Ce travail a été soutenu par l&#39;Australian Research Council DP0986937 Grant.

Sélection de souches de levures appropriées de contrôle Le dosage repose sur la expérimentateur visuellement l&#39;évaluation de l&#39;accumulation de la fluorescence rouge dans la vacuole de levure. En tant que tel, le dosage est subjective et repose sur la sélection de souches de contrôle appropriés et les conditions de croissance. Un contrôle de type sauvage est utilisé pour indiquer les niveaux de l&#39;autophagie normalement prévu. Comme témoin négatif un null souche pour l&#39;expression de l&#39;un des gènes autophagie base (par exemple, ATG3) est adapté, de telles souches ne peut pas livrer le matériel (par exemple, les mitochondries, noyau) vers la vacuole 1. Transformation de cellules de levure avec de l&#39;ADN plasmidique Les cellules de levure peuvent être facilement rendues compétentes pour la transformation par traitement avec LiAcetate. Les kits commerciaux peuvent être achetés (par exemple, EasyComp, Invitrogen) et les protocoles publiés sont disponibles 13. Dans ce protocole, nous utilisons sauvage BY4741 souche type (MAT <strong&gt; A. His3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), et certains membres d&#39;une bibliothèque complète de souches mutantes de suppression (par exemple, Δ atg3) qui en découlent, chaque expression d&#39;un manque différente gène non essentiel La bibliothèque souche suppression représente un outil précieux pour étudier l&#39;autophagie en utilisant Rosella à base de sondes. Le journaliste a utilisé dans ce protocole est mt-Rosella des mitochondries (figure 2A), codée par pAS1NB: mt-Rosella 12. Les étapes suivantes sont basées sur l&#39;utilisation de cellules rendues compétentes en utilisant le kit de transformation EasyComp et conservés congelés à -80 ° C pour une utilisation pratique. <ol><li> Equilibrer Solution III (EasyComp Transformation Kit) à la température ambiante pendant 30 minutes avant d&#39;ajouter les cellules de levure. </li><li> Ajouter 2 à 2,5 ul (~ 100 ng / ul) de l&#39;ADN plasmidique codant pour le journaliste (pAS1NB: mt-Rosella) à une solution stérile de 1,7 ml snap-cap microtube plastique. </li><li> Ajouter 5 &amp; mu, L de suspension fraîchement décongelé des cellules de levure compétentes et mélanger par pipetage doux. </li><li> Ajouter 50 ul de la solution III (EasyComp Transformation Kit) et vortex pour mélanger. 1,5) Incuber les réactions de transformation de 1 heure à 28-30 ° C avec un mélange vigoureux toutes les 15 minutes à l&#39;aide d&#39;un mélangeur à vortex ou manuellement par agitation du tube avec le doigt. </li><li> Transférer soigneusement le mélange de transformation sur une plaque de gélose unique YMM croissance supplémenté en histidine, la méthionine et l&#39;uracile, et lentement distribuer les cellules autour de la surface de la gélose avec une spatule en verre stérile. Les cellules de levure sont fragiles à ce stade et une manipulation en douceur peut augmenter le rendement des transformants. </li><li> Incuber les plaques de croissance de 2 à 4 jours à 28-30 ° C ou jusqu&#39;à ce que les colonies apparaissent environ 2-3 mm de diamètre. </li></ol> 2. Confirmant l&#39;expression de Rosella dans des cellules de levure Avant de se lancer dans des expériences détaillées de la localisation correcte et efficace expression de Rosella doit être confirmée. <ol><li> En utilisant des cure-dents stériles sélectionner pour chaque 5 déformation des colonies isolées de la plaque de transformation et de remettre les cellules dans 50 ul d&#39;eau stérile à 1,7 ml stériles distinctes composant logiciel enfichable bouchon microtube plastique. </li><li> Placer 10 ul de chaque suspension cellulaire sur différents étiquetés lames de microscope (76 x 26 mm) et couvrent la suspension cellulaire avec une lamelle carré (22 x 22 mm). </li><li> Immédiatement examiner les cellules de l&#39;émission de fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence (par exemple, Olympus Fluoview FV500). Rechercher fluorescence verte et rouge fort et d&#39;étiquetage typique de localisation mitochondriale (Fig. 2B et 2C). </li><li> Le reste de chaque colonie a examiné pour la fluorescence de cette manière doit être inoculé sur une plaque de croissance YMM frais. </li><li> Incuber les boîtes à 28-30 ° C pendant 2 jours jusqu&#39;à colonie sont environ 2-3 mm de diamètre. </li></ol> 3. La croissance cellulaire etl&#39;induction de l&#39;autophagie Autophagie peut être induite en utilisant un certain nombre de différentes conditions expérimentales, dont l&#39;entrée en phase stationnaire, le changement de source de carbone, de l&#39;administration de rapamycine, ou d&#39;azote famine. Nous utilisons régulièrement la famine comme méthode d&#39;azote pour induire mitophagy. <ol><li> Inoculer une colonie isolée dans 10 ml de milieu de culture contenant de l&#39;éthanol et les suppléments auxotrophes appropriés. </li><li> Incuber les cultures de levures à 28-30 ° C avec agitation orbitale (200 rpm) pendant environ 48 heures. Les cellules doivent être en phase de croissance semi-logarithmique. </li><li> Sédimenter les cellules du double des échantillons de 1 ml de la culture dans 1,7 ml stériles snap-cap tubes à centrifuger en plastique par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. Retirez délicatement et jeter le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 1 ml d&#39;eau distillée stérile par remise en suspension suivie d&#39;une centrifugation pour éliminer m résiduelleoyen. </li><li> Après le troisième lavage remettre en suspension les cellules dans 100 ml de milieu de croissance ou de l&#39;azote famine milieu. </li><li> Re-ensemencer les cellules remises en suspension dans 10 ml de milieu de croissance frais ou 10 ml azote famine moyenne. Incuber sous agitation orbitale pendant 6-12 heures pour permettre l&#39;induction de mitophagy. Après la famine préparer des cellules pour la visualisation par microscopie à fluorescence. </li></ol> Remarque: l&#39;étiquetage de la vacuole avec CMAC-Arg Lors de la première place du test, il est utile pour confirmer la livraison sous microscope à fluorescence de Rosella à la vacuole. Bien que la vacuole de la levure est un organite grande dont la localisation peut souvent être facilement déterminée par référence à des images transmises lumière, dans certaines souches de levure et sous certaines conditions de croissance de la vacuole peut être fragmentée et difficile à localiser. La vacuole peut être facilement marquée en utilisant un colorant à base de coumarine tels que vacuole CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, la L-arginine amide). L&#39;action des protéases vacuolaires sur les résultats de colorant dans l&#39;étiquetage de fluorescence bleu vif de la vacuole. L&#39;émission bleue peuvent être facilement distingués des émissions rouge et verte de Rosella 11. Le marquage avec CMAC-Arg n&#39;a pas besoin d&#39;être réalisée en routine, mais il est recommandé pour ceux qui ne sont pas familiers avec l&#39;emplacement et l&#39;apparence de la vacuole dans la levure. 4. L&#39;étiquetage de la vacuole avec CMAC-Arg <ol><li> Ajouter le CMAC-Arg (100 mM de concentration finale) pour les cellules en croissance ou en manque d&#39;azote avant l&#39;imagerie. La solution CMAC-Arg peut être préparé à l&#39;avance, mais que la solution est sensible à la lumière dont il a besoin d&#39;être protégé contre l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Incuber à 28-30 ° C avec agitation orbitale (200 rpm) pendant 30 minutes. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules trois fois avec distillée stérilepar remise en suspension de l&#39;eau suivie d&#39;une centrifugation pour enlever des résidus du fluide et de l&#39;excès CMAC-Arg colorant. </li><li> Monter les cellules pour l&#39;imagerie tel que décrit ci-dessous. </li></ol> 5. Montage des cellules de levure vivantes pour la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) <ol><li> Fondre 2 mg de l&#39;agarose bas point de fusion distincts en aliquots de 1 ml de milieu de croissance et de l&#39;azote famine support par incubation à 70 ° C. L&#39;agarose fondu est maintenue à 70 ° C. </li><li> Délicatement les cellules de granulés aliquotes de 1 ml de chaque culture cellulaire par centrifugation à 2000 xg pendant 2 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 1 ml d&#39;eau distillée stérile par remise en suspension et centrifugation comme à l&#39;étape 5.2. </li><li> Remettre en suspension les cellules lavées dans 100 ul d&#39;eau distillée stérile. </li><li> Pour monter l&#39;endroit cellules 20 pl d&#39;agarose fondu sur une lame de microscope en verre marquée (76 x 26 mm). </li><li> Détecter immédiatement 10 pi de l&#39;lavé cell suspension sur le lit d&#39;agarose. </li><li> Couvrir le lit d&#39;agarose avec une lamelle (22 x 22 mm). Les cellules seront répartis sur la surface d&#39;agarose sous la lamelle. </li><li> Pour prévenir la déshydratation et le mouvement de la lamelle lors de l&#39;imagerie soin de sceller les bords de la lamelle d&#39;une fine pellicule de vernis à ongles. </li><li> Lorsque le vernis est complètement sec (10 min), la diapositive est prêt à afficher par microscopie de fluorescence Attention: vernis à ongles peut causer des dommages aux objectifs de microscope. </li><li> Les cellules montées en utilisant cette technique peut être observée jusqu&#39;à 1 heure après le montage. </li></ol> 6. Autophagie visualiser à l&#39;aide CLSM Le niveau de l&#39;autophagie dans une population de cellules est régulièrement évaluée en déterminant le nombre de cellules présentant une fluorescence rouge vacuolaire avant et après l&#39;induction de l&#39;autophagie. Idéalement, la progression de l&#39;autophagie est surveillé à des moments choisis suivant l&#39;induction de l&#39;autophagie (fig. 3). Le mieux est effectué en visualisant à travers les jumelles microscope. Il est important que les contrôles appropriés sont utilisés (par exemple, Δ atg3 mutant) et que les réglages du microscope restent inchangés entre l&#39;observation des échantillons différents (par exemple, utilisation de filtres de densité neutre, filtre de sélection). Les cellules de levure sont relativement faibles nécessitant un microscope à fluorescence de bonne qualité (par exemple, Olympus Fluoview FV500) équipé d&#39;excitation / émission des filtres appropriés pour la visualisation séparée de la GFP et / ou pHluorin (fluorescence verte d&#39;émission) (filtre FITC) et DsRed.T3 (rouge émission de fluorescence) (TRITC filtre). <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un point de vue objectif 60x eau non affamés cellules de type sauvage en utilisant alternativement les filtres FITC et TRITC. Cellules de type sauvage doit présenter une distribution cellulaire typique des mitochondries à la périphérie des cellules qui montrent une fluorescence rouge et vert. Noter que cette répartition des mitochondries dépend de la Pinhole réglage du microscope confocal. On utilise généralement une valeur inférieure à sténopé de 125 um, qui permet seulement les mitochondries à être observé comme une série de points localisés à la périphérie de la cellule (Fig. 2C), de sorte que la vacuole est non masquée 12. Si une valeur élevée de trou d&#39;épingle (200 um) est utilisé, il permet au réseau filamenteux typique mitochondrial distribués dans toute la cellule (et les changements qu&#39;elle subit) à observer 11. Pas d&#39;autres structures dans la cellule doit être marqué par fluorescence. </li><li> Voir successivement les cellules pour chacun des points dans le temps après le transfert à moyen famine. Visualiser en alternance à l&#39;aide des filtres d&#39;émission verte et rouge. À la 6 famine h heure du point de fluorescence rouge, mais pas d&#39;émission correspondant verte doit être perceptible dans la vacuole. Localisation vacuolaire peut être confirmé en utilisant séparément CMAC-Arg (Fig. 2C). Voir ~ 200 cellules et compter le nombre qui montrent que la fluorescence rouge dans levacuole (c.-à-absorption vacuolaire des mitochondries). </li><li> Comptez accumulation vacuolaire pour tous les points de temps d&#39;observation&gt; 200 cellules, puis de pourcentage parcelle de cellules présentant une accumulation vacuolaire. </li><li> Examiner les cellules de contrôle autophagie négatives exprimant mt-Rosella avant la famine et la faim après 6 h. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Ici, nous montrons des résultats typiques obtenus en utilisant mt-Rosella, exprimée en type sauvage et Δatg3 cellules mutantes. Dans des conditions de culture avec de l&#39;éthanol comme source de carbone, à la fois sauvage et Δatg3 cellules mutantes présentent une distribution cellulaire de fluorescence (rouge et vert) typique des mitochondries dans les cellules de levure. Rouge et verte fluorescence d&#39;émission n&#39;est pas détecté dans la vacuole (Fig. 2B et 2C). Lorsqu&#39;il est soumis à la famine azote pendant 6 heures et au-delà, puis, en plus de la fluorescence rouge et verte correspondant à des mitochondries, cellules de type sauvage aussi expol&#39;accumulation des bits rouge, mais pas de fluorescence verte dans la lumière vacuolaire (Fig. 2B;. Fig 3). Cependant, dans Δatg3 cellules mutantes ni rouge, ni verte fluorescence s&#39;accumule dans la lumière vacuolaire (Fig. 2C;. Fig 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Haut, le régime des organites et des compartiments dans une cellule de levure. Fond, une vue vacuole centrée sur une cellule de levure est présenté indiquant la dégradation autophagique de différents organites et les compartiments. Certaines des différences entre les divers organites spécifiques types d&#39;autophagie (par exemple, mitophagy, nucleophagy) comprennent la spécificité (sélection fret) du contenu englouti, divers besoins intracellulaires et extracellulaires indices (par exemple, la famine, les dommages), des signaux spécifiques, ATG gènes et en fonction du temps. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Figure 2a" /&gt; <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Figure 2b" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Figure 2c" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Figure 2d" /> Figure 2. Représentation schématique (A) du mt-Rosella. La séquence leader mitochondrial (dans ce cas, de la citrate synthase) est utilisé pour cibler le biocapteur Rosella à la matrice mitochondriale. Excitation et d&#39;émission pour les deux maxima protéine fluorescente rouge (DsRed.T3) et la protéine fluorescente verte (pHluorin) sont indiqués. A un pH élevé (pH ~ 8,2 mitochondrial) le biocapteur fluorescent rouge et vert, cependant, à un pH bas (pH vacuolaire ~ 5,5), il émet une fluorescence rouge seulement. (B) Représentation schématique des résultats escomptés de type sauvage et Δ atg3 cellules mutantes exprimant mt-Rosella. (C) Les résultats réels obtenus par CLSM pour les cellules de type sauvage et des conditions de plus en plus sous azote famine. De gauche à droite: DIC (difrence de contraste), DP (DsRed.T3) d&#39;émission de fluorescence, la GFP (pHluorin) d&#39;émission de fluorescence, CMAC-Arg fluorescence et de l&#39;image de fusion. (D) Les résultats réels obtenus par microscopie à fluorescence pour Datg3 cellules mutantes moins de croissance et des conditions de famine azote. De gauche à droite: DIC (différence de contraste), DP (DsRed.T3) d&#39;émission de fluorescence, la GFP (pHluorin) d&#39;émission de fluorescence, CMAC-Arg fluorescence et de l&#39;image de fusion. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Le pourcentage de type sauvage et Δ atg3 cellules mutantes, exprimant mt-Rosella et cultivés dans la famine azote, montrant une fluorescence rouge dans la vacuole au cours d&#39;une évolution dans le temps de 48 heures. Le pourcentage de cellules présentant une accumulation de fluorescence rouge dans la vacuole a été enregistrée à 0, 6, 12, 24 et 48 heures après le début de la famine azote.

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Dans les images représentatives présentés dans la figure. 2B et 2C, on peut voir clairement que l&#39;utilisation des organites spécifiques rapporteurs fluorescents et microscopie de fluorescence fournit la preuve de la localisation mitochondriale / distribution à la fois dans la croissance et de l&#39;azote cellules privées, et permet mitophagy à visualiser. Il est à souligner que cette méthode n&#39;est pas limitée à mitophagy suivante. L&#39;autophagie des autres composants cellulaires ou des organelles (par exemple, les ribosomes, des gouttelettes lipidiques, les peroxysomes, réticulum endoplasmique et le noyau) peut être surveillée par un étiquetage approprié. Les détails de la construction biocapteur Rosella, conditions de culture cellulaire et des résultats typiques de chiffre d&#39;affaires du noyau (nucleophagy) ont été signalés 11,12 illustrant l&#39;application plus large de la méthode. Utilisez des organites spécifiques rapporteurs fluorescents pour l&#39;autophagie surveillance nécessite plusieurs considerations de la conception de construction à garder à l&#39;esprit. Il s&#39;agit notamment de: (1) la sélection et la fusion au signal de ciblage appropriée pour atteindre organite spécifique ciblage, (2) la sélection d&#39;une protéine fluorescent approprié (s), (3) une forte émission de fluorescence, (4) la localisation correcte des organites et / ou la distribution à l&#39;intérieur de la cellule. Une fois que le journaliste organite spécifique a été exprimé avec succès chez la levure hôte choisi la souche d&#39;un deuxième groupe de considérations deviennent: (1) les conditions de croissance de levures, (2) la préparation d&#39;échantillons de cellules, (3) les paramètres d&#39;imagerie car il est important que les paramètres choisis pour CLSM (par exemple, l&#39;intensité du laser, la vitesse de balayage et le mode, la valeur sténopé, valeur de zoom, les objectifs utilisés ou d&#39;exposition pour caméra CCD) sont maintenues pendant toute une expérience en sorte que des comparaisons peuvent être faites entre le contrôle (cellules en croissance) et des échantillons affamés; ( 3) l&#39;induction autophagie et la livraison réussie du journaliste dans la vacuole. Dans l&#39;ensemble, cette méthode microscopie à fluorescence il&#39;application est facile, relativement rapide, et dispose d&#39;un potentiel de criblage à haut débit pour de nouveaux médicaments qui favorisent ou inhibent l&#39;autophagie, et aussi pour les gènes qui régulent ou modulent l&#39;autophagie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / équipement </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformation Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Yeast nitrogen base sans acides aminés et de sulfate d&#39;ammonium </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Bas point de fusion d&#39;agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Lames de microscope (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td></tr><tr><td> Des lamelles de microscope (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Laser microscope confocal à balayage Fluoview FV500 </td><td> Olympe </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Sondes-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Toutes les concentrations donnée arew / v, sauf indication contraire. Milieu de levure minimale (YMM): 0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, glucose 2%, agar-agar 1,5% (seulement ajouter pour les milieux solides) et les suppléments nécessaires auxotrophes (0,01%)]. Sels de Saccharomyces (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MGC1 2 .6 H 2 O, 0,07%; NaC1, 0,05%; CaCl2, 0,01%; FEC1 3, 0,0005%. Un milieu de croissance: SS et 2% d&#39;éthanol (v / v) et des suppléments auxotrophes appropriés. De l&#39;azote famine moyen: 0,17% de base azotée de levure sans acides aminés et de sulfate d&#39;ammonium (Difco), 2% d&#39;éthanol (v / v).

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

L&#39;autophagie est important de chiffre d&#39;affaires des composants cellulaires dans un éventail de conditions différentes. Il remplit une fonction essentielle homéostatique ainsi que d&#39;un mécanisme de contrôle de la qualité qui peuvent cibler sélectivement et dégradent la matière cellulaire, y compris organelles1-4. Par exemple, endommagées ou redondantes mitochondries (Fig. 1), ne sont pas éliminés par autophagie, peut représenter une menace pour l&#39;homéostasie cellulaire et la survie cellulaire. Chez la levure, Saccharomyces cerevisiae, une carence en nutriments (par exemple, la famine azote) ou des dommages peuvent favoriser chiffre d&#39;affaires sélective des mitochondries par autophagie dans un processus appelé mitophagy 5-9. Nous décrivons une approche microscopie de fluorescence simples pour évaluer l&#39;autophagie. Pour plus de clarté, nous limitons notre description ici de montrer comment l&#39;approche peut être utilisée pour surveiller mitophagy dans des cellules de levure. Le dosage fait appel à un rapporteur fluorescent, Rosella, qui est un biocapteur à double émission comprenant un rélativement pH stable de protéine rouge fluorescente liée à un pH-sensible protéine fluorescente verte. Le fonctionnement de ce journaliste s&#39;appuie sur les différences de pH entre la vacuole (pH ~ 5,0 à 5,5) et les mitochondries (pH ~ 8,2) dans les cellules vivantes. Dans des conditions de culture, les cellules de type sauvage présentent à la fois une fluorescence rouge et verte distribuée d&#39;une manière caractéristique des mitochondries. Émission de fluorescence n&#39;est pas associé à la vacuole. Lorsqu&#39;il est soumis à la famine d&#39;azote, une condition qui induit mitophagy, en plus de la fluorescence verte et rouge étiquetage les mitochondries, les cellules présentent une accumulation de rouge, mais pas de fluorescence verte, la lumière en acides vacuolaires représentant la distribution des mitochondries de la vacuole. Marquer les cellules avec du rouge, vert, mais pas vacuoles fluorescentes peuvent être utilisées en tant que mesure de l&#39;activité dans les cellules mitophagic 5,10-12.

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Une approche robuste pour surveiller la prestation des organites à la lumière acide de la vacuole de la levure pour la dégradation et le recyclage est décrite. La méthode repose sur le marquage spécifique des organites cibles avec un codées génétiquement double-émission de fluorescence pH-biocapteur, et la visualisation des cellules individuelles en utilisant la microscopie à fluorescence.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

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JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

25.3K vues.  Monash University. Une approche robuste pour surveiller la prestation des organites à la lumière acide de la vacuole de la levure pour la dégradation et le recyclage est décrite. La méthode repose sur le marquage spécifique des organites cibles avec un codées génétiquement double-émission de fluorescence pH-biocapteur, et la visualisation des cellules individuelles en utilisant la microscopie à fluorescence.

Vidéo: A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).