Cette recherche a été financée par le National Institutes of Health octroi R01HL086939 (CCN).

Dans ce protocole, nous démontrons une isolés, aérés, la préparation perfusé des poumons de souris qui a déjà été utilisé pour quantifier l&#39;impact de l&#39;embolie pulmonaire et de l&#39;hypoxie chronique sur pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit relations (Tuchscherer, Webster et Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). En bref, les poumons de souris sont chirurgicalement isolés de tissus environnants, placé dans une chambre chauffée (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) et ventilé (ventilatoire module de commande (VCM)-R avec minuterie contre Module (TCM); Harvard Appareil). La vascularisation du poumon est perfusée avec du milieu RPMI 1640 chauffée culture cellulaire avec 3,5% de Ficoll à l&#39;aide d&#39;une seringue électrique (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois) pour générer les courbes de débit constant ou une pompe à haute fréquence oscillatoire (Bose-Electro force, l&#39;Eden Prairie, MN) en parallèle avec la pompe seringue pour créer des formes d&#39;onde pulsatile vasculaire pulmonaire débit. Capteurs de pression (P75, Harvard Apparatus) mesure la pression artérielle pulmonaire instantanée (PAP) et la pression auriculaire gauche (LAP). Débit instantané (Q) est mesuré avec un débitmètre en ligne (Transonic Systems, Inc, Ithaca, NY). Pulsatile pression-débit relations sont dérivées de ces mesures, qui donnent un aperçu vasculaire pulmonaire physiologie et la pathologie et la postcharge ventriculaire droite. 1. Equipement: <ol><li> Pulmonaires isolés mise en place, y compris un ventilateur de souris </li><li> Système d&#39;acquisition de données et l&#39;ordinateur avec le programme LabView </li><li> Deux capteurs de pression et de débit Débitmètre perfusat </li><li> Capteur de pression et un débitmètre (pnemotachometer) pour un débit respiratoire </li><li> Pompe à haute fréquence oscillatoire et l&#39;ordinateur avec le programme de test Win </li><li> Boom / zoom du microscope, lampe </li><li> Bain chauffant avec pompe à haut rendement pour le système IL-1 </li></ol> 2. Préparer le système IL-1 <ol><li> L&#39;eau distillée chauffée à 37 ° C par le bain de chauffage est distribué à l&#39;intérieur de l&#39;IL-1 du système. </li><li> Toutes les pompes, les capteurs et l&#39;IL-1 canule sont connectés via un tube propre et tous les tubes sont rincés à l&#39;eau distillée chauffée à 37 ° C. Les bulles d&#39;air, qui pouvaient voyager dans les poumons et provoquer des oedèmes, doivent être enlevés. Tuyau de la pompe à écoulement oscillatoire au capteur de flux et du capteur de débit à la canule artérielle pulmonaire sont rincées avec du PBS 1%. </li><li> Le P75 transducteurs de pression sont mis à zéro par la fermeture de la vanne à la canule, l&#39;ouverture des vannes à l&#39;atmosphère et puis en appuyant sur le bouton à zéro automatique sur l&#39;amplificateur PLUGSYS. Ensuite, la vanne à l&#39;atmosphère est fermée et la vanne à la canule ouverte. </li><li> La pièce céramique poreuse dans la voie de ventilation du système IL-1 est mouillée de fournir l&#39;humidité. </li></ol> 3. Solutions <ol><li> Préparer 3,5% en volume de Ficoll-RPMI solution et filtre stérile dans les médias. Filtrage des médias assure qu&#39;il n&#39;y a pas de grosses particules qui pourraient involontairement emboliser le poumon. L&#39;utilisation de supports stériles réduit également la probabilité de développer un œdème soudaine dans les poumons. Remplissez un seringue de 10 ml avec du RPMI pour la chirurgie et une seringue de 60 ml avec du RPMI pour chaque essai expérimental. Chauffer le perfusat dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Préparer 1 ml d&#39;héparine de poids corporel 500IU/100g de la souris (approximatif). Le sel de l&#39;héparine est 158IU/mg. Pour un ~ 25 g de souris, mélanger 1,25 mg de sel d&#39;héparine avec 1ml de PBS solution dans un tube à centrifuger de petite taille. </li></ol> 4. Ventilation d&#39;une souris <ol><li> Après une injection intrapéritonéale de 150 mg dans une solution de pentobarbital par kilogramme dans la souris, d&#39;assurer une anesthésie profonde en effectuant une pincée dur sur une patte. S&#39;il n&#39;y a pas de réaction, de préparer la souris pour la chirurgie en épinglant ses pattes avant pour liège pour la stabilité. Remarque: Tout au long de la profondeur d&#39;anesthésie expérimentation est surveillé en observant attentivement l&#39;animal. Les broches dans les pattes et les incisions fréquentes agissent comme des stimuli nocifs, l&#39;absence de réponse à ce qui confirme que l&#39;animal reste dans un plan chirurgical de l&#39;anesthésie. </li><li> Vaporiser la poitrine avec de l&#39;alcool à 95% pour mouiller le bas de la fourrure et l&#39;utilisation de pinces droites pour saisir la peau au niveau du cou. Coupez un 1 cm d&#39;ouverture dans la peau en utilisant les ciseaux droits. </li><li> Une fois l&#39;intérieur du col est exposée, enlever tous les tissus blancs glandulaire et musculaire superficielle, à la recherche pour l&#39;œsophage et la trachée. Isoler l&#39;œsophage et la trachée du tissu sur les deux côtés et en arrière. </li><li> Insérez la pince plié sous la petite trachée et attraper un morceau de suture sur l&#39;autre côté. Tirez le fil de suture dans la trachée et un noeud lâche chirurgiens. Ne pas serrer le fil de suture ou d&#39;attacher le noeud. </li><li> Coupez un petit angle «V» dans la trachée avec de petits ciseaux; ne pas couper tout au long de la trachée. Déplacer le panneau de liège et de la souris à l&#39;IL-1 chauffée système. En utilisant les deux pince émoussé, prenez la canule trachéale et la trachée-dessous du &quot;V&quot;. Puis, faites glisser la canule trachéale dans la trachéotomieea par le &quot;v&quot; d&#39;ouverture. Serrer le fil de suture autour trachée et canule trachéale pour sécuriser l&#39;intérieur de la canule dans la trachée. Attacher le noeud. </li><li> Commencez la ventilation (50% d&#39;inspiration, 90 cycles / min, avec une inspiration profonde) avec l&#39;air ambiant. </li></ol> 5. Perfusant une souris ventilée 5.1. Accès au ventricule droit d&#39;injecter l&#39;héparine <ol><li> Vaporiser la poitrine de la souris avec de l&#39;alcool de nouveau pour mouiller la fourrure. Retirez toute la peau sur la poitrine au-dessus des côtes de l&#39;aide de pinces et ciseaux droites droites. Coupez le haut le long du sternum. Soulever la peau de chaque côté, puis couper la peau en suivant la ligne des côtes inférieures. </li><li> Saisir le processus xiphoïde à la base du sternum avec des pincettes et découper un trou dans le diaphragme en utilisant les ciseaux droits. Prenez le diaphragme avec la pince à épiler et le couper loin des côtes. </li><li> Saisir le processus xiphoïde à nouveau avec la pince à épiler (à gauche) et utiliser la boule à pointe, des ciseaux pour couper à angle le sternum et par les côtes, en faisant attention de ne pas couper les poumons, le cœur ou les vaisseaux sanguins (utiliser le ballon à pointe sur le les ciseaux pour vous guider). Il y aura du sang mais aussi longtemps que la pointe des ciseaux est contre le sternum, le cœur et les poumons ne sera pas coupé. </li><li> Saisir les côtes sur le côté gauche et couper autant de côtes que nécessaire pour exposer le cœur. Injecter lentement le ventricule droit avec une solution 0,1 ml d&#39;héparine. Cette étape est importante pour prévenir les caillots sanguins dans les poumons, qui endommagent les cellules endothéliales et nuira à la perfusion. L&#39;héparine doit être injecté alors que le cœur bat encore. </li></ol> 5.2. Cathétériser l&#39;artère pulmonaire <ol><li> Coupez le reste des côtes (côté gauche et droit) à l&#39;aide du dos (arrondi) fin de la pince pour pousser doucement les poumons du mur thoracique. Saisissant les poumons eux-mêmes seront endommager les tissus délicats. Contact accidentel entre les pointes de ciseaux et le tissu pulmonaire sera également causer des dommages. </li><li> Déplacer le microscope en place au cours du poumon. Coupez le tissu glandulaire et gras sur le dessus du cœur. Utilisez la pince à épiler pour qu&#39;elle se détache de la artères et les veines, puis couper avec les ciseaux de printemps alors que le tissu est en tension. </li><li> En utilisant une autre série de pinces à épiler émoussée, écope de droite à gauche à partir du haut du coeur sous l&#39;oreillette gauche / ventricule pour obtenir la pointe de la pince à épiler dans l&#39;aorte et l&#39;artère pulmonaire (AP). Pour ce faire, soigneusement qu&#39;il ne devrait pas être la résistance à la pince à épiler. En utilisant une pince à épiler émoussée réduit la probabilité d&#39;accident perforation de l&#39;artère pulmonaire ou l&#39;aorte. </li><li> Une fois la pointe pince est sous l&#39;aorte et l&#39;AP, prenez un morceau de suture et passer à travers. Faire un noeud lâche chirurgiens. Ne pas serrer le fil de suture ou d&#39;attacher le noeud. </li><li> En option: utiliser les ciseaux à angle pour enlever la moitié inférieure du corps. Couper à travers les côtes et la colonne vertébrale; couper l&#39;aorte et la veine cave va provoquer une importante quantité de sang de circuler - utiliser un Q-tip pour contenir l&#39;écoulement. Placer dans un sac pour l&#39;élimination. </li><li> Premier PA canule avec 4 ml d&#39;une seringue de 10 ml de RPMI. Vérifier que tous les tubes est libre de bulles d&#39;air. Perfusion du poumon avec de l&#39;eau distillée ou des bulles se traduira par un œdème. </li><li> Couper une petite encoche dans la paroi ventriculaire droite libre et insérez la canule PA, visant vers le bas et vers la droite. L&#39;extrémité de la canule doit être visible à travers la paroi transparente de l&#39;AP. Faire infuser une petite quantité de RPMI pour confirmer votre emplacement. Serrer le fil de suture autour de la canule, l&#39;aorte et l&#39;AP et attacher le noeud. Notez qu&#39;à ce stade, l&#39;aorte est aussi liée au large afin de perfusion réelle ne doit pas commencer avant que l&#39;oreillette gauche est canulée. </li></ol> 5.3. Cathétériser l&#39;oreillette gauche <ol><li> Couper une encoche dans la partie inférieure du ventricule gauche et l&#39;oreillette gauche inertes (LA) canule, visant à la hausse. Une légère pression peut être nécessaire pour ouvrir la valve mitrale dans cette direction. Dans l&#39;emplacement correct, l&#39;extrémité de la canule se glisser à travers et être sécurisé sans suture. </li></ol> 5.4. Commencez la perfusion <ol><li> Manuellement infuser RPMI de la seringue de 10 ml à 0,3 ml par minute jusqu&#39;à ce que l&#39;IPMB est évident dans le tuyau d&#39;écoulement (rose-ish couleurs en contraste avec le clair PBS). S&#39;il n&#39;ya pas d&#39;écoulement dans le tuyau d&#39;écoulement, re-positionner la canule de Los Angeles. Si aucune sortie peut être obtenue avec re-positionnement, vérifier une fuite dans l&#39;artère pulmonaire. Une fuite ou une déchirure de l&#39;artère pulmonaire ne peut pas être réparé, ce qui est cause de l&#39;abandon de l&#39;expérience. </li><li> Connecter une seringue de 60 ml à la canule PA à travers le système IL-1 et de commencer la perfusion 1mL/min du perfusat, la vérification des fuites et en s&#39;assurant que les poumons deviennent blancs, ce qui montre que RPMI est de remplacer le sang dans les poumons. Perfuser avec un débit lent pendant deux minutes. </li></ol> 6. Mesure pulsatile et Steady pulmonaire Pression-Débit relations <ol><li> Pour les études de flux pulsatile, d&#39;abord définir les déplacements oscillatoires piston de la pompe àles niveaux désirés pour chaque fréquence dans la WINTEST programme basé sur les expériences précédentes. Variabilité due à la structure des poumons et de la mécanique, les déplacements doivent être ajustés pour chaque souris. Réglez flux constant au niveau désiré. Ouvrez la vanne à la pompe oscillante et commencer l&#39;enregistrement de données juste avant l&#39;exécution du profil d&#39;écoulement oscillatoire (programme WINTEST). Ouvrez le fichier de données et tracer le flux expérimental (Q) dans Excel. Ajuster les déplacements oscillatoires piston de la pompe à chaque fréquence (programme WINTEST) de sorte que Q max et Q min sont comme désiré. </li><li> Pour les essais d&#39;écoulement stable, fermer la vanne à la pompe oscillatoire. Si cette vanne reste ouverte, la pompe oscillante agit comme un condensateur, atténuant les variations d&#39;une débit à l&#39;autre. Recueillir des données pour au moins 10 secondes à chaque débit ou jusqu&#39;à ce que la pression PA ne change pas de plus de 5%. </li><li> Pour des mesures de flux pulsatile ou soit constante, la ventilation ancienne à une pression constante avant la collecte des données. Reprendre une ventilation immédiatement après la collecte des données. </li><li> Surveillez RPMI dans le tube respiratoire, ce qui est des preuves de l&#39;œdème et est une cause de l&#39;abandon de l&#39;expérience. Aussi, ne laissez pas RPMI atteindre la pression des voies aériennes ou le débit des capteurs, car il pourrait endommager les capteurs. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Représentant Résultats Steady: Dans le poumon isolés mise en place de l&#39;expérimentateur a la capacité de contrôler indépendamment non seulement le débit pulmonaire Q, mais aussi les voies respiratoires LAP pression P de l&#39;air et la pression auriculaire gauche. Cela est avantageux car Q, P air et LAP influencer le système vasculaire pulmonaire et la pression artérielle pulmonaire résultant PAP artère. Un autre avantage est que les résultats obtenus sont indépendants de ton système nerveux sympathique 1, l&#39;état du volume, et l&#39;anesthésie 2. Changements induits par le PAP en escalier changements dans Q pour fixe P de l&#39;air et soit fixe ou variable LAP sont présentés dans la figure 1. Notez que dans la préparation pulmonaires isolées, la canule LAP est généralement relié à un tuyau qui dirige le perfusat dans un conteneur à déchets. Avec ce tube en place, le LAP est linéairement dépendante due à l&#39;écoulement de Poiseuille Q. Cependant, la hauteur de la sortie et le conteneur à déchets peut être réglée manuellement pour fournir une constante, non nulle LAP ou le tuyau peut être enlevé pour permettre à zéro LAP qui est indépendante de Q. Représentant Résultats pulsatile: Bien des formes d&#39;onde arbitraires flux pulsatile peut être générée par ce système, nous avons généralement générer des flux de la forme Q = 3 + 2 sin (2 f πt) ml / min à des fréquences de f = 1, 2, 5, 10, 15 et 20 Hz. pour évaluer l&#39;impédance linéarisé du système vasculaire pulmonaire (Figure 2: panneau supérieur). A partir des mesures du PAP, LAP et Q qui en résulte, l&#39;ampleur pulmonaires vasculaires impédance (Z) et de phase (θ) sont calculés d&#39;abord en décomposant un cycle complet d&#39;sinusoïdale AP = PAP-LAP et Q à chaque fréquence imposée de flux sinusoïdale de taux en une série de harmoniques sinusoïdales en utilisant une transformée de Fourier. Le rapport de la pression se transformer en flux de rendements de transformer l&#39;impédance vascualar pulmonaire, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), qui a une magnitude de Z et de phase θ. Impédance d&#39;entrée Z 0, impédance caractéristique Z c, et l&#39;indice de réflexion des ondes R W, sont calculées à partir de l&#39;amplitude d&#39;impédance. En particulier, Z 0 est calculée à partir de Z à la 0e harmonique (f = 0 Hz) en moyenne sur toutes les fréquences, Z C est calculé comme la moyenne des Z entre le premier minimum (5 Hz) et 20 Hz, et R W est calculée que (Z 0-Z C) / (Z 0 + Z C) 3. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 onde flux constant (rangée du haut) et les pressions résultant. (Deuxième rangée: PAP, P air, LAP) en fonction du temps avec des combinaisons différentes de LAP et de l&#39;air P. La rangée du bas montre PAP vs Q. Dans (A) et (B), les augmentations de LAP et diminue avec Q parce que le tuyau d&#39;écoulement est en place. Ce tube a été retiré pour (C) pour que le LAP est constante et indépendante de Q. En (D) et (E) la hauteur de la tubulure de sortie a été ajustée manuellement de sorte que le LAP est plus élevé, mais indépendante de Q. P air était soit à fin d&#39;inspiration (A, C, D) ou expiratoire (B, E) de pression. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2 pulsatile flux de forme d&#39;onde Q (panneau supérieur) et les pressions résultant (panneau du bas: PAP, LAP et P de l&#39;air). En fonction du temps. A partir de ces pulsatile pulmonaires pression-débit relations, PVZ peut être calculée, ce qui reflète la postcharge ventriculaire droite totale.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+remodeling+in+isolated+mouse+lungs:+Effects+on+pulsatile+pressure-flow+relationships.">Pulmonary vascular remodeling in isolated mouse lungs: Effects on pulsatile pressure-flow relationships.</a> Journal of Biomechanics. 40, 993-1001 (2007).</li><li>Vanderpool, R., Naeije, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+in+Isolated+Mouse+Lungs+for+the+Determination+of+Site+of+Action+of+Vasoactive+Agents+and+Disease.">Impedance in Isolated Mouse Lungs for the Determination of Site of Action of Vasoactive Agents and Disease.</a> Ann Biomed Eng. , (2010).</li><li>Vanderpool, R., Kim, A., Molthen, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+rho+kinase+inhibition+on+chronic+hypoxia-induced+changes+in+proximal+and+distal+pulmonary+arterial+structure+and+function.">Effects of acute rho kinase inhibition on chronic hypoxia-induced changes in proximal and distal pulmonary arterial structure and function.</a> Journal of Applied Physiology. , (2010).</li><li>El-Bizri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+protein+22alpha-mediated+patchy+deletion+of+Bmpr1a+impairs+cardiac+contractility+but+protects+against+pulmonary+vascular+remodeling.">Smooth muscle protein 22alpha-mediated patchy deletion of Bmpr1a impairs cardiac contractility but protects against pulmonary vascular remodeling.</a> Circ Res. 102, 380-388 (2008).</li><li>Champion, H., Michelakis, E., Hassoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+invasive+and+noninvasive+approach+to+the+right+ventricle-pulmonary+circulation+unit:+state+of+the+art+and+clinical+and+research+implications.">Comprehensive invasive and noninvasive approach to the right ventricle-pulmonary circulation unit: state of the art and clinical and research implications.</a> Circulation. 120, 992-1007 (2009).</li><li>Gan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasively+assessed+pulmonary+artery+stiffness+predicts+mortality+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Noninvasively assessed pulmonary artery stiffness predicts mortality in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 132, 1906-1912 (2007).</li><li>Mahapatra, S., Nishimura, R., Sorajja, P., Cha, S., McGoon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+pulmonary+arterial+capacitance+and+mortality+in+idiopathic+pulmonary+arterial+hypertension.">Relationship of pulmonary arterial capacitance and mortality in idiopathic pulmonary arterial hypertension.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 799-803 (2006).</li><li>Bogaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+artery+pressure+elevation+is+insufficient+to+explain+right+heart+failure.">Chronic pulmonary artery pressure elevation is insufficient to explain right heart failure.</a> Circulation. 120, 1951-1960 (2009).</li></ol>

Les étapes critiques dans la chirurgie Il est essentiel que l&#39;on prend soin lors de la coupe de la cage thoracique loin dans les poumons. Les poumons doivent être complètement dégagées et sans entraves par les tissus environnants pendant l&#39;inflation mais pas endommagés pendant le processus d&#39;isolement. L&#39;utilisation d&#39;un objet plat comme la partie arrière de la pince peut être utilisée pour maintenir les poumons loin de la paroi thoracique afin qu&#39;il y ait une v...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>1 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-829-10F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-823-2A </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>13-689-8 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI with GLN 6/PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>MT10040CV </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bottle Top Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>09-761-57</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll PM 70</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2878-100g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Y27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Y0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Angled Ball Iris scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14109-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas Spring Scissors - 4mm Blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15018-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Iris Scissors - straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14106-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont Medical Biology Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11254-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lauda E100 ECO-line 003 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL-1 Isolated perfused mouse lung system </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus </td>
<td>739904 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>730020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TS410 Flow Modules</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic </td>
<td>TS410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic</td>
<td>ME 4 PXN</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer </td>
<td>EW-74900-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nembutal 50MG/ML 20ML Vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amatheon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

characterization of the isolated, ventilated, and instrumented mouse lung perfused with pulsatile flow

Les isolés, ventilés et instrumentés préparation des poumons de souris permet constante et pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit relations pour être mesurée avec un contrôle indépendant sur le débit artériel pulmonaire, forme d&#39;onde de débit, pression des voies aériennes et de la pression auriculaire gauche. La résistance vasculaire pulmonaire est calculé en fonction multi-point, une pression constante des flux courbes; impédance vasculaire pulmonaire est calculée à partir pulsatile pression-débit courbes obtenues lors d&#39;une gamme de fréquences. Comme maintenant reconnu cliniquement, l&#39;impédance est une mesure supérieure de la postcharge ventriculaire droite que la résistance parce qu&#39;il inclut les effets de la compliance vasculaire, qui ne sont pas négligeables, en particulier dans la circulation pulmonaire. Trois paramètres importants de l&#39;impédance - le zéro hertz impédance Z 0, l&#39;impédance caractéristique Z, C et l&#39;indice de réflexion des ondes R W - donnent un aperçu de distale artérielle transversale superficie disponible pour l&#39;écoulement, la rigidité artérielle proximale et l&#39;impédance amont-aval décalage, respectivement. Tous les résultats obtenus dans les régions isolées, ventilées et perfusées poumons sont indépendants de ton système nerveux sympathique, l&#39;état du volume et les effets de l&#39;anesthésie. Nous avons utilisé cette technique pour quantifier l&#39;impact de l&#39;embolie pulmonaire et de l&#39;hypoxie chronique sur la résistance et l&#39;impédance, et de différencier les sites d&#39;action (c.-à-proximale distale vs) d&#39;agents vasoactifs et de la maladie en utilisant la pression de la dépendance de Z C. En outre, lorsque ces techniques sont utilisées avec les poumons des souches génétiquement modifiées de la souris, les effets de défauts au niveau moléculaire sur la structure et la fonction vasculaire pulmonaire peut être déterminée.

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Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Le protocole suivant décrit le processus d&#39;isolement, de ventilation et d&#39;instrumenter les poumons de souris pour mesurer stable ou pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit des relations afin de quantifier les effets de la circulation sanguine, circulation de l&#39;air, les changements des voies aériennes et sur les modifications vasculaires postcharge ventriculaire droite.

Caractérisation des isolés, ventilés et instrumentés poumons de souris perfusées avec un flux pulsatile

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.1K vues.  University of Wisconsin – Madison. Le protocole suivant décrit le processus d'isolement, de ventilation et d'instrumenter les poumons de souris pour mesurer stable ou pulsatile vasculaire pulmonaire pression-débit des relations afin de quantifier les effets de la circulation sanguine, circulation de l'air, les changements des voies aériennes et sur les modifications vasculaires postcharge ventriculaire droite.

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Recherche

Biologie

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

Micro-Mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolement et caractérisation de Hoechst Faible CD45 Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Une méthode d&#39;immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Phénotypage Souris fonction pulmonaire<em&gt; In Vivo</em&gt; Avec le Capacité diffusion pulmonaire

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés Tuber

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Évaluation de la réactivité de la tonalité vasculaire à l’aide d’artères mésentériques isolées avec focalisation sur la modulation par les tissus adipeux Perivasculaires