Nous remercions le Professeur Hiraoka de nous envoyer les souches. Nous reconnaissons le soutien de la Fondation et de Goran Gustafssons la Société du cancer suédois (2008/939).

1. Culture de levure de fission <ol><li> Préparer Edinburgh Minimal Médias (EMM) et EMM, sans chlorure d&#39;ammonium (EMM-N) 8. Afin de réduire l&#39;autofluorescence de la solution de glucose ne doit pas être autoclavés, mais plutôt en utilisant un filtre stérilisé filtre de 0,2 um et ensuite ajouté à la presse en autoclave. </li><li> Inoculer les cellules de levure à fission fraîchement cultivés sur une plaque de gélose avec les médias riches, PJE 8, dans 3 ml de liquide avec les médias EMM de glucose stérilisé filtre. Utilisez des tubes 13ml avec une légère poussée sur le couvercle pour assurer une bonne ventilation des cellules. Laissez les cellules se développent en les secouant avec 225 rpm à 30 ° C. Gardez la croissance des cellules en phase log (1 x 10 6 - 2 x 10 7 cellules / ml) pendant 2 jours en les comptant à l&#39;aide d&#39;une chambre Burker suivie par dilution appropriée, chaque matin et chaque soir. </li><li> Le jour de l&#39;expérience assurez vous d&#39;avoir des cellules en phase logarithmique précoce, 5 x 10 6 - 1 X 10 7 cellules / ml. </li><li> Pour mourir de faim tIl cellules de l&#39;azote pendant 20 minutes à partir de supports switch EMM EMM-N médias. Cela se fait par prélèvement de 3 ml de cellules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml dans une centrifugeuse de paillasse au maximum 1,5 fcr que centrifugation à une vitesse plus rapide pourrait provoquer une réaction de stress dans 9 levure à fission. Utilisez la technique du double de filature, de sens; premier spin pendant 2 min, puis tournez le tube Eppendorf de 180 ° et faites tourner à nouveau pour 1,5 rcf 2 min 10. Cela permet de rassembler toutes les cellules dans une pastille au fond du tube. Laver une fois avec EMM-N et ensuite dissoudre le culot dans EMM-N et incuber les cellules pendant 15 minutes à 30 ° C en agitant à 225 rpm, puis continuer au point 2. La préparation des échantillons. </li></ol> 2. La préparation des échantillons <ol><li> Récolte de 1,5 mL de cellules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml dans une centrifugeuse de paillasse au maximum 1,5 fcr que centrifugation à une vitesse plus rapide pourrait provoquer une réaction de stress dans 9 levure à fission. Utilisez la technique du double filature, meaning; premier spin pendant 2 min, puis tournez le tube Eppendorf de 180 ° et faites tourner à nouveau pour 1,5 rcf pendant 2 min 10. Cela permet de rassembler toutes les cellules dans une pastille au fond du tube. </li><li> Retirer le surnageant, mais laisser 10 à 15 uL et remettre en suspension les cellules dans les médias reste. Alternativement ajouter 10 ul de milieux frais pour remettre le culot cellulaire. </li><li> Assurez-vous d&#39;avoir des lames de verre clair et couvercle en verre (pas 1.5). Normalement, vous n&#39;avez pas à les nettoyer, mais assurez-vous qu&#39;ils ne sont pas pleins de poussière. </li><li> Sortez du congélateur une aliquote d&#39;une solution stock de lectine 1mg/mL qui a été stérilisée par filtration. La solution de lectine peuvent être recongelés plusieurs fois. La lectine est utilisé pour fixer les cellules de levure au couvercle en verre. </li><li> Placez 5 pi de EMM de glucose stérilisé filtre sur le verre objectif. </li><li> Placez 5 pi de solution de lectine dans le coin de la vitre de couverture. Par la suite placer 5 uL de culture de cellules dans le même coin, c&#39;est à dire dans la chute de la lectine. Mélanger à la pipette quelques fois et puis étaler la culture cellulaire lectine mélange à travers le couvercle en verre en utilisant le côté long de la pointe de la pipette. Selon la densité de votre mélange de cellules ou de tout laisser aspirer l&#39;excès de liquide dans le coin opposé du verre de couverture. </li><li> Placez le couvercle en verre, en haut, avec un côté sur le verre objectif et de l&#39;autre côté sur le banc. Laissez le couvercle en verre sécher un peu pendant quelques minutes. Il doit absolument pas être complètement sec, mais il ne faut pas trop de liquide sur le verre. </li><li> Placez le couvercle en verre avec un ange d&#39;environ 70 ° par rapport au verre objectif par la chute d&#39;EMM. Lâchez le couvercle en verre afin qu&#39;il va tomber de haut en bas dans la goutte d&#39;EMM. </li><li> Pour sceller les bords avec de la graisse silicone préparer une seringue de 2 ml. Couper l&#39;extrémité large de la pointe 200 pi et le joindre à la seringue. Remplir la seringue avec environ 1 ml de graisse au silicone. Une ligne fine de silicium est appliqué sur les bords du verre couvercle en douceur du pushing le piston de la seringue. Maintenant vous avez une petite chambre de croissance de S. cellules pombe. </li></ol> 3. Microscopie <ol><li> Initialiser le microscope à fluorescence en allumant la lampe au mercure / xénon, le microscope et l&#39;ordinateur. Placer la chambre de croissance de la levure dans le microscope à fluorescence. Utilisez un objectif 63 X ou un objectif 100 X avec NA = 1.3 ou supérieur. Si un objectif de pétrole est utilisé, ajouter l&#39;huile. </li><li> Utilisez le champ clair de trouver les cellules et obtenir une image nette. </li><li> Les réglages pour la microscopie par fluorescence varient selon les fluorochromes utilisés pour marquer les cellules de levure et le microscope. Nous utilisons un microscope confocal Zeiss LSM 700 microscope laser à balayage avec le Plan-Apochromat lentilles huile d&#39;objectif 63x (NA = 1,4) avec la ligne de réglage 16 plan de balayage moyenne. Le sténopé doit être réglé de 1 à 1,1 unités d&#39;Airy, qui donne une tranche optique de 0,8 mm. Nous détectons la GFP dans la piste 1 en utilisant le jeu de filtres pour Alexa 488 avec un séparateur de faisceau à 582 nm, donc detecting longueurs d&#39;onde entre 488 et 582 nm. En piste 2, nous utilisons un ensemble de filtres optimaux pour mCherry utilisant un séparateur de faisceau à 578 nm, donc la détection des longueurs d&#39;onde entre 578 et 600 nm. Cela signifie que la piste 2 fois le rapport de la direction (SPB) et NM (mCherry) sera détectée. </li><li> Prenez autant de photos nécessaires pour être capable de mesurer dans 60 cellules différentes pour chaque souche. Habituellement 15 photos de champs de microscopie indépendants sont assez. Il est recommandé une chambre de croissance de nouvelles cellules fraîches avec est faite, si votre temps de microscopie dépasse 60 minutes. </li></ol> 4. La mesure quantitative des distances subcellulaire <ol><li> Ouvrez les photos dans le programme d&#39;édition Zeiss Lumière zen. En utilisant la mesure de l&#39;outil de mesures de la distance en um entre les différents fluorochromes dans toutes les cellules où tous les signaux sont dans le même plan focal. Ajuster l&#39;intensité lumineuse et le contraste pour identifier le centre du signal fluorescent. Ce protocole simplifié n&#39;utilise que deux c différentesouleurs et donc le SPB et NM sont dans le même canal. Le SPB est distingué par sa structure dans le grand rond NM. Transfert des distances à une feuille de bloc-notes. Mesurer au moins 60 cellules. D&#39;autres programmes tels que ImageJ pourrait également être utilisé pour mesurer la distance, mais Zeiss zen Lumière est préférée en raison de sa plus haute résolution de l&#39;image et la facilité d&#39;zoomer et dézoomer à l&#39;aide de ce programme. Photos en format LSM a ouvert en ImageJ aura les deux canaux sur le dessus de l&#39;autre. Pour faire une photo avec les deux canaux, d&#39;abord séparer les deux canaux et par la suite les fusionner. Par la suite, l&#39;outil en ligne peut être utilisé pour mesurer les distances tel que décrit ci-dessus. </li><li> Comparez les distances moyennes ou médianes subcellulaire entre différentes souches et les traitements en utilisant un programme statistique, par exemple t-test ou test de Mann-Whitney somme des rangs, par exemple en utilisant le logiciel SigmaStat-3.5. Fréquemment, les données ne sont pas normalement distribuées, depuis il y aura une sélection des cellules avec des courtsdistances entre les signaux fluorescents puisque tous les signaux doivent être dans le même plan focal à mesurer. Un t-test ne peut être utilisé lorsque les données ont une distribution normale alors qu&#39;un test de Mann-Whitney permet la comparaison des ensembles de données qui n&#39;ont pas une distribution normale. Dans un test t de la moyenne des deux ensembles de données différents sont comparés alors que dans un test de Mann-Whitney, la médiane est comparée. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Strain PJ1185: (H + + his7:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 lacO] SID4-MRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) a été cultivé dans EMM . Un échantillon a été retiré et monté dans une chambre de croissance des petites et photos ont été prises (fig. 1A + N). Par la suite le milieu de croissance a été remplacé par EMM w / o chlorure d&#39;ammonium (EMM-N), et les cellules sont grown pendant 15 minutes en secouant. Les cellules ont ensuite été affamés d&#39;azote monté dans une chambre de croissance avec EMM-N et photos ont été prises (fig. 1A-N). L&#39;outil de mesure a été utilisée pour mesurer la distance entre le lieu (GFP) et le SPB (Fig. 1B et tableau 1). En outre, la distance entre le locus (GFP) et le NM a été mesurée (Fig. 1B et tableau 2). Les distances médianes subcellulaire avant et après épuisement de l&#39;azote ont été comparées en utilisant le logiciel de SigmaStat-3.5 (tableau 3). Il y avait un décalage statistiquement significatif dans la localisation de l&#39;amas de gènes s&#39;éloignant de la NM vers la SBP. Les données mesurant la distance entre la GFP et la SBP a une distribution normale, et donc les distances moyennes (1,777 um + N et 1587 um-N) peut être comparé en utilisant un test t (Tableau 1 et 3). Il y avait une différence significative entre les deux valeurs moyennes (p = 0,008, test t). Les données mesurant la distance entre la GFP et NM n&#39;ont pas eu une normale distribution et donc les distances médianes (0 um + N et 0,390 um-N) ont été comparés en utilisant un test de Mann-Whitney (tableau 2 et 3). Il y avait une différence significative entre les deux valeurs médianes (P &lt;0,001, test de Mann-Whitney somme des rangs). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> Figure 1. La localisation d&#39;un cluster de gènes nommés Chr1, marquée par la GFP, a changé après la famine azote. (A) Colonne de gauche, + N, un noyau de cellule représentant une cellule cultivée dans la colonne de droite EMM-N, un noyau de cellule représentant une cellule cultivée dans EMM-N. Le vert est le signal GFP étiquetage du cluster Chr1, le rouge est la RDRF et de l&#39;étiquetage mCherry le SPB et NM, respectivement. (B) le noyau même cellule que (A) mais maintenant, avec les distances mesurées subnucléaires; jaune: le diamètre du noyau cellulaire, bleu: la distance entre les SPB et GFP signal et rose: la distance entre le signal GFP et la membrane nucléaire. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> Tableau 1. Les distances mesurées subnucléaires en um de la souche cultivée dans PJ1185 EMM. Première rangée, diamètre de la cellule (d), deuxième rangée, la distance entre la GFP et le SPB, la troisième rangée, la distance entre la GFP et la NM. <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> Tableau 2. Les distances mesurées subnucléaires en um de la souche cultivée dans PJ1185 EMM-N. Première rangée, diamètre de la cellule (d), deuxième rangée, la distance entre la GFP et le SPB, la troisième rangée, la distance entre la GFP et la NM. <imgalt = &quot;Tableau 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot; /&gt; Tableau 3. Statistiques descriptives des distances observées dans la souche subnucléaires PJ1185 avant (+ N) et après (-N) de famine azote. Première rangée: le nombre de cellules mesurées, deuxième rangée: diamètre moyen (d), troisième ligne: diamètre médian (d), ci-ligne: la distance moyenne entre la GFP et SPB, cinquième ligne: les distances médianes entre la GFP et NM.

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	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. 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Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+(Nobel+Lecture).">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li><li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection.">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Durant la dernière décennie l&#39;utilisation de l&#39;imagerie de cellules vivantes pour surveiller les événements cellulaires est devenu plus populaire. Cela a commencé avec l&#39;utilisation de la protéine à fluorescence verte de la méduse Aequorea victoria et maintenant de nombreux fluorochromes différents sont disponibles à travers une émission de fluorescence large spectre de cyan (475 nm) à rouge lointain (648 nm) 11. Un des principaux avantages de l&#39;imagerie des cellules vivantes au cours d&#39;immunofluorescence est que les cellules ne sont pas fixés par le formaldéhyde ou de l&#39;éthanol / acétone traitement avant la microscopie, évitant ainsi les artefacts possibles du processus de fixation. En outre, imagerie des cellules vivantes offre la possibilité de suivre des cellules individuelles et de prendre des photos à intervalles fréquents pendant les heures ou les jours d&#39;incubation, ce qui permet d&#39;obtenir des films d&#39;événements cellulaires 12. Les cellules de mammifères ont l&#39;avantage d&#39;avoir une plus grande taille, avec des diamètres de l&#39;ordre de 100 pm, par rapport à la cellule plus petite levure avec un diamètre d&#39;environ 3-4 &amp;mu; m. D&#39;autre part, l&#39;avantage avec de la levure est le génome facilement manipulable. La recombinaison homologue se produit très efficace dans la levure et est utilisée pour fusionner des protéines d&#39;intérêt à des fluorochromes différents 3. Par ailleurs, en utilisant l&#39;intégration ciblée de séquences et d&#39;expression lacO ultérieure de LACR-protéine GFP permet la détection d&#39;une partie spécifique du génome dans le noyau cellulaire 2. Utiliser S. pombe cellules en microscopie a des avantages supplémentaires car ils sont naturels des organismes unicellulaires qui se développent avec un temps de génération rapide à faible coût conditions de culture cellulaire. En outre, S. pombe est un organisme eucaryote excellent modèle car il a des gènes homologues métazoaires. Une des principales limites de cette technique est autofluorescence dans la cellule de levure perturber la détection du signal vrai. Ce problème peut être surmonté en utilisant des milieux de croissance minimale de glucose stérilisé filtre au lieu de l&#39;autoclave. DansOutre les cellules de levure doivent être cultivées pendant 2 jours en phase journal avant leur montage. Le protocole présenté ici propose une méthode relativement simple, mais pourtant quantitatives pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines dans la cellule de levure. D&#39;ailleurs en prenant des photos à différents moments, nous pouvons suivre les événements cellulaires.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / équipements </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Lectine </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Graisse silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à balayage laser LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> Autres microscope confocal pourraient être utilisés. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> N&#39;importe quel logiciel d&#39;analyse statistique pourrait être utilisé. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

Plusieurs techniques de microscopie sont aujourd&#39;hui disponibles qui permettent de détecter une protéine spécifique dans la cellule. Durant la dernière décennie imagerie des cellules vivantes en utilisant des fluorochromes comme la Green Fluorescent Protein (GFP) directement attaché à la protéine d&#39;intérêt est devenu plus populaire 1. En utilisant la GFP et fluorochromes similaires les localisations subcellulaires et les mouvements des protéines peuvent être détectées dans un microscope à fluorescence. Par ailleurs, outre la localisation subnucléaires d&#39;une certaine région d&#39;un chromosome peut être étudiée en utilisant cette technique. GFP est fusionnée à la protéine répresseur lac (LACR) et ectopique exprimé dans la cellule où les répétitions en tandem de la séquence lacO a été inséré dans la région d&#39;intérêt sur ​​le chromosome 2. Le LACR-GFP va se lier à des répétitions lacO et cette région du génome sera visible comme un point vert dans le microscope à fluorescence. La levure est particulièrement adapté pour ce type de manipulation depuis homologuesrecombinaison est très efficace et permet ainsi une intégration ciblée des répétitions lacO et protéines de fusion avec la GFP conçu 3. Nous décrivons ici une méthode quantitative pour l&#39;analyse de cellules vivantes de levure à fission. Des protocoles additionnels pour l&#39;analyse de cellules vivantes de levure à fission peut être trouvé, par exemple sur la façon de faire un film sur les 4 comportements chromosomique méiotique. Dans cette expérience particulière, nous nous concentrons sur l&#39;organisation subnucléaire et comment elle est affectée lors de l&#39;induction de gènes. Nous avons marqué un cluster de gènes, nommés Chr1, par l&#39;introduction de sites lacO obligatoire dans le voisinage des gènes. Le groupe de gènes est enrichie par des gènes qui sont induits par la famine au début lors de l&#39;azote de 5 levure à fission. Dans la souche de la membrane nucléaire (NM) est étiqueté par l&#39;attachement de la mCherry Cut11 protéines NM donnant lieu à un signal rouge fluorescent. Le pôle du corps de la broche (SPB) composé SID4 est fusionnée à la protéine fluorescente rouge (SID4-MRFP) 6 </sjusqu&#39;à&gt;. Dans les cellules de levure végétative croissante des centromères sont toujours attachés à la SPB qui est incorporé dans le NM 7. Le SPB est identifié comme une grande structure ronde au NM. En imagerie avant et 20 minutes après l&#39;épuisement de la source d&#39;azote, nous pouvons déterminer la distance entre le groupe de gènes (GFP) et le NM / SPB. Les distances moyennes ou médianes avant et après épuisement de l&#39;azote sont comparés et nous pouvons ainsi mesurer si oui ou non il ya un décalage dans la localisation subcellulaire de la grappe gène après épuisement de l&#39;azote.

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

La levure de fission,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt;, Est un bon modèle pour étudier les processus cellulaires de base. Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l&#39;analyse quantitative des cellules vivantes de levure à fission. Dans cette expérience particulière nous nous concentrons sur l&#39;organisation du génome dans le noyau cellulaire, mais la méthode peut également être utilisé pour étudier les facteurs cytosoliques.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K vues.  University of Uppsala. La levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, Est un bon modèle pour étudier les processus cellulaires de base. Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l'analyse quantitative des cellules vivantes de levure à fission. Dans cette expérience particulière nous nous concentrons sur l'organisation du génome dans le noyau cellulaire, mais la méthode peut également être utilisé pour étudier les facteurs cytosoliques.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Recherche

Biologie

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Un flux de travail de remise en forme Analyse quantitative

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Analyse spatiotemporelle des cytokinétique événements dans la levure de Fission

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...