Cette recherche a été financée par des subventions GM046406 (à DB) et par l&#39;Institut national des sciences médicales générales Centre pour Quantitative Biology (GM071508). RSM reconnaît financement de la NSF Graduate Research Fellowship. MNM est pris en charge par un Lewis-Sigler Fellowship. Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Botstein pour des discussions utiles et les anciens membres Allegra Petti et Nikolai Slavov pour leurs contributions au projet de cycle métabolique. Nous remercions Daniel Zenklusen et Robert Singer pour obtenir nous avons commencé avec la méthode FISH.

Les figures 1 et 2 sont des schémas des procédures expérimentales FISH et la canalisation de l&#39;analyse d&#39;images utilisés pour quantifier images de poissons. 1. Solutions à Préparer * Les solutions ci-dessous sont pour une utilisation avec des sondes de chanteur. Si l&#39;aide de sondes Stellaris, remplacer &quot;40% de formamide» par «10% de formamide&quot; en tant tampon d&#39;hybridation et le tampon de lavage. D&#39;autres modifications à la mémoire tampon d&#39;hybridation lorsque l&#39;aide de sondes Stellaris sont (1) ajouter 1 g Sulfate de Dextran et (2) ne comprend pas les 10 mg ssDNA. Tampon B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41,5 ml 1M K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Tampon sphéroplastes 890 pi de tampon B 100 VRC ul 10 pl 25.000 U / ml lyticase 2 pl β-mercaptoéthanol &lt;strong&gt; tampon d&#39;hybridation (10 ml, le volume final) 10 mg E. coli ARNt 10 mg ssDNA * 100 pi mm stock 200 VRC 40 ul de 50 mg / ml de BSA 1 ml 20X SSC 4 ml 40% de formamide * Nucléase libre l&#39;eau (à 10 volume final ml) 1 g Sulfate de Dextran * * Tampon d&#39;hybridation peut être maintenue en portions de 0,5 ml à -20 ° C pour plus de commodité. Tampon de lavage (ml, volume final 50) 5 ml 20X SSC 20 ml 40% de formamide * Nucléase libre l&#39;eau (à 50 volume final ml) Étiquetage Buffer 1,06 g de carbonate de sodium 100 ml d&#39;eau DEPC pH 9 2. Probe-étiquetage (sondes Singer uniquement) Nous obtenons ces sondes par synthèse en interne en utilisant un appareil de synthèse d&#39;oligonucléotides ABI. Typicallié, 4-5 ~ 50 pb oligonucléotides sont synthétisés qui sont homologues du gène d&#39;intérêt, en remplaçant la thymidine amino-allyl pour plusieurs thymidines espacées d&#39;au moins 8, de préférence de 10 pb à part +. En raison de leur sensibilité à l&#39;ozone, nous travaillons dans un établissement exempt d&#39;ozone lors de l&#39;utilisation de colorants CY. <ol><li> Obtenir ~ 5 sondes et remettre en suspension dans 100 pi d&#39;eau - les concentrations de cocher sur Nanodrop. </li><li> Selon le nombre de sondes / gène, combiner total de 10 ug / oligonucléotides gènes (par exemple si ont 5 sondes / gène, puis vouloir 2 pg / sonde). </li><li> Utilisez les colonnes de Qiaquick pour purifier sondes selon QlAquick Nucleotide Protocole de lot d&#39;enlèvement. </li><li> Ajouter 10 volumes tampon PN pour le volume total de sondes et combiné mix. </li><li> Appliquer l&#39;échantillon à la colonne QIAquick - si le volume total est supérieur à 750 pi, ralentit deux fois en utilisant la moitié du volume dans chaque tour </li><li> Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Centrifuger 1 min à 6000 rpm. </li><li> Laver avec 750 ul de tampon PE. </li><li> Centrifugeuse1 min à 6000 rpm. </li><li> Disposer d&#39;écoulement à travers la colonne et re-spin pendant 1 min à 13000 rpm à sécher. </li><li> colonne QIAquick de place dans le nouveau microtube et l&#39;ADN élue avec 50 pl H 2 O - Assurez-vous que H 2 O pH est à 7,0 et 8,5 et est placé directement sur ​​la membrane. </li><li> Laisser reposer pendant 1 min. </li><li> Centrifuger pendant 1 min à 13000 rpm pour éluer l&#39;ADN. </li><li> Lyophiliser l&#39;ADN à 45 ° C. </li><li> Remettre le culot dans un tampon de marquage 10 pi et d&#39;ajouter au tube de colorant sans toucher le colorant. </li><li> Répéter l&#39;opération avec un autre tampon de marquage 10 pl. </li><li> Vortex et centrifuger le tube de colorant et de l&#39;ADN. </li><li> Couvrir les tubes avec du papier d&#39;aluminium et garder dans l&#39;obscurité à température ambiante O / N à étiqueter. </li><li> Répétez QlAquick Nucleotide Protocole de lot d&#39;enlèvement. Effectuer avec deux différences: - Ajouter tampon PN 200 pi de sondes et de mettre des sondes marquées à travers des colonnes 2x. - Effectuer 3 lavages avec le tampon PE afin de se laver de tout colorant non fixé avant l&#39;élution. </li><li> After élution obtenir concentration via NanoDrop. L&#39;efficacité de l&#39;étiquetage est typiquement ~ 0,25 pmol / ng d&#39;ADN simple brin. </li></ol> 3. Lamelle Préparation <ol><li> Placer les lamelles sur des lames de plasma preen chambre à vide ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (le plus proche du centre, mieux c&#39;est). </li><li> Mettez chambre à vide au micro-ondes et assurez-vous qu&#39;il est scellé. </li><li> Mettre la pompe en premier, puis tourner à vide sur une seule fois la pompe est démarrée. </li><li> Allumez le four micro-ondes, et d&#39;arrêter 5 sec après plasma est visible. </li><li> Éteignez vide puis pomper. </li><li> Tirez chambre à vide et retirer des lamelles avec une pince (ceux qui sont tombés ont besoin d&#39;être à nouveau nettoyé). </li><li> La place des lamelles couvre-côté nettoyé dans des plaques à 12 puits. </li></ol> 4. Procédure de fixation <ol><li> Croître la levure à une DO600 d&#39;environ 0,1-0,2 dans un milieu minimal. 10 ml de cellules donne assez for ~ 10 hybridations distinctes. </li><li> Ajouter 1/10 du volume 37% de formaldéhyde directement sur le support de croissance (10 ml de culture + 1 ml de formaldéhyde 37%) et laisser reposer pendant 45 min. </li><li> Laver 2x avec 1 ml de glace tampon froid B dans un tube à centrifuger (peut tourner à 13000 rpm pendant 1 min). </li><li> Ajouter 1 ml de tampon sphéroplastes. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Vérifiez cellules toutes les quelques minutes sous le microscope jusqu&#39;à ce que la plupart des cellules sont en noir (c&#39;est à dire pas de phase lumineuse). </li><li> Laver 2x avec de la glace tampon froid B, tournant à faible vitesse (~ 3500 rpm). </li><li> Ajouter 1 ml de EtOH à 70%, remettre en suspension doucement et laisser une nuit à 4 ° C (peut stocker indéfiniment à -20 ° C). </li></ol> 5. Procédure d&#39;hybridation <ol><li> Préparer la solution d&#39;hybridation: à 100 pi de tampon d&#39;hybridation, ajouter 1-3 pi de sonde, puis vortex et centrifuger. sondes Singer utilisent 8-10 totale ng par set sonde (ie par gène). Nous avons imagé jusqu&#39;à 3 gènes simultanément avec 3 difsonde marquée rents fixe. </li></ol> Assurez-vous de réchauffer la solution d&#39;hybridation à la température ambiante avant de l&#39;ouvrir. Pour les sondes de Stellaris, il est recommandé de commencer 4 réactions d&#39;hybridation séparées en ajoutant 1 pi de chacun de 1:10, 1:20, 1:50 et 1:100 dilutions de travail des sondes pour voir celui qui est optimal. Dilutions de travail des sondes Stellaris sont préparés dans un tampon d&#39;hybridation. <ol start="2"><li> Centrifugeuse (pour toutes les étapes ultérieures; 3500 rpm, 5 min), les cellules fixes (par exemple 200 pi) et aspirer loin de l&#39;éthanol. </li><li> Doucement remettre en suspension dans un tampon de lavage 1 ml qui contient le même pourcentage de formamide dans le tampon d&#39;hybridation. Laisser reposer pendant 2-5 min. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon et le tampon de lavage aspiration, puis ajouter la solution d&#39;hybridation. Incuber dans l&#39;obscurité sous agitation douce, O / N à 37 ° C. </li></ol> Remarque: la procédure suivante est d&#39;application cellules / d&#39;imagerie sur des lamelles. Pour wincinération / imagerie de cellules dans des plaques à 96 puits, y compris la solution de rechange réactive de l&#39;oxygène de l&#39;espèce au trésor voir <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Le lendemain, ou à l&#39;avance, propre (voir procédure) et de traiter les lamelles avec 150 pi 0,01% de poly-L-lysine pendant 5 min. Aspirer, laisser sécher, laver 3x avec dH 2 O et laisser sécher. </li><li> Dans la matinée, ajouter 1 ml de tampon de lavage de l&#39;échantillon, remettre en suspension doucement, centrifugeuse et aspirer, puis remettre en suspension dans un autre 1 ml de tampon de lavage et incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver avec 2X SSC + 0,1% de Triton X-100 à TA 15 min sur agitateur. </li><li> Prenez milieu de montage du congélateur pour lui permettre de venir à la TA avant le montage. </li><li> Laver avec 1X SSC à température ambiante 15 min sur agitateur. </li><li> Diluer DAPI dans PBS (0,1 pg / ml final) et remettre les cellules dans 150 pi. </li><li> Lieu solution sur nettoyé / poly-Lys-traitéslamelles TED dans la plaque de 12 puits; au moins 30 min intacte. </li><li> Retirez la solution (vous pouvez la placer sur une lamelle de rechange comme une sauvegarde) et laver 3x avec 1 ml de PBS 1X. </li><li> Placez 3 pi de prolonger milieu de montage or sur une lame (Invitrogen P36934). Pour ce faire, un à la fois si vous avez plusieurs lamelles pour éviter le dessèchement du milieu de montage. </li><li> Ajouter ~ 0,5 ml d&#39;éthanol à lamelle en plaque 12 puits, enlever la lamelle et l&#39;air sec tout en maintenant avec des pincettes. </li><li> Placez les lamelles à côté cellule vers le bas sur un milieu de montage et laisser durcir plusieurs heures ou O / N dans l&#39;obscurité. </li><li> Sceller les bords avec le vernis à ongles et de procéder à l&#39;imagerie. </li></ol> 6. Imagerie des cellules avec Olympus IX-81 inversé Présentation du microscope <ol><li> Pour l&#39;acquisition d&#39;image, nous utilisons le logiciel Slidebook (intelligente imaging.com) et un, 1,45 NA, TIRFM objectif d&#39;huile 100X. Pour GFP série, DAPI, Cy3, Cy5 Cy3.5 et imagerie: jeux de filtres Chroma (voir réactifs). </li><li> Utiliser un filtre DAPIde trouver et de concentrer les cellules. </li><li> Définissez ce que le point de référence. </li><li> Jetez un z-pile d&#39;images autour du point de référence lorsque la distance totale est de 5 um avec 0,2 Taille de l&#39;iM (25 avions). Répétez l&#39;opération pour chaque canal à colorant (ie fixe chaque sonde). </li><li> Exporter au format TIFF 16 bits pour l&#39;analyse d&#39;image. </li></ol> 7. Analyse Aperçu de l&#39;image (sondes Singer) Ci-dessous nous donnent un aperçu des méthodes de calcul que nous utilisons pour l&#39;analyse des images de poissons dans MATLAB. Les fonctions MATLAB pertinentes utilisées sont regroupées sur la droite. Les algorithmes et les seuils sont actuellement accordées pour les données des sondes de style de chanteur. En utilisant des sondes de style Stellaris nécessitera une certaine adaptation, en particulier à l&#39;étape de filtrage final (7.8). Identification des cellules 15 <ol><li> Des cellules séparées de fond en utilisant un seuil global sur DAPI images 16 [graythresh]. </li><li> Identifier les noyaux en utilisant la fonction maxima prolongée [imextendedmax]. </li><li> cellules segment en utilisant des noyaux sous forme de graines pour un algorithme bassin versant [bassin]. </li></ol> Trouver des sites dans chaque canal de fluorescence <ol start="4"><li> Effectuer transformation de tophat de normaliser fond et améliorer le rapport signal sur bruit [bwmorph]. </li><li> Trouver maxima pour identifier la couche mise au point correcte (dans le plan z) pour chaque spot [imregionalmax]. </li><li> Filtrer spots potentiels en utilisant un modèle de régression linéaire pour un dégradé radial. </li></ol> Mesure intensité de la tache et filtrer les signaux simples vs multiple sonde <ol start="7"><li> Monter un profil gaussien 2D à la place de la couche en-focus préalablement identifiés et l&#39;intensité estimation 17. </li><li> Filtrer les points faibles à l&#39;aide d&#39;un seuil (basé sur l&#39;histogramme). Pour les sondes de type Singer cela est important, mais l&#39;est moins pour les sondes de Stellaris. </li><li> Comptez points dans chaque cellule. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

À ce jour, le poisson est principalement été une méthode à faible débit. L&#39;utilisation de Cy3, Cy3.5 et Cy5 limite le nombre de gènes, on peut étudier dans des cellules individuelles à trois à la fois. Certaines sondes supplémentaires ont été développés (Stellaris), mais le nombre de sondes distinctes est toujours au plus sept ans. Pour contourner cette limitation, les stratégies de marquage combinatoire utilisant plusieurs fluorophores ont été utilisées pour créer des codes barres pour les différentes espèces d&#39;ARNm 19,20. Plus récemment, Lubeck et Cai utilisés codes-barres optique et spectrale à quantifier 32 espèces différentes simultanément avec des poissons dans des cellules de levure unique 19. Une des limites de cette approche combinatoire récent est qu&#39;elle nécessite l&#39;utilisation de la microscopie de super-résolution. L&#39;analyse nécessaire pour distinguer les sondes code à barres est également très complexe. Nous avons constaté que Cy3 et Cy3.5 sont préférables à Cy5 pour les expériences de poisson. Une des limitations du colorant Cy5 est sa sensibilitéau photoblanchiment. Cependant, Stellaris a récemment développé Cy5 variantes qui sont annoncés comme plus résistant au photoblanchiment, et peut atténuer ce problème technique. C&#39;est également intéressant de noter que le poisson est une méthode coûteuse à mettre en œuvre et que les deux chanteur et Stellaris sondes coûtent 700 $ - 1000 $ par ensemble de sondes, bien que les prix pour les sondes disponibles sur le marché devraient diminuer à l&#39;avenir. Sobre de réactifs et d&#39;étiquetage efficace apporte des sondes de chanteur jusque dans la gamme inférieure dans le prix. L&#39;un des principaux défis techniques est la séparation des spots de sondes simples ou multiples, ce qui nécessite la mise en œuvre des algorithmes sophistiqués place déterminants. Cela peut prendre un examen approfondi du manuel pour régler les paramètres d&#39;analyse d&#39;images pour des montages expérimentaux spécifiques. Un aperçu de notre pipeline de calcul avec des fonctions MATLAB concernés est prévue à l&#39;article 7 du protocole. Cette question est quelque peu atténué par les sondes Stellaris qui ont seulement<html> une étiquette par sonde. Elle nécessite donc la colocalisation de plusieurs sondes pour voir un signal. Parce que le poisson nécessite cellules de fixation, il ne facilite pas le suivi des cellules individuelles au fil du temps. Auparavant, nous avons utilisé les données d&#39;instantané de poisson pour reconstruire la dynamique de l&#39;expression des gènes dans les populations de levure métaboliquement cyclistes individuels 6. Cyclisme métabolique est observée en pré-affamés, cultures continues, et se caractérise par des oscillations collectives ensemble de la population dans la consommation d&#39;oxygène. Ces oscillations sont associés à l&#39;échelle du génome oscillations de transcriptions qui se produisent pour la moitié des gènes de la levure à différentes phases de la consommation d&#39;oxygène. Nous avons cherché à déterminer si le cyclisme métabolique était présente dans les cultures de levure en continu non synchronisées. Le cas échéant, relevés de notes qui sont anti-corrélés au sein des populations synchrones devraient également être anti-corrélés dans des cellules individuelles non synchronisés, et vice versa pour les transcriptions corrélés. ent &quot;&gt; Pour reconstruire la dynamique de la production d&#39;ARNm dans le temps, les données de l&#39;instantané observées doit être comparée à ce qui est attendu d&#39;un modèle de comportement sous-jacent. Il ya des limites théoriques lorsque ces« instantanés »des données d&#39;expression de gènes peuvent être utilisés pour déterminer la dynamique de l&#39;expression des gènes sous-jacents et quels types de modèles peuvent être distingués 21. Pour les données sur le cycle du métabolisme, plutôt que de montrer directement la présence d&#39;oscillations temporelles, des mesures statistiques ont été mises en œuvre à l&#39;appui qu&#39;il ya effectivement un programme oscillatoire autonome cellulaire compatible avec puce vrac mesures.

En utilisant des techniques de mesure en vrac, il n&#39;est pas possible de doser le nombre de transcrits ou de l&#39;activité transcriptionnelle des cellules individuelles dans une. En utilisant des protéines fluorescentes commandés par des promoteurs d&#39;intérêt que les journalistes de l&#39;expression des gènes peut résoudre ce problème dans une certaine mesure, mais le temps nécessaire pour les protéines fluorescentes pour plier obscurcit début dynamique. Protéines fluorescentes à long terme peuvent aussi ne pas signaler durée de vie des ARNm. La méthode de FISH peut être utilisé pour l&#39;ARNm d&#39;essai durant son cycle de vie complet, de l&#39;initiation de la transcription dans le noyau à la suite maturation et la dégradation dans des cellules individuelles, avec une résolution de molécule unique. L&#39;original expériences in situ pour la visualisation des acides nucléiques utilisés sondes d&#39;ARN radiomarqués pour sonder des éléments d&#39;ADN. Il s&#39;agit notamment visualiser l&#39;ADN ribosomique dans les ovaires de la grenouille Xenopus laevis 2 et l&#39;ADN satellite dans les tissus de la souris 3. La première fluorescent dans exper situréalisation utilise une molécule d&#39;ARN marqué avec un fluorophore pour sonder des séquences d&#39;ADN particulières 4. La première application de sondes fluorescentes pour la visualisation de l&#39;ARN in situ est la visualisation de l&#39;expression du gène d&#39;actine de poulet dans la culture de tissus du muscle 5. Plus récemment, dans la levure bourgeonnante, le poisson a été utilisé pour étudier les oscillations dans la transcription au cours du cycle métabolique de la levure 6, la désintégration des ARNm au cours de la progression du cycle cellulaire 7, et la localisation spatiale des transcrits d&#39;ARNm lors de la mitose 8. FISH a été utilisé dans la levure de montrer que les fluctuations non corrélées dans les gènes transcrits de manière constitutive, qui constituent plus de la moitié des gènes de la levure, proviennent de l&#39;initiation de la transcription non corrélé 9. Chez les espèces non-levure, le poisson a été utilisé pour identifier les marqueurs de cellules souches dans l&#39;intestin de souris 10 et pour déterminer qui pénétrance incomplète du destin des cellules peut entraîner des fluctuations de l&#39;expression des gènes stochastiques C.elegans embryons 11. La méthode FISH décrit ici fonctionne par hybridation marquées par un colorant, des sondes d&#39;ADN simple brin de l&#39;ARNm messages. Les cellules sont imagés et ARNm sont comptées en utilisant un algorithme de détection de place. Sondes simple brin peuvent être générés avec un synthétiseur d&#39;ADN et ensuite étiquetés (appelée ici comme sondes Singer) ou commandés dans le commerce en tant que sondes pré-marqués (sondes Stellaris) 12,13. Une différence majeure entre le chanteur et Stellaris sondes est que les sondes Singer sont plus longues (~ 50 pb) et sont multi-étiquetés, tandis que les sondes Stellaris sont courts (~ 20 bp) avec une seule étiquette par sonde, tel que décrit par Raj et al 14. En outre, l&#39;approche Stellaris utilise beaucoup plus de sondes par gène que celle de Singer (~ 30 contre 5 sondes par gène, respectivement). Ci-dessous nous vous fournissons un protocole qui décrit l&#39;utilisation de chaque type de sonde. Dans la section 2, nous présentons un protocole pour l&#39;étiquetage des amino-allyle sondes thymidine contenant wvec un colorant Cy choisi. Un aperçu des étapes de calcul nécessaires pour identifier les points d&#39;ARNm unique est prévu à la section 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

La méthode hybridation fluorescente in situ (FISH) permet de détecter des acides nucléiques dans l&#39;environnement cellulaire native. Ici nous fournissons un protocole pour l&#39;utilisation de FISH pour quantifier le nombre d&#39;ARNm dans les cellules de levure simples. Les cellules peuvent être cultivées dans n&#39;importe quelle condition d&#39;intérêt et ensuite fixées et rendues perméables. Par la suite, plusieurs désoxyoligonucléotides simple brin conjugués à des colorants fluorescents sont utilisés pour étiqueter et de visualiser ARNm. Fluorescence limité par diffraction à partir de molécules d&#39;ARNm individuelles est quantifié en utilisant un algorithme de détection de point pour identifier et compter le nombre d&#39;ARNm par cellule. Bien que les méthodes de quantification plus standard de taches Nord, RT-PCR et des microréseaux d&#39;expression génique fournissent des informations sur les ARNm moyenne dans la population en vrac, FISH facilite à la fois le comptage et la localisation de ces ARNm dans des cellules individuelles à une résolution de molécule unique.

La figure 3 montre les histogrammes typiques calculés à partir des images de poissons et utilisée pour déterminer le nombre d&#39;ARNm présents dans des cellules individuelles. Un avantage important de microscopie basée sur la quantification d&#39;ARN est que l&#39;on peut obtenir des informations sur la localisation des transcriptions. Par exemple, nous avons utilisé FISH pour identifier les ARNm dans des cellules individuelles avec une inductible CBF1 allèle (figure 4). Parce que de nombreuses molécules d&#39;ARNm sont présents sur le site de transcription, nous sommes en mesure d&#39;identifier la présence et la localisation des sites de transcription dans le noyau. En utilisant différents colorants d&#39;ARNm d&#39;étiquettes de gènes différents, on peut quantifier plusieurs espèces d&#39;ARNm dans les mêmes cellules. Pour démontrer cela, les cellules de levure ont été incubées en présence de α-facteur et le sorbitol. FUS1 transcription (colorant Quasar670, rouge) est induite par α-facteur. Transcription STL1 (Quasar 570 colorant, vert) est induite par l&#39;augmentation de l&#39;osmolarité extracellulaire ( <strong&gt; Figure 5). Figure 4 est un exemple de FISH avec des sondes de chanteur. Figure 5 est un exemple de FISH avec des sondes Stellaris. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la procédure expérimentale de poissons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma de l&#39;image pipeline d&#39;analyse. Les dernières places sont déterminées dans la figure à droite. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figure 3. Histogramme des intensités de place pour un gène particulier utilisant des sondes Singer </strong&gt;. intensités de sonde sont calculées à l&#39;intérieur (rouge) et l&#39;extérieur des cellules (en bleu). Taches de faible intensité sont soit le bruit ou les sondes simples. Messages d&#39;ARNm réels sont étiquetés avec des sondes multiples. En utilisant les sondes de Stellaris, sondes simples sont moins détectables et donc les seuils et le filtrage doivent être ajustées en conséquence. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figure 4. Les résultats représentatifs de la procédure FISH Singer. Dans cette expérience, CBF1 transcription est activée par un promoteur inductible 18. Les noyaux sont colorés en bleu avec DAPI. ARNm CBF1 sont marquées avec des sondes Cy3-étiquetés. Les flèches blanches mettent en évidence la présence de CBF1 sites de transcription dans le noyau. Transcrits d&#39;ARNm simples sont visibles dans le cytoplasme. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figure 5. Les résultats représentatifs de la procédure FISH Stellaris. Cellules de levure MATa ont été simultanément exposés à 30 ng / ml α-facteur et 0,75 M sorbitol pendant 10 minutes et ont été simultanément sondé pour FUS1 (Quasar 670, rouge) et STL1 (Quasar 570, vert) transcriptions. Dans la zone en surbrillance, nous pouvons voir une cellule de répondre seulement à la phéromone (FUS1 site de départ, rouge) et un autre répondant principalement au sorbitol (site de départ STL1, vert).

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Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Ce protocole décrit une méthode expérimentale pour effectuer Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) pour compter ARNm dans des cellules individuelles à une résolution de molécule unique.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K vues.  Princeton University. Ce protocole décrit une méthode expérimentale pour effectuer Fluorescence In situ Hybridation (FISH) pour compter ARNm dans des cellules individuelles à une résolution de molécule unique.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Recherche

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.