SL a été soutenu par une bourse de recherche de la DFG (Graduate School Research 845). Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;(530/C1 SFB &amp; POUR 967) et par la DFG HOMFOR.

1. Préparation des solutions mères <ol><li> Préparer sans calcium tampon (140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM de glucose dans 10 mM HEPES-KOH (pH 7,35)). </li><li> Solubiliser FURA-deux heures dans le DMSO pour obtenir une solution à 1 mM. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex jusqu&#39;à ce que la solution est jaune clair homogène. Protéger la Coupe de la lumière. Diluer le FURA-deux heures solution mère dans 1 ml Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à une concentration finale de 4 uM pour le chargement des cellules HeLa. </li><li> Préparer une solution stock de 12,5 mM puromycine dans l&#39;eau distillée (pH 7,0). Aliquotes Conserver à -20 ° C. Diluer la solution 12,5 mM puromycine stock dans la mémoire tampon sans calcium à une concentration finale de 500 uM puromycine. </li><li> Dissoudre thapsigargine dans le DMSO pour obtenir une solution à 1 mM. </li><li> Solubiliser 1 mg ophiobolin A dans 20 ul de chloroforme et, ultérieurement, mélanger avec 25 ul de DMSO. Le microtube reste ouverte jusqu&#39;à chloroforme est évaporé. Ainsi, la dernière ophiobolin Une concentration est de 100 mm. Aliquotes Conserver à -20 ° C. Avant l&#39;utilisation, des solutions diluées d&#39;actions en calcium sans tampon à une concentration finale de 100 uM. Ainsi, la concentration finale de DMSO pour l&#39;imagerie de cellules vivantes ne dépasse pas 0,1%. </li><li> Dissoudre trifluopérazine dans le DMSO à une concentration de 10 mM et stocker des aliquotes à -20 ° C. Des solutions diluées d&#39;actions en calcium sans tampon à une concentration finale de 10 uM avant l&#39;utilisation. Ainsi concentration finale de DMSO pour l&#39;imagerie de cellules vivantes, comme pour ophiobolin A, ne dépasse pas 0,1%. </li><li> Dissoudre les siRNA (SEC61A1 siARN, SEC61A1-UTR siRNA et siRNA contrôle) en eau libre de RNase pour préparer une solution stock de 20 pM. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex et d&#39;observer la solubilisation par l&#39;œil. Magasin de 50 aliquotes à -20 ° C. </li></ol> 2. Extinction de gène dans les cellules HeLa Afin d&#39;étudier l&#39;apport d&#39;une certaine protéine d&#39;ER d&#39;efflux de Ca 2 +, le gène respectives doit être efficacement réduit au silence avec deux siRNA différents (Fig. 1). En outre, l&#39;effet de l&#39;inactivation doit être surmontée par l&#39;expression du gène de type sauvage respectif. Typiquement, nous utilisons des siRNA qui sont dirigées contre le codage et la non-codantes (UTR) région, respectivement, du gène d&#39;intérêt. Employant UTR-dirigé siARN fournit un moyen commode pour la complémentation. <ol><li> Seed 5,2 x 10 5 cellules HeLa (ATCC pas. CCL-2) dans une boîte de culture de 6 cm avec un glissement de 25 mm de couverture (pré-traitées avec 200 pi de poly-L-lysine (1 mg / ml) pendant 1 h) dans Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine et incuber à 37 ° C dans un environnement humidifié avec 5% de CO 2 (volume final 3,9 ml). </li><li> Transfecter les cellules avec SEC61A1 siARN, SEC61A1-UTR siARN, ou un siRNA contrôle négatif en utilisant le réactif HiPerFect conformément aux instructions du fabricant (concentration finale de siRNA: 20 nM). En bref, préparer siRNA fraîchement dans un microtube distincte avant la procédure de transfection réelle: Ajouter 20 ul de réactifs de transfection HiPerFect à 4 pl de chaque siARN (20 uM), qui est dissous dans 80 ul de OptiMEM. Ce mélange est doucement agité et incubé à température ambiante pendant 10 min. Ajouter le mélange de siRNA (104 ul) goutte à goutte à l&#39;5,2 ensemencé x 10 5 cellules HeLa (3,9 ml). </li><li> Après 24 h, changer le milieu (3,9 ml) et transfecter des cellules pour une deuxième fois avec le mélange de siARN mêmes (104 pl). </li><li> Évaluer taire par analyse Western blot. Il devrait être supérieure à 80%. Laver les cellules de la boîte de culture de cellules dans un tampon phosphate salin (PBS) et les récolter en DMEM. Compter les cellules en utilisant le compteur cellulaire automatisé comtesse. Lyse des cellules dans un tampon de lyse cellulaire (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, MgCl2 3 mM, 0,5% NP40) complété avec un cocktail de protéase-inhibiteur (3 ug / ml pepstatine A, 3 mg / ml de leupeptine, 3 pg / ml antidouleur, 3 ug / ml Chymastatin) et mélanger avec SDS-tampon d&#39;échantillon (60 mM Tris-HCI, pH 6,8, SDS 2%, glycérol 10%, 5% β-mercaptoéthanol, 0,01% bleu de bromophénol ) pour obtenir une concentration finale de 10.000 cellules / ul. Échantillons de chaleur à 56 ° C pendant 15 minutes et, ensuite, ajouter quelques perles de verre et de vortex pendant 20 min pour un fragment d&#39;ADN. Séparée 20 ul de chaque échantillon par un type Laemmli SDS-PAGE (typiquement 15% de polyacrylamide pour le gel de séparation). Transfert protéines séparées sur une membrane de PVDF par électrotransfert («wet-blot&quot;) à prix constants 400 mA pendant 3 h ou toute la nuit dans un tampon de transfert (100 mM glycine, 12,5 mM de Tris-HCl). Ensuite, un bloc de 5% (p / v) lait faible en gras séché dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, puis d&#39;exposer la tache à l&#39;anticorps primaires dirigés contre l&#39;extrémité C-terminale Sec61α de lapin et un anti-β-actine d&#39;anticorps de souris. Lavez la tache dans PBS-TritonX-100 (0,05%) et tWICE dans du PBS pendant 5 min, respectivement. Visualisez les anticorps primaires en utilisant ECL Plex chèvre anti-IgG de lapin-Cy5 ou ECL Plex chèvre anti-IgG de souris-Cy3-conjugué et le système d&#39;imagerie Typhoon-Trio en combinaison avec l&#39;image Quant TL 7.0 du logiciel. Dans le cas du gène SEC61A1, l&#39;effet maximal taire est généralement considérée 96 h après la transfection d&#39;abord. Une expérience représentative est montré dans la Fig. 2. </li></ol> 3. La complémentation des cellules HeLa Afin de sauver le phénotype des SEC61A1 taire, l&#39;ADNc a été inséré dans SEC61A1 le site de clonage multiple (MCS) d&#39;un site interne d&#39;entrée pCDNA3-ribosomiques (IRES)-GFP-vecteur qui contenait le cytomégalovirus (CMV), le MCS, l&#39;IRES, plus la protéine fluoresecent verte (GFP) séquence codante. <ol><li> 48 h après la transfection de siRNA d&#39;abord, l&#39;échange de la moyenne (3,9 ml) pour une deuxième fois et transformer les cellules avec soit vecteur vide ou SEC61A1 plasmide d&#39;expression en utilisant Fugene HD selon le protocole du fabricant (rapport final de vecteur à Fugene HD est de 4 mg vectoriel à 16 ul HD Fugene). En bref, préparer les plasmides fraîchement dans un microtube distincte avant la procédure de transformation: Ajouter 16 ul réactif Fugene transformation HD à 4 pg de chaque plasmide qui est dissous dans 80 ul de OptiMEM. Vortexer doucement ce mélange et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min. Ajouter le mélange de plasmide (0,1 ml) goutte à goutte au ensemencé 5,2 x 10 5 cellules HeLa (3,9 ml). </li><li> Après 48 h de plasmide d&#39;expression, des boîtes de culture soumis à la microscopie par fluorescence avant l&#39;imagerie calcique et la récolte. Si nécessaire, remplacer DMEM par PBS pour une meilleure signaux de fluorescence. Enregistrer des images de fluorescence sur un microscope à fluorescence équipé d&#39;une caméra CCD refroidie. Efficacité de transformation peut être déterminée en divisant le nombre de cellules présentant fluorescence de la GFP par les cellules comptées dans le mode clair et devrait être supérieur à 80%. Un résultat typique est montré dans la Fig. 3. </li></ol> 4. Direct imagerie calcique cellulaire <ol><li> Avant la mesure, le transfert de la lamelle revêtement avec des cellules HeLa transfectées dans une boîte de culture séparée 3,5 cm. Chargez les cellules avec 4 pM FURA-deux heures dans 1 ml de DMEM pendant 45 min à 25 ° C dans l&#39;11,12 sombre. </li><li> Correction d&#39;un bordereau de 25 mm de couverture dans la chambre de métal iMic et laver les cellules deux fois et les incuber dans un tampon sans calcium (à chaque fois 300 pl.) </li><li> Commencer à recueillir des données sur un microscope iMic polychrome V par alternance passionnante à 340 nm et 380 nm et en mesurant la fluorescence émise à 510 nm (set de filtre: lame séparatrice, 565 nm; émetteur, nm 605/70). Exemples d&#39;images contenant de 20 à 50 cellules / image toutes les 3 s. Enregistrement Fura-2 signaux que le ratio F340/F380, où F340 et F380 correspondent à l&#39;arrière-plan soustrait l&#39;intensité de fluorescence à 340 et 380 nm, respectivement. </li><li> Après 1 min, traiter les cellules avec puromycine (500 uM) en calcium sans tampon ou avec le même tampon. Sinon, le traitement des cellules avec un inhibiteur de petite taille (par exemple 10 ou 100 uM trifluopérazine uM ophibolin A) ou avec le tampon sans calcium. </li><li> Après les mesures ratiométrique sont effectuées pour 2 ou 10 min, ajouter thapsigargine (1 pM) et de continuer les mesures. </li><li> Finalement, cytoslic [Ca 2 +] est estimée à partir de mesures du rapport par une méthode d&#39;étalonnage établie 2. Analyser les données par Excel 2007 et d&#39;origine 6.1. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Jusqu&#39;ici, nous avons abordé la question de savoir si silençage du gène affecte SEC61A1 calcium (Ca 2 +) des fuites à partir du RE (figure 1). Le gène a été réduit au silence SEC61A1 par deux différents siRNA dans les cellules HeLa pendant 96 heures. Alors que faire taire la croissance cellulaire à peine touché et la viabilité, le transport des protéines dans le RE de cellules de semi-perméabilisées était presque complètement inhibée. En outre, les cellules SEC61A1 silence ont été gravement touchées à l&#39;égard de Ca 2 + de fuite de l&#39;ER. L&#39;effet de l&#39;inactivation des gènes a été infirmée par l&#39;expression du gène SEC61A1. Ainsi, Sec61 complexes qui sont présents dans la membrane du RE de toutes les cellules nucléées forme Ca 2 + canaux de fuite qui peut être appelé à jouer un rôle crucial dans l&#39;homéostasie du Ca 2 +. Toutefois, la présence de grandes, de l&#39;eau des pores remplis avec la perméabilité aux ions incontrôlée, comme formé par Sec61 complexes dans la membrane du RE, pourrait nuire sérieusement à la libération régulée de Ca 2 + de la lumière du RE dans le cytosol, un mécanisme essentiel pour intracellulaire signalisation. Nous avons identifié une calmoduline (CaM) motif de liaison à la fraction N-terminale cytosolique de Sec61α mammifères que Cam liés mais pas de Ca 2 + libre apocalmodulin avec une affinité nanomolaire et une spécificité de séquence. Au niveau cellulaire, deux antagonistes CaM différents stimulé Ca <sup&gt; 2 + communiqué de la ER dans la présence mais pas dans l&#39;absence de Sec61 canaux (fig. 4 et 5). Ce dernier n&#39;a pas été observée lorsque Sec61 canaux étaient présents qui contenait des mutations dans le motif de QI de Sec61α. Ainsi, le Ca 2 +-CaM est impliqué dans la limitation des fuites de Ca 2 + du RE (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Organigramme. Voir le texte pour plus de détails. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. L&#39;analyse des données pour faire taire l&#39;efficacité. Taire a été évaluée par Western-blot utilisant des anticorps qui ont été dirigées contre Sec61α et β-actine (contrôle du chargement). Les anticorps primaires ont été visualisées en utilisant des anticorps ECL Plex secondaire et l&#39;imagerie de fluorescence. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. L&#39;analyse des données d&#39;efficacité de la transfection. Les images ont été enregistrées sur un microscope à fluorescence équipé d&#39;une caméra CCD refroidie. Efficacité de transformation peut être déterminée en divisant le nombre de cellules présentant fluorescence de la GFP par les cellules comptées dans le mode fond clair. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Les captures d&#39;écran la figure 4. Partir de l&#39;imagerie cellulaire du calcium en direct de cellules HeLa en présence du contrôle ou des SEC61A1-siRNA et la présence ou l&#39;absence des cellules CaM-antagoniste ophiobolin HeLa A. ont été traités avec siRNA dirigé contre SEC61A1 (B) ou une siRNA contrôle négatif (A) pour 96 h comme indiqué. Ces cellules ont été chargées avec l&#39;indicateur de calcium fura-2 AM et incubés dans un tampon de Ca 2 + libre contenant 0,5 mM, EGTA, puis tampon ou ophiobolin A (Ophio A) dans le tampon a été ajouté et l&#39;incubation a repris. Après 10 min, Ca 2 + communiqué a été initié par l&#39;application thapsigargine (TG) en l&#39;absence de Ca 2 + externe et l&#39;incubation a été poursuivie. Les captures d&#39;écran de l&#39;imagerie calcique en continu ont été prises à l&#39;heure indiquée. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. L&#39;analyse des données pour des expériences d&#39;imagerie de cellules vivantes de calcium. (A) L&#39;analyse cinétique et quantitative d&#39;une série d&#39;expériences comme le montre la Fig. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] a été estimée à partir de mesures du rapport par une méthode d&#39;étalonnage établie 2. L&#39;effet de thapsigargine est montré sous forme de diagramme à barres. (BD) Les cellules ont été traitées avec le siRNA contrôle ou le siRNA-indiquée SEC61A1 pendant 48 h puis transformé avec le vecteur de contrôle soit (C), ou SEC61A1 plasmide d&#39;expression (C), ou mutant SEC61A1 plasmide d&#39;expression (D) comme indiqué. Après 48 h, des expériences d&#39;imagerie calcique ont été réalisées comme dans les figures 4 et 5A. L&#39;analyse statistique des changements dans le Ca 2 + cytosolique de concentration après l&#39;ajout de thapsigargine dans des expériences telles que présentées dans A sont représentés. Les valeurs de p &lt;0,001 ont été définis comme significatifs par un test t non apparié et sont indiqués par trois astérisques (***), ns, non significatif. Le nombre de cellules qui ont été analysés sont indiqués. Les valeurs moyennes sont donnés, barres d&#39;erreur représentent les erreurs standard des moyens (SEM). Nous notons que ces exemples ont été adaptés de réf. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Ces données indiquent que la libération des chaînes naissantes du complexe Sec61 conduit en effet à la libération du calcium du RE et de la formation d&#39;un nanodomain de calcium autour de la bouche cytosolique du complexe Sec61. Ce calcium est lié par la calmoduline et calcium-calmoduline ferme le complexe Sec61. &quot;

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	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. 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Dans les cellules de mammifères, le réticulum endoplasmique (RE) joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines ainsi que dans la signalisation du calcium. Ici, nous avons décrit un système expérimental qui nous permet d&#39;aborder directement le rôle d&#39;un potentiel de Ca 2 + canal de fuite et de caractériser son putatifs des mécanismes de régulation 13. Ce système expérimental nous donne l&#39;occasion unique de i) évaluer la contribution des différentes protéines de la membrane passive ER à l&#39;efflux de Ca 2 + du RE dans divers types cellulaires, ii) de caractériser les protéines et les mécanismes qui limitent cette passive de Ca 2 + efflux, et iii) étudier les effets des mutations dans les maladies liées composantes pertinentes. Nous notons que seules les cellules viables devraient être analysés et que la viabilité globale devrait être supérieure à 80%. Par conséquent, la viabilité cellulaire est évaluée régulièrement employant nucléaires ID réactif bleu / vert viabilité des cellules selon le protocole du fabricant. Par ailleurs, l&#39;analyse statistique des changements dans le cytosol concentration de Ca2 + est obligatoire. Par conséquent, les expériences doivent être réalisées pour quatre lots différents de cellules et de deux lamelles avec au moins 20 cellules doivent être analysés pour chaque condition dans une expérience unique. Nous notons que les différentes expériences doivent être réalisées au même moment après l&#39;ensemencement sur les feuillets de couverture.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> DMEM + glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nucléaire-ID Bleu / Vert réactif viabilité cellulaire </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA-deux heures </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargine </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Un Ophiobolin </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluopérazine </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Comtesse ® Compteur de cellules automatisé </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhon-Trio système d&#39;imagerie </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S microscope avec caméra DS-5Mc </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> Microscope iMic polychrome V </td><td> Jusqu&#39;à la photonique </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

Dans les cellules de mammifères, le réticulum endoplasmique (RE) joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines ainsi que dans la signalisation calcique 1. Le hétérotrimériques Sec61 complexe dans la membrane du RE fournit une voie aqueuse pour les polypeptides nouvellement synthétisés dans la lumière du RE. De récents travaux de différents laboratoires a suggéré que ce complexe peut également hétérotrimériques forme transitoire canaux Ca 2 + fuite de 2-8. L&#39;observation clé de cette idée était que la libération des polypeptides naissants du ribosome et Sec61 complexes par la puromycine conduit à libération transitoire de Ca 2 + du RE. Par ailleurs, il avait été observé in vitro que la protéine de ER luminale BiP est impliqué dans la prévention de la perméabilité aux ions au niveau de l&#39;Sec61 9,10 complexes. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d&#39;aborder directement le rôle du complexe Sec61 que le potentiel de Ca 2 + canal de fuite et de caractériser les mécanismes de régulation de ses putatifs 11-13. Ce système combine gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes de Ca 2 + imagerie 13. Les cellules sont traitées avec des siRNA qui sont dirigées contre le codage et la région non traduite (UTR), respectivement, du gène ou de SEC61A1 un siRNA contrôle négatif. Dans l&#39;analyse de complémentation, les cellules sont co-transfectées avec un vecteur d&#39;IRES-GFP qui permet à l&#39;ARNsi résistant expression de type sauvage SEC61A1 gènes. Puis les cellules sont chargées avec le ratiométrique Ca 2 +-indicateur de fura-2 pour surveiller simultanément les changements dans les cytosolique de Ca 2 + concentration dans un nombre de cellules au moyen d&#39;un microscope à fluorescence. La mesure en continu de Ca 2 + cytosolique permet également à l&#39;évaluation de l&#39;impact de divers agents, tels que la puromycine, inhibiteurs de petites molécules, et thapsigargine le Ca 2 + de fuite. Ce système expérimental nous donne l&#39;occasion unique de i) évaluer la contribution des différentes protéines de la membrane passive ER à l&#39;efflux de Ca 2 + du RE dans divers types cellulaires, ii) de caractériser les protéines et les mécanismes qui limitent cette passive de Ca 2 + efflux, et iii) étudier les effets des mutations dans les maladies liées composantes pertinentes.

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Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Le réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines et dans l&#39;homéostasie calcique. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d&#39;aborder le rôle des canaux Ca2 + de fuite et de caractériser leur putatifs mécanismes de régulation. Ce système implique gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes Ca2 + imagerie.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

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Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

18.0K vues.  Saarland University. Le réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines et dans l'homéostasie calcique. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d'aborder le rôle des canaux Ca2 + de fuite et de caractériser leur putatifs mécanismes de régulation. Ce système implique gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes Ca2 + imagerie.

Vidéo: Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

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Biologie

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Chitosane / ARN interférant nanoparticules Mediated Gene Silencing dans la maladie vectorielle larves de moustiques

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.