Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health (NIGMS-074696) pour KAM et un American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Fellowship de recherche des étudiants à JLA Nous remercions aussi John Glover à l&#39;Université de Toronto pour fournir la FFL -GFP source de plasmide.

1. Construction de souches contenant FFL-GFP plasmide Pour cette étude, la souche Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) a été utilisé avec une souche de suppression HSP104 de la collection de finale de levure (Open Biosystems / Thermo Scientific). La suppression a été confirmée en utilisant un anticorps spécifique pour Hsp104 analyse Western blot. FFL-GFP a été exprimée à partir p426MET25-FFL-GFP, construit à partir d&#39;une source LEU2 basée plasmide obtenu par le laboratoire Glover à l&#39;Université de Toronto 17 et obtenue sur simple demande aux auteurs. L&#39;expression de la protéine de fusion GFP-FLP plasmide est contrôlé par le promoteur répressible par la méthionine MET25. Le plasmide a été transformé dans chaque souche en utilisant un protocole a été adapté à partir de Gietz et. al, 1995, <ol><li> Centrifuger 25 ml o<html> f cellules en phase logarithmique dans un tube conique de 50 ml à 4400 tours par minute pendant 2 min, laver avec 500 pi de la double H 2 0 distillée (trou DDH 2 O) et jeter le surnageant. </li><li> Remettre les cellules dans 250 pi de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, 0,1 M d&#39;acétate de lithium). Incuber à 30 ° C sans mélanger pendant 20 min. </li><li> Transférer 50 ul de cellules compétentes dans un nouveau tube avec 5 ml (50 pg) d&#39;ADN porteuse et 5 pi (0,1-5 mg) d&#39;ADN plasmidique. Ajouter 300 ul de PEG / TE / LiAc (comme TE / LiAc plus 40% de polyéthylène glycol) à ce mélange, et les cellules incuber à 30 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter 1/10 de volume (v / v) de DMSO (36 pi) à ce mélange et un choc thermique à 42 ° C pendant 6 min. </li><li> Centrifugeuse mélange à 6000 rpm pendant 30 secondes et enlever le surnageant. Reprendre les cellules dans 100 ul de ddH 2 0 et les cellules stériles de la plaque sur un média synthétique complet sans uracile (SC-URA). </li></ol> 2. Induction de la FFL-GFP nt &quot;&gt; FLP-GFP est induite lorsque les cellules sont en phase exponentielle de sorte que la majorité de la protéine avant le choc thermique a été récemment effectuée pour éviter les protéines qui ont terminale agrégées au fil du temps en raison de lacunes cellulaires associées au vieillissement. <ol><li> Jour 1: Incuber les cellules dans 5 ml de SC-URA à 30 ° C en rotation O / N. </li><li> Jour 2: Mesure OD 600 et cultures fraîches ensemencer 5 ml de SC-URA DO600 ~ 0,2. </li><li> Incuber des cultures avec rotation à 30 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la phase logarithmique OD 600 ~ 0.8-1.0. </li><li> Centrifuger les cellules dans 15 ml tubes coniques à 4400 rpm pendant 3 min, décanter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de trou DDH 2 0; solution de transfert dans un tube à centrifuger. </li><li> Centrifuger à 6000 rpm et jeter le surnageant. </li><li> Reprendre les cellules dans 5 ml de SC-URA-MET. Les cellules doivent être incubées tournant dans ce milieu pendant 1 heure à 30 ° C. </li><li> Centrifuger les cellules et lavage de répétition dans le trou DDH 2 0 et jeter le surnageant. </li><li> Resuspecellules nd dans 5 ml médias SC-URA contenant 100 ug / ml de cycloheximide pour inhiber l&#39;expression de la protéine, et procéder immédiatement à l&#39;étape 3. </li></ol> 3. Enzymatique FFL-GFP Recovery Assay Ce test est une approche quantitative pour déterminer les niveaux d&#39;enzyme active dans la population. <ol><li> La préparation de ce test: <ol class="lroman"><li> Mesurer OD 600 pour chaque échantillon. </li><li> Préparer la quantité nécessaire de D-luciférine requises en fonction du nombre d&#39;échantillons et le nombre de répétitions, plus environ 1.200 pi pour le tube désiré. Concentration finale de D-luciférine est d&#39;environ 23 mg par 100 pi de cellules. Initialement, il est dissous dans l&#39;eau à une concentration de la solution mère de 7,5 mg / ml et dilué à 455 ug / ml dans SC avant d&#39;expérimenter. Dans la figure 2, trois répétitions pour chaque échantillon ont été analysés pour un total de 2,4 ml de D-luciférine utilisé. </li><li> lecteur de plaque Programme pour le flash Lumitest de nescence (adapté de BioTek Gen5 &quot;Essai de Flash Luminescence avec injection&quot;, pour d&#39;autres instruments suivent les instructions du fabricant) <ol class="lalpha"><li> Réglez la température à 30 ° C </li><li> Ensemble lecteur de plaque d&#39;ajouter D-luciférine, agiter et lire chaque puits individuellement. </li><li> Lire la luminescence (lecture de point final, 5 temps d&#39;intégration sec, 180 niveaux de sensibilité) </li><li> Pour le dosage de récupération entre chaque tremblement de lecture pendant 5 min, 20 min retarder, et secouer encore 5 min. </li><li> Distribuer 50 l de D-luciférine d&#39;un injecteur. </li></ol></li></ol></li><li> Luminescence Préchauffer-choc est mesuré immédiatement après que les cellules sont ajoutés à un milieu contenant du cycloheximide pour stopper la synthèse des protéines. <ol class="lroman"><li> Transférer 100 ul de cellules pour chaque échantillon avec nombre désiré de répétitions en blanc plaque de 96 puits solide. </li><li> Les contrôles doivent inclure une ébauche de l&#39;eau et des cellules contenant un vecteur vide. </li><li> Lancer la lecture avec la SPEcifications énumérés ci-dessus. </li></ol></li><li> Pour dénaturer le groupement FLE de FFL-GFP, incuber la culture 5 ml dans un tube de culture en verre à 42 ° C en agitant pendant 25 min. </li><li> Récupération de lectures de luminescence de dosage commence immédiatement après que les cellules sont retirées de l&#39;incubateur, qui est le temps zéro. Mesure de la luminescence mêmes que celles décrites plus haut pour le premier point temporel et toutes les 30 minutes pendant 90 minutes. </li><li> Normaliser échantillons de valeurs de luminescence-choc préchauffage qui ont été ajustés en fonction de la DO 600 (diviser les valeurs de préchauffage-choc par OD 600). </li></ol> 4. Fluorescence Microscopy Ce test est une méthode semi-quantitative pour déterminer la solubilisation des agrégats au fil du temps dans une population de cellules. <ol><li> L&#39;induction est le même que celui décrit dans la section 2, les étapes 1-8 de protocoles. </li><li> Les mêmes points de temps sont considérés comme décrit ci-dessus (section 3, étape 4), mais pour microroscopie recueillir 1 ml de cellules à préchauffer-choc et chaque point de temps de récupération, et les échantillons incuber rotation à 30 ° C dans un tube de culture. </li><li> Visualisation: <ol class="lroman"><li> Centrifugeuse 1 ml de cellules à 6000 rpm pendant 30 secondes et supprimer surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 pi de trou DDH 2 O. </li><li> Mélanger 2 pl de cellules plus 2 pi de 2% d&#39;agarose bas point de fusion de la diapositive et ajouter une lamelle. Afin d&#39;obtenir un seul plan de cellules appuyez légèrement doigt vers le bas au centre de la lamelle et tourner jusqu&#39;à ce que la lamelle est difficile de se déplacer. </li><li> Les cellules sont visualisés à l&#39;aide objective de l&#39;huile sur le 100X microscope à fluorescence; utiliser DIC pour visualiser les cellules et le filtre FITC pour visualiser fluorescence de la GFP. </li><li> Prenez plusieurs photos pour chaque souche à chaque point de temps pour la quantification. Les champs pour les photos doivent contenir des cellules ~ 15-30 pour l&#39;analyse quantitative post-expérimentale. </li><li> Pour calculer le pourcentage de cellules contenant des agrégats, comptez 50Cellules -100 totale et divisez le nombre de cellules contenant des agrégats. </li></ol></li></ol> 5. Simple microscopie cellulaire Ce procédé est utilisé pour suivre la solubilisation des agrégats individuels dans une seule cellule au cours du temps. <ol><li> Induire l&#39;expression FFL-GFP comme décrit dans la section 2, les étapes 1-8. </li><li> Après un choc thermique, les cellules de centrifugeuses dans 15 ml tube conique à 4400 rpm pendant 2 min. </li><li> Laver les cellules avec 500 pi d&#39;eau et remettre en suspension dans 20 pl de trou DDH 2 O. </li><li> Pour chaque souche, découper une section 5x5 mm d&#39;une plaque de gélose SC-URA et l&#39;utilisation de la surface qui est en contact avec une boîte de Pétri, pipette 4 pi de cellules et se répandre surface de l&#39;agar avec embout de pipette. Laisser reposer pendant ~ 1 min. </li><li> Utilisez des pinces pour placer section cube de gélose face vers le bas sur une ~ 55 mm à fond de verre plat n ° 0 et appuyez légèrement. </li><li> Visualisation: <ol class="lroman"><li> Voir i-iii dans Section 4. </li><li> Définir les coordonnées 2-4 points focaux pour chaque souche en fonction de la densité de la culture. </li><li> Ensemble appareil photo pour prendre des photos avec un Z-stack avec une gamme appropriée (- / + 15 um d&#39;épaisseur de la tranche 0,5-1,0 pm) toutes les 5 minutes pendant une période de 90 min. </li></ol></li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, la protéine modèle FFL-GFP a été utilisé pour montrer que le disaggregase de levure, Hsp104 contribue à la protéine re-solubilisation et de réparation. Les dosages enzymatiques et la microscopie interrogés de façon différentielle l&#39;état de la même protéine substrat pour déterminer l&#39;efficacité et le rendement de repliement. Les résultats des tests de récupération enzymatiques suggèrent que non seulement la récupération maximale de la souche mutante hsp104D ineffic...

Chez les humains, les maladies neurodégénératives, notamment la maladie d&#39;Alzheimer, de Parkinson, et la maladie de Huntington ont été liés à des mauvais repliement des protéines et de l&#39;agrégation 10. Les cellules utilisent des chaperons moléculaires pour empêcher le piégeage cinétique des protéines cellulaires dans les structures inactives mal repliées 6. Chaperons participer à des réseaux d&#39;interactions complexes au sein de la cellule, mais il n&#39;est pas complètement compris comment la somme de ces interactions contribue à proteostasis organismal. L&#39;un des principaux accompagnateurs responsables de la majorité du repliement des protéines cytosolique est le kD protéine de choc thermique 70 (Hsp70) de la famille 19. Il a été montré que la perte de la levure de Hsp70 diminue la capacité de plier naissante FFL exprimée de manière hétérologue et de replier la protéine endogène, ornithine transcarbamoylase, in vivo 18, 7. La capacité d&#39;analyser pliant avec résolution en temps quasi réel facilitera la compréhension comment supplémentaire facteurs cellulaires contribute à ce processus Hsp70-dépendante. En outre, le pliage / repliage des réactions peut ne pas être totalement dépendant de ces protéines qui contribuent, de sorte que les essais doivent être suffisamment sensible pour détecter à la fois petits et grands changements dans la cinétique et l&#39;efficacité. Le disaggregase de cellules de levure, Hsp104, joue un rôle essentiel dans la réparation de protéines mal repliées agrégées. Bien Hsp104 homologues ont été identifiés dans des champignons et des plantes, cette famille semble être absent chez les métazoaires. Il a été proposé que d&#39;autres chaperons comme ceux de la famille Hsp110 effectuer certaines des activités Hsp104 connus chez les mammifères 16. Hsp104 est un +, complexe protéique hexamérique AAA qui fonctionne dans la levure à des agrégats de protéines de remodeler, contribuant à repliement et la réparation 13. Hsp104, en même temps que la levure Hsp70, SSA1, et la levure Hsp40, Ydj1, est nécessaire pour la récupération du FFL dénaturé dans des cellules de levure 5, 8. La petite protéine de choc thermique, HSP26, a également été montré pour être exirouge pour désagrégation Hsp104 médiée par des FFL 2. FLP est une protéine à deux domaines qui se lie au substrat luciférine dans le site actif et à la suite d&#39;un changement de conformation qui nécessite l&#39;ATP et de l&#39;oxygène, décarboxyle le substrat libérant oxyluciférine, le dioxyde de carbone (CO 2), l&#39;adénosine monophosphate (AMP), et la lumière 11, 9, 3. Le substrat disponible dans le commerce FFL, D-luciférine, se traduit par l&#39;émission de lumière entre 550-570 nm qui peuvent être détectés à l&#39;aide d&#39;un luminomètre 15. FFL est extrêmement sensible à la dénaturation de traitements chimiques ou à la chaleur et agrégats rapidement au déploiement. Exposée à des températures entre 39-45 ° C FFL est réversible déplié et inactivé 12. En revanche, la GFP et ses dérivés sont très résistantes à la protéine déroulement contraintes 14. Par conséquent fusion de ces deux protéines permet FFL à fonctionner comme une entité expérimentale labile capable de cibler G fonctionnelFP intracellulaire dépôts qui peuvent être visualisées par microscopie de fluorescence à la fois la population et les niveaux de cellules individuelles. Application du dosage enzymatique dans un lecteur de plaque multimode semi-automatisé couplé à la microscopie automatisée permet une évaluation simultanée sans précédent de la cinétique et le rendement de repliement réactions. En outre, la génétique moléculaire faciles du modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae permet à la fois une manipulation précise du réseau de contrôle de la qualité des protéines et de la possibilité d&#39;adopter des approches basées sur la découverte d&#39;identifier de nouveaux acteurs qui contribuent à la réponse au stress cellulaire et proteostasis. Dans cette étude, les souches de type sauvage (WT) et HSP104 suppression exprimant FFL-GFP sont soumis à un choc thermique dénaturation des protéines. FFL-GFP repliement est contrôlé à la fois par un dosage enzymatique et la microscopie en lecture proxy pour la réparation du protéome exprimé sur un parcours de temps de récupération. Par rapport aux cellules WT, nous montrons ee souche de suppression Hsp104 est environ 60% moins efficace au repliement FFL-GFP, en soutenant les conclusions antérieures établissant un rôle à jouer dans la réactivation de Hsp104 dénaturé FFL 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, défini comme l&#39;association de processus de repliement des protéines / biogenèse, le repliement / réparation, et la dégradation, est un équilibre cellulaire délicate qui doit être maintenu pour éviter des conséquences néfastes 1. Les facteurs externes ou internes qui perturbent cet équilibre peut conduire à l&#39;agrégation des protéines, la toxicité et la mort cellulaire. Chez les humains, cela est un facteur majeur contribuant à des symptômes associés à des troubles neurodégénératifs tels que la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson et la maladie d&#39;Alzheimer 10. Il est donc essentiel que les protéines impliquées dans le maintien de proteostasis être identifiés afin de développer des traitements pour ces maladies débilitantes. Cet article décrit les techniques de surveillance dans le repliement des protéines in vivo avec une résolution en temps quasi-réel en utilisant le modèle de la protéine luciférase de luciole fusionnée à la protéine fluorescente verte (FFL-GFP). FFL-GFP est une protéine chimérique de modèle unique que le groupement FLE est très sensible au stress induit par misfolding et l&#39;agrégation, qui inactive l&#39;enzyme 12. L&#39;activité luciférase est contrôlée au moyen d&#39;un dosage enzymatique, et la partie GFP propose une méthode de visualisation FFL soluble ou agrégées en utilisant la microscopie automatisée. Ces méthodes couplées intègrent deux approches parallèles et techniquement indépendant pour analyser à la fois le repliement et la réactivation de fonctionnement d&#39;une enzyme après un stress. reprise d&#39;activité peut être directement corrélée avec une cinétique de désagrégation et re-solubilisation de mieux comprendre comment les facteurs de contrôle de la qualité des protéines telles que des protéines chaperons collaborent pour remplir ces fonctions. En outre, la délétion de gènes ou des mutations peuvent être utilisés pour tester les contributions des protéines spécifiques ou des sous-unités protéiques à ce processus. Dans cet article, nous examinons les contributions de la protéine disaggregase Hsp104 13, connu sous le nom de s&#39;associer avec le facteur d&#39;échange Hsp40/70/nucleotide (NEF) système 5 repliement, de repliement des protéines pour valider cette approche.

La levure est dépendante de la disaggregase, Hsp104 se replier efficacement des protéines dénaturées par la chaleur. L&#39;activité des FFL-GFP a été contrôlé après un choc thermique de 25 min, en utilisant un dosage flash luminescence Figure 1. Les résultats de ce test automatisé montre la figure 2 ont révélé une augmentation progressive de l&#39;activité de plus de 90 min qui a finalement conduit à une récupération&gt; 80% des cellules WT. La souche hsp104Δ</em...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Cet article décrit l&#39;utilisation d&#39;une protéine de fusion GFP-luciférase Firefly pour enquêter<em&gt; In vivo</em&gt; Le repliement des protéines à<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. L&#39;utilisation de ce réactif, le repliement d&#39;un modèle de protéine dénaturée par la chaleur peut être surveillé simultanément par microscopie à fluorescence, et un dosage enzymatique pour sonder les rôles des éléments du réseau de proteostasis dans le contrôle de la qualité des protéines.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K vues.  University of Texas Medical School. Cet article décrit l'utilisation d'une protéine de fusion GFP-luciférase Firefly pour enquêter In vivo Le repliement des protéines à Saccharomyces cerevisiae. L'utilisation de ce réactif, le repliement d'un modèle de protéine dénaturée par la chaleur peut être surveillé simultanément par microscopie à fluorescence, et un dosage enzymatique pour sonder les rôles des éléments du réseau de proteostasis dans le ...

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Recherche

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em