Les études ont été soutenus par les NIH HL75503 à KP.

Toutes les expériences réalisées sur des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université du Tennessee Health Science Center. 1. Tubes pour les préparations de perfusion Rat poumon <ol><li> Préparer un système de tuyauterie avec un tube Tygon (# 18) pour la perfusion de sang comme le montre la Figure 1. Raccorder les capteurs de pression (P23XL) et placer le tube sur la platine du microscope. </li><li> Régler la température du bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Connectez l&#39;entrée du poumon et de sortie temporairement Tygon. </li></ol><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51552/51552fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Tubulure de perfusion artérielle. Le schéma montre la configuration du tube utilisé pour faire circuler le sang à travers la préparation du poumon isolé. Également indiqué sont des éléments associés à travers lequel le tube is en déroute. Un schéma du cœur et des poumons est inclus pour montrer les sites de liaison entre le tube et l&#39;artère pulmonaire (AP), et auriculaire (LA) de la canule (pointillés bleus) a quitté. 2. Préparation de poumons de rat isolés <ol><li> Anesthésier les rats (rats Sprague-Dawley, 250-300 g) avec de la kétamine (80-100 mg / kg) et avec la xylazine (5-10 mg / kg). Après s&#39;être assuré d&#39;un plan de l&#39;anesthésie chirurgicale, placer l&#39;animal dans une position couchée sur le dos. </li><li> Effectuer une trachéotomie, insérer une canule trachéale (PE-90) et le fixer avec suture chirurgicale. </li><li> Infuser héparine (100-200 U) dans le cœur par ponction cardiaque (21 G de l&#39;aiguille de papillon), attendez 60 secondes et le sang exsanguinate (~ 12-15 ml de sang). </li><li> Préparer deux canules (Tygon, 3 mm de diamètre, 4 cm de long; évasées à une extrémité) et remplir avec une solution saline. </li><li> Effectuez une thoracotomie. Faire une incision (3 mm) sur le ventricule droit et faites glisser l&#39;extrémité évasée d&#39;une canule dans l&#39;incision vers l&#39;pulmonaireartère. Fixez la canule à l&#39;artère pulmonaire avec des sutures chirurgicales. </li><li> Inciser (3 mm) de l&#39;apex du ventricule gauche et faire glisser l&#39;extrémité évasée de la deuxième canule dans l&#39;incision. Guide de la canule dans l&#39;oreillette gauche. Fixer une canule dans le ventricule gauche avec un ruban ombilical (2 mm de large). </li><li> Disséquer tout tissu conjonctif, et retirer le poumon et le cœur avec les canules attachés. Placez poumon et le cœur sur une boîte de Pétri. Repositionner le poumon de sorte que la surface diaphragmatique est sur le dessus. Les trois canules doivent faire face à la même direction. </li><li> Placer la préparation du poumon sur une scène qui peut être manipulé dans les directions XY. Un stade qui est livré avec un microscope peut être modifié pour tenir le tuyau ou un stade construit sur mesure, si nécessaire. </li></ol> 3. Perfusion sanguine des poumons de rats isolés <ol><li> Mélanger le sang saigné avec un volume égal de l&#39;albumine (5%) de la solution et d&#39;ajouter au réservoir. Démarrer la pompe péristaltique et régler le débit rmangé à 14 ml / min. Laisser le sang pour remplir le tube. </li><li> Avec le shunt ouvert, retirez le poumon connecteur temporaire entrée-sortie. Fixer l&#39;artère pulmonaire et l&#39;oreillette gauche canule à l&#39;entrée et à la sortie du poumon, respectivement. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans le tube. </li><li> Raccorder la canule trachéale à un troisième transducteur de pression (P23XL). Gonfler les poumons avec 30% d&#39;oxygène par l&#39;intermédiaire de la canule trachéale et maintenir la pression à 5 cm H 2 O. </li><li> Fermez le shunt avec une pince pour commencer la perfusion du poumon. Maintenir l&#39;artère pulmonaire et les pressions auriculaires gauches à ~ 10 cm et 3 respectivement H 2 O. </li></ol> 4. Préparation du poumon pour perfusion microvasculaire <ol><li> Soulever l&#39;extrémité arrière du tube de prolongement pour le cathéter au-dessus du niveau du poumon et sûr. </li><li> Préparer un cathéter de perfusion par l&#39;insertion d&#39;environ 30 cm d&#39;un tube de PE10 40 cm de longueur dans un tube de PE90 ~ 30 cm de long. Connectez l&#39;extrémité exposée du tube PE10 à une aiguille (30 G)attaché à une seringue (1 cc). </li><li> Insérer la combinaison de cathéter dans l&#39;extrémité arrière relevée du tube d&#39;extension. Guide de la combinaison de cathéter dans l&#39;oreillette gauche et dans les poumons jusqu&#39;à ce qu&#39;il rencontre une résistance. Ensuite, appuyez sur le cathéter PE10 seul plus loin dans les poumons jusqu&#39;à ce qu&#39;il rencontre une résistance. Notez que l&#39;application d&#39;une force excessive lors de l&#39;insertion du cathéter blesser le poumon. </li><li> Remplir la seringue de 1 ml avec une solution de Ringer et la joindre à une pompe à seringue. Réglez le débit de perfusion de 10 pi / min. </li><li> au site de perfusion deviendra pâle par rapport à reste du poumon. </li><li> Humidifiez le poumon avec une solution saline et couvrir le poumon d&#39;une pellicule de plastique avec un trou assez grand pour quitter le site de perfusion découvert. </li><li> Tamponner un peu de graisse à robinet d&#39;arrêt sur la partie inférieure d&#39;un joint torique (sur mesure), et placer une lamelle couvre-objet en verre (# 1,5, 22 mm de diamètre) sur le fond du joint torique. Positionnez délicatement le joint torique avec la lamelle sur le site de perfusion. Fixez le joint torique avec un hol-éprouvette normeder. Le / combinaison joint torique lamelle ne fausse pas les structures alvéolaires en dessous, comme rapporté récemment 15. </li><li> Positionner un objectif (20X) d&#39;un microscope de fluorescence au-dessus du joint torique et de se concentrer à la surface du poumon. </li></ol> 5. Imagerie fluorescente Dextran transiter microvaisseaux <ol><li> Préparer le microscope pour l&#39;imagerie FITC floraison. </li><li> Sélectionnez une région à imager et acquérir des images à la vitesse de 1/minute l&#39;aide du logiciel d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Commencez perfusion de FITC-dextran 20 kDa (0,5 mg / ml) en utilisant la pompe à seringue. Fluorescence dans les vaisseaux sanguins va progressivement augmenter et atteindre un maximum. Continuer perfusion pendant 60 min. </li><li> Puis passer à la perfusion de Ringer à laver fluorescence luminale. Maintenir la perfusion pendant plus de 10 min. Continuer acquisition d&#39;image à 1/min pendant le lavage-off. </li></ol> 6. Analyse de l&#39;image <ol><li> Ouvrez le fichier d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> La place des régionsd&#39;intérêt sur les microvaisseaux dans le cadre de l&#39;image. </li><li> Lire le fichier d&#39;image, image par image et enregistrer l&#39;intensité de fluorescence à chaque région d&#39;intérêt pour tous les cadres. </li><li> Tracer le changement de l&#39;intensité de fluorescence pour chaque région d&#39;intérêt en fonction du temps. </li><li> Quantifier l&#39;intensité de fluorescence maximale et l&#39;intensité de fluorescence résiduelle après 10 min de lessivage. </li><li> Calculer le rapport entre un maximum de l&#39;intensité de fluorescence résiduelle au niveau de chaque région d&#39;intérêt pour obtenir l&#39;indice de perméabilité de microvaisseaux associées à cette région d&#39;intérêt. </li></ol>

<ol>
	<li>Ware, L. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).</li><li>Matthay, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+respiratory+distress+syndrome.">The acute respiratory distress syndrome.</a> J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).</li><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury.">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annu Rev Physiol. 75, 593-615 (2013).</li><li>Parthasarathi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+43+mediates+spread+of+Ca2+-dependent+proinflammatory+responses+in+lung+capillaries.">Connexin 43 mediates spread of Ca2+-dependent proinflammatory responses in lung capillaries.</a> J Clin Invest. 116, 2193-2200 (2006).</li><li>Parthasarathi, K., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Acid+instillation+by+a+wedged-catheter+method+reveals+a+role+for+vascular+gap+junctions+in+spatial+expansion+of+Acid+injury.">Localized Acid instillation by a wedged-catheter method reveals a role for vascular gap junctions in spatial expansion of Acid injury.</a> Anat Rec (Hoboken). 294, 1585-1591 (2011).</li><li>Gorin, A. B., Stewart, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+permeability+of+endothelial+and+epithelial+barriers+to+albumin+flux.">Differential permeability of endothelial and epithelial barriers to albumin flux.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 47, 1315-1324 (1979).</li><li>Boutoille, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp Lung Res. 35, 263-271 (2009).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+heterogeneity+of+pulmonary+endothelial+cells.">Functional and molecular heterogeneity of pulmonary endothelial cells.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 453-457 (2011).</li><li>Ofori-Acquah, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+barrier+function+in+the+lung+reflects+diversity+in+endothelial+cell+junctions.">Heterogeneity of barrier function in the lung reflects diversity in endothelial cell junctions.</a> Microvasc Res. 75, 391-402 (2008).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+endothelium-mediated+leukocyte+retention+in+LPS-treated+lung+microvessels.">Real-time imaging reveals endothelium-mediated leukocyte retention in LPS-treated lung microvessels.</a> Microvasc Res. 83, 323-331 (2012).</li><li>Kandasamy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+endoplasmic+store+Ca2+-dependent+inflammatory+responses+in+lung+microvessels.">Lipopolysaccharide induces endoplasmic store Ca2+-dependent inflammatory responses in lung microvessels.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Qiao, R. L., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmental+barrier+properties+of+the+pulmonary+microvascular+bed.">Segmental barrier properties of the pulmonary microvascular bed.</a> J Appl Physiol. 71, 2152-2159 (1991).</li><li>Parthasarathi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+connexin43+mediates+acid-induced+increases+in+pulmonary+microvascular+permeability.">Endothelial connexin43 mediates acid-induced increases in pulmonary microvascular permeability.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303, (2012).</li><li>Wu, Y., Perlman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+methods+for+assessing+alveolar+mechanics.">In situ methods for assessing alveolar mechanics.</a> J Appl Physiol 1985. 112, 519-526 (2012).</li><li>Kuebler, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+signaling+mechanism+between+gas+and+blood+compartments+of+the+lung.">A novel signaling mechanism between gas and blood compartments of the lung.</a> Journal Clin Invest. 105, 905-913 (2000).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

La préparation du poumon sang perfusé isolé couplé avec l&#39;imagerie en temps réel fournit un outil simple pour la détermination des changements de perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires simples. Nous avons appliqué cette méthode pour définir les changements de perméabilité en réponse aux perfusions de LPS. Nos données indiquent clairement que l&#39;infusion de LPS a provoqué une augmentation de la perméabilité microvasculaire. En outre, les données indiquent également que les modificatio...

Augmentation de la perméabilité microvasculaire dans les poumons entraîne l&#39;apparition d&#39;un œdème alvéolaire et l&#39;échange de gaz compromis et est une caractéristique majeure de lésion pulmonaire aiguë (ALI) 1-3. Ainsi, les estimations de la perméabilité vasculaire sont importantes pour définir l&#39;étendue des lésions pulmonaires et l&#39;efficacité des interventions thérapeutiques proposées. Analyse gravimétrique comme le sang poumon libre rapport humide à sec et le coefficient de filtration microvasculaire sont largement utilisés méthodes pour estimer la perméabilité 4,5. D&#39;autres procédés comprennent la quantification de la rétention de sondes radioactives ou fluorescentes dans le tissu du poumon 8.6. Cependant, les procédés ci-dessus nécessitent un traitement postexperiment d&#39;échantillons de tissus pulmonaires vers l&#39;élucidation des données de perméabilité. En outre, depuis un animal peut être utilisé pour un protocole de traitement unique, un grand nombre d&#39;animaux peuvent être nécessaires pour une étude complète. Une caractéristique commune de ces méthodes est qu&#39;elles déterminent la perméabilité vasculaire moyen pourtous les vaisseaux sanguins au sein de l&#39;échantillon de tissu. Toutefois, il est bien établi que les micro-et macro-vaisseaux pulmonaires sont phénotypiquement différentes 9. Par conséquent, les réponses de la perméabilité peuvent être hétérogènes entre les différents segments de vaisseaux ainsi 9,10. Ainsi, la quantification de la perméabilité moyenne de tous les vaisseaux pulmonaires dans un échantillon de tissu peut ne pas refléter adéquatement cette hétérogénéité. Dans la préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, les vaisseaux sanguins à la surface du poumon peuvent être visualisées par un microscope droit 4,11,12. Cela permet réponses caractérisant dans les vaisseaux uniques et donc, aborder toute hétérogénéité dans les réponses 13. En outre, en utilisant l&#39;imagerie de fluorescence des microvaisseaux, à base de fluorescence analyses peuvent être incorporés. De plus, un micro-cathéter auriculaire gauche peut être utilisé pour délivrer des agents et des sondes de fluorescence dans les vaisseaux sanguins 11,14. Microcathéter limite la livraison à une petite région du poumon, ainsi exposant seulement les vaisseaux sanguins dans la région des agents infusées et des fluorophores. Cela permet à plusieurs petites régions d&#39;un même poumon à être utilisés pour des expériences séparées, conduisant à une réduction globale des animaux nécessaires pour une étude. Imagerie en temps réel permet la capture de l&#39;évolution dynamique vasculaire et fluorescence extravasculaire des microvaisseaux uniques de la préparation du poumon isolé. Ainsi, pour chaque microvaisseaux dans un champ d&#39;image, les changements de fluorescence au cours de la perfusion de fluorophores et lessivage peuvent être enregistrées, et quantifiés en ligne 14. L&#39;utilisation de valeurs de fluorescence maximale et résiduelle vasculaire, un indice de perméabilité pour chaque microvaisseaux dans le domaine de formation d&#39;image peut être déterminé. Pour déterminer les changements de perméabilité en réponse à des agents anti-inflammatoires ou dommageables, l&#39;agent désiré peut être administré en premier, puis l&#39;indice de perméabilité déterminée. En outre, le champ d&#39;image peut être réglée à l&#39;intérieur de la région des poumons infusée par l&#39;microcathéter, ce qui permet un degré élevé de flexibilité dans le choix du réseau vasculaire souhaitée. Ainsi, la préparation du poumon isolé perfusé de sang en tandem avec une imagerie en temps réel fournit un modèle expérimental attrayant pour quantifier la perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires uniques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:297px;">#18</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:108px;">Data Sciences International</td>
			<td style="width:119px;">P23XL</td>
			<td>Need quantity 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butterfly Needle</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-One</td>
			<td align="right" style="width:119px;">450081</td>
			<td>21G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:108px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex L/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-90 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427421</td>
			<td>30 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PE-10 tubing</td>
			<td style="width:108px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">427401</td>
			<td>40 cm needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:108px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BS8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O-ring</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made with a 20 mm diamter hole&#160; and a handle&#160; to secure o-ring to holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:108px;">Olympus America</td>
			<td style="width:119px;">BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Image Acquisition Software</td>
			<td style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Metamorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC Dextran 20KD</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.5 mg/ml (A dextran of different molecular size can be selected, if trial experiments indicate its suitability based on the calculated permeability index values)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Serotype 0111:B4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying single microvessel permeability in isolated blood-perfused rat lung preparation

La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé est largement utilisé pour visualiser et définir la signalisation dans les microvaisseaux simples. Par couplage de cette préparation avec une imagerie en temps réel, il devient possible de déterminer les changements de perméabilité dans les microvaisseaux pulmonaires individuels. Nous décrivons ici les étapes pour isoler les poumons de rats et de les perfuser avec du sang autologue. Ensuite, nous présentons des mesures pour insuffler fluorophores ou des agents via un micro-cathéter dans une petite région du poumon. L&#39;utilisation de ces procédures décrites, nous avons déterminé perméabilité augmente chez le rat microvaisseaux pulmonaires en réponse aux perfusions de lipopolysaccharide bactérien. Les données ont révélé que le lipopolysaccharide augmenté fuite de fluide dans les deux segments de veinules et capillaires microvaisseaux. Ainsi, cette méthode permet de comparer les réponses de la perméabilité entre les segments vasculaires et ainsi, définir une hétérogénéité dans la réponse. Bien que les méthodes couramment utilisées pour définir la perméabilité pulmonaire post-traitement nécessitent des échantillons de tissus du poumon, leutilisation de l&#39;imagerie en temps réel permet d&#39;éviter que cette exigence évidente à partir de la présente méthode. Ainsi, la préparation du poumon isolé combinée avec l&#39;imagerie en temps réel offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles pour déterminer microvasculaire pulmonaire perméabilité, mais est une méthode simple à développer et à mettre en œuvre.

Une préparation de poumon de sang perfusé isolé relié à la tubulure de perfusion et de l&#39;équipement correspondant est représenté sur la figure 2. Des fins de démonstration, nous avons utilisé un rat Sprague Dawley, bien que les modes opératoires décrits ici peuvent être utilisés avec n&#39;importe quelle espèce de rat. Infusions à travers un microcathéter auriculaire gauche atteignent seulement une petite région du poumon. La région infusé peut être identifié par la coloration ...

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Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, il est possible de visualiser des réseaux microvasculaires à la surface du poumon. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier la perméabilité des microvaisseaux simples dans les poumons isolés en utilisant l&#39;imagerie de fluorescence en temps réel.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

quantifying-single-microvessel-permeability-isolated-blood-perfused

Research

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Biology

9.4K vues.  The University of Tennessee Health Science Center.  La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, il est possible de visualiser des réseaux microvasculaires à la surface du poumon. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier la perméabilité des microvaisseaux simples dans les poumons isolés en utilisant l'imagerie de fluorescence en temps réel. 

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Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

Préparation standardisée des suspensions unicellulaires provenant de tissus pulmonaires de la souris en utilisant les dissociateur gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Recherche

Biologie

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured with independent control over pulmonary arterial flow rate, flow rate waveform, airway pressure and left atrial pressure. Pulmonary vascular resistance is calculated based on multi-point, steady pressure-flow curves; pulmonary vascular impedance is calculated from pulsatile pressure-flow curves obtained at a range of frequencies. As now recognized clinically, impedance is a superior measure of right ventricular afterload than resistance because it includes the effects of vascular compliance, which are not negligible, especially in the pulmonary circulation. Three important metrics of impedance - the zero hertz impedance Z0, the characteristic impedance ZC, and the index of wave reflection RW - provide insight into distal arterial cross-sectional area available for flow, proximal arterial stiffness and the upstream-downstream impedance mismatch, respectively. All results obtained in isolated, ventilated and perfused lungs are independent of sympathetic nervous system tone, volume status and the effects of anesthesia. We have used this technique to quantify the impact of pulmonary emboli and chronic hypoxia on resistance and impedance, and to differentiate between sites of action (i.e., proximal vs. distal) of vasoactive agents and disease using the pressure dependency of ZC. Furthermore, when these techniques are used with the lungs of genetically engineered strains of mice, the effects of molecular-level defects on pulmonary vascular structure and function can be determined.

The following protocol outlines the process of isolating, ventilating and instrumenting mouse lungs to measure steady or pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships in order to quantify the effects of blood flow, airflow, airway changes and vascular changes on right ventricular afterload.

Caractérisation des isolés, ventilés et instrumentés poumons de souris perfusées avec un flux pulsatile

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

La Ex vivo Préparation isolé microvaisseaux squelettique pour les enquêtes de la réactivité vasculaire

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test de chimiotaxie amélioré pour l’identification rapide des chimioattractifs rhizobactériens dans les exsudats racinaires

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...