Cette technique peut être utilisée pour faire progresser notre compréhension de la manipulation du calcium dans les neurones et de la façon dont le calcium compartimenté peut réguler différents mécanismes importants pour la fonction neuronale in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une imagerie in vivo rapide à plus haute résolution dans des conditions physiologiques chez C. elegans qui peut être combinée avec d’autres outils fluorescents. Cette technique pourrait fournir des informations sur le mécanisme de régulation de la signalisation du calcium dans les neurones dans de nombreux contextes différents.
Par exemple, pendant le vieillissement, les lésions neuronales et la neurodégénérescence. Ennis Deihl, technicien de recherche, fera la démonstration de cette procédure. Kaz Knight, candidat au doctorat, et Rachel Doser, chercheuse postdoctorale de mon laboratoire.
Commencez par cloner les vecteurs d’expression qui contiennent un promoteur suivi d’un indicateur de calcium et de trois UTR principaux de choix. Créer des souches transgéniques de C.elegans par microinjection d’un mélange d’ADN contenant l’ADN de secours Lin-15 plus dans le transgène indicateur de calcium dans la gonade d’un adulte d’un jour C.elegans. Maintenez les vers parents injectés à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la descendance F1 atteigne l’âge adulte.
Sélectionner les adultes transgéniques en dépistant l’absence du phénotype multi-vulvaire. Cela indique l’expression de la matrice chromosomique supplémentaire contenant l’indicateur de calcium. Descendance F1 adulte à passage clonal qui n’a pas le phénotype multi-vulvaire.
Effectuer des expériences sur les générations suivantes des souches transgéniques avec une expression optimale de l’indicateur de calcium. Utilisez un microscope capable d’imager en accéléré à long terme. Localisez le ver sous un objectif à faible grossissement, puis passez à un objectif à fort grossissement pour localiser les neurones.
Acquérir les images à l’aide d’une caméra ultrasensible capable d’acquérir rapidement des images à plus de 50 FPS. Ensuite, utilisez un filtre antipollution standard pour l’indicateur de calcium. Ajoutez un correcteur Z-drift pour l’acquisition de flux d’images de plus de 10 secondes.
Dans un tube de culture en verre de 13 x 100 millimètres, préparez trois millilitres d’agar à 10% en dissolvant de la gélose de qualité moléculaire dans M9 et au micro-ondes pendant plusieurs secondes. Pour fabriquer les tampons d’agar, préparez d’abord deux lames en ajoutant deux couches de ruban adhésif de laboratoire. Placez ensuite une lame de microscope entre les deux lames.
Coupez l’embout d’une pointe de pipette de 1000 microlitres et utilisez-la pour pipeter une petite goutte d’agar au centre de la lamelle de couvercle. Aplatir la gélose en appuyant sur une autre glissière sur le dessus de l’agar. Après refroidissement, coupez la gélose en un petit disque à l’aide de l’ouverture d’un tube de 10 millilitres, puis retirez la gélose environnante.
Ensuite, préparez la solution de laminage de la vers en dissolvant la poudre de muscimol dans M9 pour créer un stock de 30 millimolaires. Diluer le bouillon dans un rapport de un pour un avec des billes de polystyrène pour obtenir la solution de laminage. Pour positionner le ver pour l’imagerie, placez d’abord 1,6 microlitre de la solution à rouler au centre du tampon de gélose .
Ensuite, à l’aide d’un pic de vers préféré, transférer un ver de l’âge désiré dans la solution à rouler sur le tampon de gélose . Attendez environ cinq minutes que le muscimol réduise le mouvement du ver, puis déposez un couvercle de 22 millimètres sur 22 millimètres sur le dessus du tampon de gélose. Pour l’imagerie des neurites dans le cordon nerveux ventral, roulez le ver en faisant légèrement glisser le couvercle.
Pour monter le ver sur le microscope, placez une goutte d’huile d’immersion sur le couvercle. Trouvez le ver à l’aide d’un objectif à faible grossissement en fond clair. Ensuite, passez à l’objectif 100x et localisez le neurite AVA en utilisant l’éclairage du GCaMP ou du mito GCaMP avec le laser d’imagerie de 488 nanomètres.
Pour l’imagerie GCaMP in vivo, ajustez le laser d’imagerie dans les paramètres d’acquisition jusqu’à ce que la fluorescence GCaMP au basilic soit dans la plage médiane de la plage dynamique de la caméra et réglez le temps d’exposition sur 20 millisecondes. Une fois que le neurite AVA est localisé à l’aide de la fluorescence GCaMP à un grossissement 100 fois, réglez le correcteur Z-drift et lancez la mise au point automatique continue. Corrigez manuellement le plan focal si nécessaire avant l’imagerie.
Acquérir un flux d’images à un grossissement 100 fois. À l’aide de ce protocole, le calcium cytoplasmique a été mesuré avec une résolution temporelle et spatiale élevée. L’expression cellulaire spécifique de GCaMP6F dans les interneurones de commande AVA glutamatergique a révélé une propagation directionnelle de l’afflux de calcium.
La quantification subcellulaire de la fluorescence GCaMP6F a montré que l’apparition de l’afflux de calcium était retardée dans une partie du neurite située à seulement 10 micromètres. En outre, les structures dendritiques en forme de colonne vertébrale trouvées le long du neurite AVA ont montré des éclairs dans la fluorescence GCaMP6F qui se sont produits indépendamment de l’activation des neurites et n’ont pas conduit à une propagation de l’afflux de calcium. De plus, les niveaux relatifs de calcium ont été mesurés dans les mitochondries individuelles dans des neurites simples à l’aide d’une souche de ver avec une expression spécifique AVA de l’indicateur de calcium localisé de la matrice mitochondriale mito GCaMP.
Les résultats ont montré l’absorption synchrone d’une quantité relativement importante de calcium dans un sous-ensemble de mitochondries. Plus précisément, l’absorption du calcium dans certaines mitochondries était synchronisée, alors que les mitochondries voisines ne semblaient pas absorber le calcium. De même, des sous-ensembles de mitochondries ont montré une absorption et une libération rapides de petites quantités de calcium.
Cela semblait également être synchrone, mais seulement pour un sous-ensemble de mitochondries. La vitesse et les manipulations fines sont essentielles pour positionner les animaux et conserver la fonction neuronale. La santé animale est également primordiale.
Même un peu de famine est problématique. La partie la plus difficile à apprendre est l’orientation rapide des animaux pour la microscopie confocale sans dommage. Mon conseil est beaucoup de pratique et de bons contrôles.
Ce protocole pourrait être appliqué à des expériences où le calcium est libéré à partir d’autres emplacements subcellulaires dans les neurones, d’autres neurones ou des cellules autres que les neurones dans C. elegans. Parce que cette approche chez C. elegans laisse les animaux intacts, il est possible de répondre aux questions sur la régulation de la manipulation subcellulaire du calcium in vivo dans des neurones uniques d’un système nerveux complet.
