). S&#39;il vous plaît noter la quantité accrue de précipité FEM-H1 de TNF-α-traités par rapport à cellules non traitées par rapport aux entrées équivalentes, indiquant un résultat positif. 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. Un &quot;mauvais résultat&quot;. Bien que le dosage déroulant FEM quels entraîné dans une FEM-H1 capturé par les billes, les montants précipité à partir de commande et de TNF-α-cellules traitées sont les mêmes. Ainsi le TNF-α, un activateur de savoir de FEM-H1 dans ce cas n&#39;a pas induire l&#39;activation. Dans ce dépannage expérience particulière subséquente a suggéré que le TNF-α utilisé n&#39;était pas assez fraîche et probablement dégradée.

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

La méthode présentée ici est le dosage de l&#39;activation uniquement disponible pour les non-radioactifs GEFs qui peuvent suivre la piscine active de GEF dans les cellules. Le test est similaire à des tests de précipitation utilisés pour l&#39;activation suivante de petites GTPases ainsi que GEFs contre Rac et Cdc42. Ces tests utilisent différents TPS-protéines marquées et avoir de légères différences de celle décrite ici, mais les étapes de base sont les mêmes. Ainsi, ce protocole peut être facilement adapté pour d&#39;autres petite GTPase et des dosages d&#39;activation du FEM. Le test présenté FEM a été récemment modifié pour l&#39;application pour les fractions nucléaires 9,10. Avec d&#39;autres modifications, les tests d&#39;activation du FEM dans les autres compartiments subcellulaires pourrait également être possible. Nous utilisons la méthode présentée pour étudier l&#39;activation de GEF dans les lignées cellulaires épithéliales 5,6,7. Avec un peu d&#39;optimisation, ce test devrait être suffisante pour détecter GEFs de toute lignée cellulaire. Lorsque adapting à un type cellulaire spécifique, trouver le numéro de cellulaire optimale, le volume de tampon de lyse, et la méthode de détection pour le FEM à être testé (un anticorps bon pour Western blot est important). Pour la configuration initiale de l&#39;essai, il est conseillé d&#39;utiliser un stimulus qui est connu pour activer le FEM d&#39;intérêt. Lorsque vous utilisez un stimulus inconnu, toujours utiliser un contrôle positif afin de vérifier que votre dosage est de travailler. Ce test peut être utilisé pour détecter l&#39;activation de la GEF connues par Western blot. Cependant, il est également adéquate pour identifier GEFs inconnus. Pour cela, GEFs capturés de contrôle et des échantillons stimulés doivent être analysés sur un gel teinté au bleu de Coomassie. Les bandes qui apparaissent uniquement dans des échantillons stimulés pourrait contenir GEFs activées et peuvent être envoyées à l&#39;identification par spectrométrie de masse (par exemple 5). Enfin, une note d&#39;avertissement. Le test est basé sur l&#39;hypothèse que les modifications post-traductionnelles rendant GEFs actifs sont conservés après lyse cellulaire. En effet, c&#39;est clairement le casoi pour un certain nombre de GEF, et depuis ses établissements, ce test a été utilisé par divers groupes pour détecter l&#39;activation des différents GEFs, notamment le FEM-H1, p115RhoGEF et XPLN (par exemple 5,11,12,13). Préservation de l&#39;état actif mais pourrait ne pas arriver dans le cas de tous les GEF, et par conséquent il est concevable que ce test ne fonctionne pas pour tous les GEF. Il doit également être noté que de nombreux GEFs exercer une activité vers plus d&#39;un petites GTPases. Ainsi, quand un particulier FEM est étudié, il est recommandé de compléter ce test avec les tests de précipitation du FEM pour les autres petites GTPases, ainsi que des études fonctionnelles examen RhoA, Rac1 et Cdc42. Les étapes critiques dans le protocole: Les colonies de bactéries transformées doivent être ramassés à partir de plaques de frais, bien préparés pour assurer une sélection adéquate par Amp, l&#39;excroissance et de rendement. Conditions de transformation des cellules compétentes obtenus à partir d&#39;autres sources peut varier et doit être consulté. </p&gt; Toutes les étapes du protocole de préparation de protéines (de l&#39;étape 2.3) et le dosage (à partir de l&#39;étape 3.2) doit être effectuée à 4 ° C avec des solutions refroidies et les centrifugeuses. Lyse bactérienne (étape 2.5) devrait être approfondie et complète afin d&#39;obtenir une suspension homogène. Lorsque la lyse de la bactérie, de tourbillon, et pipeter le lysat alternativement, tout en le maintenant à 4 ° C et à assurer la sonication est effectuée sur de la glace pour empêcher la dénaturation de la protéine. Si vous utilisez un modèle différent de sonicateur, les conditions peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée. L&#39;incubation de sonicat avec les perles devrait toujours être faite à 4 ° C sur un agitateur pour assurer une liaison suffisante, et les soins devraient être prises pour maintenir le calendrier cohérent. TPS-Rho mutants sont quelque peu instables lorsqu&#39;elles sont exprimées dans des bactéries, il est donc préférable d&#39;utiliser des billes préparées tout de suite ou dans quelques jours. Le test de précipitation (Partie 3) est le temps et sensible de température, uns GEFs actifs peuvent facilement être perdus à partir du lysat cellulaire, de sorte que des mesures devraient être effectuées aussi rapidement que possible. La section suivante contient quelques conseils de dépannage. Pas ou très faible quantité de protéines Rho mutant dans la préparation finale perle: Cela peut être causé par induction inefficace, lyse insuffisante des bactéries, ou une perte de la protéine au cours du processus de préparation ou de stockage. Pour vous aider à résoudre certaines de ces possibilités, des échantillons de bactéries peuvent être analysés avant et après l&#39;induction. Si il ya induction pauvres de la protéine répéter le processus à l&#39;aide d&#39;une colonie d&#39;une plaque fraîchement striée ou de re-transformé des cellules compétentes. Concentrations différentes IPTG et temps d&#39;induction devraient également être testés. Si la lyse est insuffisante (c.-à-la protéine reste dans le culot au lieu de le surnageant) des concentrations variables de sel et de détergent dans le tampon de lyse peut être essayé. Autres temps de sonication etparamètres doivent être pris en considération, et les échantillons avant et après sonication peut être vérifiée par microscopie afin de déterminer l&#39;efficacité de la lyse. Aucun précipité du FEM, même si la TPS-protéine est présente sur les perles: Cela peut être dû à des problèmes techniques pendant le test de précipitation, ou par une absence réelle de l&#39;activation de l&#39;étude du FEM en utilisant le stimulus appliqué. Toujours utiliser un stimulus connu comme un contrôle positif pour vérifier que votre test fonctionne. Utilisez les perles préparées en quelques jours. Si l&#39;essai de précipitation capture des quantités indétectables de la FEM étudiés dans toutes les conditions, vérifier que votre FEM est présent et il est bien détectable dans le surnageant après centrifugation qui doit être utilisé pour le dosage (étape 3.3). Assurez-vous que tous les tampons et les inhibiteurs de protéase sont fraîches, et effectuer toutes les étapes sur la glace aussi vite que possible. Augmenter la quantité de protéines d&#39;entrée (par exemple en utilisant des lysats de 2 plaques / échantillon). Si l&#39;essai de précipitation montre basale précipitationstion de votre FEM, mais aucune différence n&#39;est observée entre le contrôle et les échantillons stimulés (figure 4), commencer le dépannage en vérifiant que le stimulus appliqué travaillé à l&#39;aide d&#39;autres effets connus (par exemple en détectant l&#39;activation d&#39;autres voies de signalisation). Pensez à changer les conditions de traitement et / ou concentrations. S&#39;appuyer sur les données de la déclaration la littérature comment votre relance activent Rho ou de signalisation autres prédire le temps et les concentrations susceptibles. Lors de l&#39;optimisation du temps de traitement, utiliser les deux points dans le temps court et long terme, que l&#39;activation du FEM pourrait être la meilleure détectable à un moment avant l&#39;activation de Rho ainsi détectable. Enfin, le même stimulus pourrait se traduire par un degré variable d&#39;activation due à un changement dans la sensibilité des cellules causés par le nombre de passages, de cellules de confluence, etc

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> pGEX-RhoA (G17A) </td><td> Addgene </td><td> Sera bientôt disponible </td><td> Généré dans le laboratoire du Dr Keith Burridge (Université de Caroline du Nord) (ref 3) </td></tr><tr><td> DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> Magasin -80 ° C </td></tr><tr><td> Milieu SOC </td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td> Gardez stérile </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> Les stocks en magasin à -20 ° C </td></tr><tr><td> Gélose </td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyle BD-thiogalacto-pyranoside) </td><td> Calbio-chem </td><td> 420322 </td><td> Solution stock Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutathion billes de Sépharose </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> TX-100 </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> TNT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la protéase 50x </td><td> BD Baculo-Gold </td><td> 51-21426Z </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr&gt; <td> Complete Mini, EDTA sans 10x </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> Laemmli Sample Buffer 2x </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td> Ajouter juste avant utilisation </td></tr><tr><td> Bleu de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td> Acide acétique </td><td> CALEDON </td><td> 1000-1 </td><td></td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> CALEDON </td><td> 6701-7 </td><td></td></tr><tr><td> Protein Assay Bio-Rad </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> Échelle BluEye </td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Utilisé. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Entreprise </td&gt; <td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> RC-5B centrifugeuse </td><td> Sorvall </td><td> SS-34 Rotor </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Sorvall-Thermo Scientific </td><td> ST-16R </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr><tr><td> Centrifugeuse Micro </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr><tr><td> Bactérienne agitateur </td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> Utilisez-le à 37 ° C ou à 22 ° C </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Branson </td><td> Sonifier-450 </td><td> Utilisez à la température ambiante </td></tr><tr><td> Rotateur </td><td> Glas-Col </td><td> 099A CR4012 </td><td> Utilisez à 4 ° C </td></tr></tbody></table> Équipements Tableau 2. Spécifique utilisé.

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

Les protéines de la famille Rho des petites GTPases sont des régulateurs centraux du cytosquelette, et de contrôler une grande variété de processus cellulaires, y compris la migration des cellules, l&#39;expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et 1 d&#39;adhésion cellulaire. Protéines Rho sont des commutateurs moléculaires qui sont actives dans GTP et inactive dans le PIB lié Etat. Leur activation est médiée par une famille de guanine-nucleotide facteur d&#39;échange (FEM) des protéines. Rho-GEF constituent une grande famille, avec des chevauchements spécificités 2. Bien que beaucoup de progrès ont été accomplis dans l&#39;identification des GEFs activés par des signaux spécifiques, il existe encore de nombreuses questions subsistent sur la voie de la réglementation spécifique de ces protéines. Le nombre de Rho-GEF dépasse 70, et chaque cellule exprime plus d&#39;une protéine du FEM. En outre, bon nombre de ces protéines Rho activer non seulement, mais d&#39;autres membres de la famille, contribuant à la suite de la complexité des réseaux de régulation. Surtout, l&#39;explorationcomment GEFs sont réglementées nécessite une méthode à suivre la piscine active de GEFs individuelles dans les cellules activées par des stimuli différents. Ici, nous fournir un protocole étape par étape pour une méthode utilisée pour évaluer et quantifier les actifs disponibles Rho-GEF spécifiques en utilisant un essai de précipitation par affinité. Ce test a été développé il ya quelques années dans le laboratoire Burridge 3,4 et nous l&#39;avons utilisé dans les lignes de cellules rénales de tubulaires 5,6,7. Le test prend avantage d&#39;un &quot;nucléotide libre&quot; mutant RhoA, avec une forte affinité pour les GEF actifs. La mutation (G17A) rend la protéine incapable de se lier PIB ou le GTP et cet état imite l&#39;état intermédiaire qui est lié à la FEM. Une version TPS-étiqueté de cette protéine mutante est exprimée et purifiée à partir de E. coli, liés à des billes de sépharose glutathion et utilisé pour précipiter GEFs actifs à partir de lysats de cellules non traitées et stimulé. Comme la plupart des GEF sont activés via des modifications post-traductionnelles ou de la libération des liaisons inhibitrices, leur état actifest conservé dans les lysats cellulaires, et ils peuvent être détectés par ce test 8. Protéines capturées peuvent être sondé pour GEFs connus par la détection d&#39;anticorps spécifiques à l&#39;aide Western blot, ou analysés par spectrométrie de masse pour identifier GEFs inconnus activés par certains stimuli.

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Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

La méthode présentée ici décrit un dosage de suivre l&#39;activation de RhoA facteurs spécifiques de change GDP / GTP (GEF) dans les cellules cultivées en faisant usage d&#39;une protéine mutante RhoA fusion GST qui a une forte affinité pour GEFs activés. GEF sont précipités à partir de lysats cellulaires, détectées par Western blot et quantifiée par densitométrie.

Précipitation par affinité des actifs des Rho GEF l&#39;aide d&#39;un TPS-étiqueté Mutant Rho protéines (TPS-RhoA (G17A)) à partir de lysats cellulaires épithéliales

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

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Research

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Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K vues.  St. Michael's Hospital. La méthode présentée ici décrit un dosage de suivre l'activation de RhoA facteurs spécifiques de change GDP / GTP (GEF) dans les cellules cultivées en faisant usage d'une protéine mutante RhoA fusion GST qui a une forte affinité pour GEFs activés. GEF sont précipités à partir de lysats cellulaires, détectées par Western blot et quantifiée par densitométrie.

Vidéo: Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Recherche

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Bleu d&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l&#39;analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...