Ce travail a été financé par un soutien à travers la Fondation McNair, NARSAD, et NINDS octroi R00NS064171-03.

1. Dans la fixation du cerveau in situ * Préparer une seringue de 10 ml (aiguille de calibre 28) rempli de tampon phosphate salin (PBS). * Préparer une seringue de 10 ml (aiguille de calibre 28) rempli avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans le PBS. Réservez un ml supplémentaires 5-10 de PFA / PBS pour la fixation de poste. <ol><li> Injecter par voie intrapéritonéale expérimental chez la souris avec une dose létale de Avertin ou Nembutal. </li><li> Une fois que la souris est sous sédatif, mouillée avec de l&#39;éthanol de l&#39;abdomen et sécuriser la souris vers le bas d&#39;un plateau de couches avec du liège, la cire, ou en élastomère de silicone utilisant des broches de dissection. Avec l&#39;abdomen vers le haut, sécuriser les quatre pattes à la surface - les répandre aussi largement que possible. </li><li> Prenez la peau avec une pince au niveau du sternum, et coupée transversalement pour exposer le foie. Couper latéralement et ensuite à travers les côtes et le diaphragme. Retirez le lambeau thoracique et continuer à réduire jusqu&#39;à ce que le coeur est accessible. </li><li> Pierce ou snip l&#39;oreillette droite pour drainer le sang circuler. </li><li> Rincer le sang résiduel du système circulatoire par une perfusion de PBS grâce ventricule gauche. </li><li> Accéder au trou de la même aiguille, fixer la souris tout en perfusion subséquente de PBS / PFA travers ventricule gauche. </li></ol> 2. Dissection et l&#39;extraction du cerveau <ol><li> Retirez la peau de la tête, du cou et du crâne en coupant autour du conduit auditif et les orbites des yeux, puis en tirant la peau vers l&#39;avant pour exposer le crâne. * Voir Figure 2 pour une illustration des étapes 2,2) à 2,5) </li><li> En utilisant une paire de ciseaux os, coupées transversalement de l&#39;oeil de la prise à travers les os du cornet nasal. Faites cela pour chaque côté. La coupe transversale devrait être antérieure pour les yeux et le bulbe olfactif. </li><li> Couper la longueur de chaque canal de l&#39;oreille à la cavité de l&#39;œil. </li><li> En utilisant une paire de ciseaux de dissection petits, couper la plaque recouvrant l&#39;os occipital le cervelet d&#39;un canal de l&#39;oreille à l&#39;autre. </li><li> Avec les ciseaux de dissection même, coupé le long de la ligne médiane antérieure au niveau des bulbes olfactifs. </li><li> En utilisant une pince, retirez chaque lame osseuse du cerveau, en prenant soin d&#39;enlever tout le tissu conjonctif de sorte que le cerveau reste intact lors du levage de l&#39;os. </li><li> Les nerfs optiques et Snip crânienne, couper les vertèbres cervicales dessus, et enlever le cerveau en fixateur. </li><li> Post-correctif pour 1-2 heures à 4 ° C. Laver 3 fois 15 min chacun dans du PBS. </li></ol> 3. Intégration Agarose <ol><li> Faire fondre 2% à haute résistance et à faible point de gel d&#39;agarose de type IB (numéro de catalogue Sigma: A0576) dans du PBS salée avec four à micro-ondes. </li><li> Transfert agarose fondu dans un tube à essai. Tube à essai Placer dans un bain chaud incubateur ou de l&#39;eau (40 ° -41 ° C) jusqu&#39;à ce que l&#39;équilibrage de température. </li><li> Collez le tissu cérébral fixé sur le piston de la seringue éprouvette avec de la colle cyanoacrylate (figure 3A). Appliquer une fine couche de gras saturés saccharose PBS solution sur la surface du tissu cérébral pour faciliter la libération ultérieure de l&#39;anneau d&#39;agarose des tranches de cerveau. </li><li> Prélèvement sur ​​le piston avec le tissu cérébral dans le boîtier du piston (figure 3B). </li><li> Pipette ou verser chaude d&#39;agarose dans le boîtier du piston, couvrant le tissu cérébral. Eviter d&#39;emprisonner des bulles d&#39;air dans l&#39;agarose. Bulles d&#39;air dans l&#39;agarose compromettra la qualité tranche. </li><li> Clamp la seringue avec un spécimen de froid (0 ° à -25 ° C) de bloc de refroidissement pendant 1 minute pour mettre l&#39;agarose (figure 3C). </li></ol> 4. Sectionnement tranche de cerveau avec le Compresstome <ol><li> Assemblez la seringue échantillon contenant les tissus du cerveau dans la Compresstome (figure 3D). </li><li> Alignez le bord de la lame de rasoir en étroite collaboration avec la sortie de la seringue éprouvette (figure 3F). </li><li> Remplir le réservoir tampon avec une solution PBS. </li><li> Tournez l&#39;épaisseur de coupe micrométrique une à l&#39;avant d&#39;extruder le bloc de tissu du cerveau d&#39;agarose de la seringue spécimen. </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;start&quot; sur l&#39;unité de contrôle de la Compresstome d&#39;engager le processus de sectionnement. </li><li> Répétez les étapes 4.4) à 4.5) jusqu&#39;à ce que les tranches souhaités sont obtenus à déterminer l&#39;épaisseur. </li><li> Récolte des tranches de cerveau avec une brosse ou pipette pour flacons ou des puits remplis coloration avec du PBS (figure 3F). </li></ol> 5. Compensation optique <ol><li> Préparer un 75% vol: vol solution de glycérol: PBS. </li><li> Versez (ou pipette) à pied la moitié du volume de PBS de lavage des tranches de cerveau prélevés. </li><li> Rajouter le volume enlevé avec glycérol / PBS. </li><li> Laisser s&#39;équilibrer en mélangeant doucement à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;évier tranches. </li><li> Répétez les étapes 6,2) à 6,4) jusqu&#39;à une concentration de glycérol final atteint 75%. </li><li> Remplacer la solution de glycérol à 90% dans le PBS et laisser s&#39;équilibrer. * Remarque: Prenez soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air tout en ajoutant des solutions de glycérol. Verser lentement solutions et mélanger délicatement, car les bulles d&#39;air vont interférer avec l&#39;uniforme Equilibration et seront reportés à montage des diapositives. </li></ol> 6. Trancher le montage pour l&#39;imagerie <ol><li> Couper joint adhésif double-face (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) dans un rectangle ouvert à s&#39;adapter à la zone visible d&#39;une lame micro (Superfrost Plus, 25 x 75 x 1 mm, cat. # 48311-703, VWR ) avec les côtés 2-3 mm de large. </li><li> Placer les tranches de cerveau à l&#39;intérieur du centre du rectangle de ruban adhésif en utilisant une pipette ou un pinceau. Retirer l&#39;excès de glycérol avec l&#39;aspiration douce. </li><li> Disposer les tranches de cerveau sur la diapositive dans l&#39;ordre désiré avec un pinceau. </li><li> Couvercle en verre délicatement inférieure (24 X 60 mm, cat. # 48383-139, VWR) sur le ruban adhésif, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air. Appuyez doucement sur le verre couvercle pour assurer le contact avec du ruban adhésif. </li><li> Aspirer le glycérol excès de bords entre lame et lamelle. </li><li> Seal et glisser la lamelle à l&#39;aide de vernis à ongles clair. </li><li> Laisser sécher avant d&#39;imagerie, ou de stocker à long terme dans des boîtes de diapositives à 4 ° C. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Traitement, l&#39;imagerie et l&#39;analyse des tissus du cerveau marqué par fluorescence sont devenus indispensables à l&#39;étude de la neurobiologie. Beaucoup de ces enquêtes exigent des manipulations génétiques sophistiquées pour obtenir l&#39;expression journaliste en sous-ensembles neuronaux ciblés, suivis par les deux analyses d&#39;images à basse et haute résolution. Souvent les limites expérimentales et techniques font qu&#39;il est impossible d&#39;obtenir ces types de données provenant du même animal, ou d&#39;une manière rapide. Préparation des opto-effacé, des coupes de cerveau semi-épais pour l&#39;imagerie fluorescente aides dans ce défi. Un exemple d&#39;une épaisse tranche de cerveau intact marqué par un virus génétiquement modifié pour exprimer la rage EGFP et imagée en utilisant la microscopie à épifluorescence et confocale est montré dans la figure 4 et figure 5, respectivement. Pour l&#39;imagerie à épifluorescence nous avons utilisé un Leica M205 FA, et pour l&#39;acquisition d&#39;image confocale, nous avons utilisé une LSM Zeiss 510. En raison de la relative simplicité du protocole joint, cette méthode est capable de produire des données utiles à partir d&#39;images tissu exprimant journalistes fluorescente avec un délai de moins d&#39;une journée, et est compatible avec la microscopie optique à la fois faible et haute résolution. Si l&#39;enquêteur choisit d&#39;incorporer à d&#39;autres méthodes de marquage autopsie, la coloration immunohistochimique, ou de faire des sections plus minces, le protocole allonge en conséquence. Cependant, la méthode décrite ci-dessus représente une méthode simple et relativement haut débit pour les modèles de dépistage de l&#39;expression journaliste vital dans le cerveau intact. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Organigramme de diagrammes de la fixation, la dissection, le tranchage, de compensation, et la procédure de montage de tranches de cerveau semi-épais. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Schéma de la coupe séquentielle étapes pour extraire le cerveau de souris intactes. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Étapes de monter et couper le tissu cérébral à l&#39;aide de la Compresstome. A) Placement de tissu cérébral sur piston de coupe en utilisant la superglue. B) Dessin bas du tissu cérébral monté dans le piston pour l&#39;intégration d&#39;agarose. C) Consolider une fiche cerveau agarose en utilisant un bloc de compression refroidie. D) Insertion de plug cerveau agarose et le piston dans la chambre de coupe Compresstome. E) L&#39;alignement de rasoir à l&#39;appareil piston. F) La coupe et la collecte des tranches de cerveau dans la chambre tampon Compresstome. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Images au microscope optique d&#39;une épaisse tranche à partir du glycérol-effacé les tissus du cerveau dans le cortex frontal amélioré exprimer la protéine fluorescente verte (EGFP). Une tranche) coronales par un cerveau de souris (200 um d&#39;épaisseur) marqué par un vecteur viral exprimant l&#39;EGFP et imagé à basse résolution en utilisant un stéréoscope épifluorescence. La barre d&#39;échelle, de 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. L&#39;image à fort grossissement de la couche marqué par fluorescence 5 / 6 neurones corticaux dans une épaisse tranche de cerveau effacés. Une image) Haute résolution confocale d&#39;une projection maximale Z-stack (150 um d&#39;épaisseur) à travers la région en surbrillance dans (figure 4). La barre d&#39;échelle, 25 um.

<ol>
	<li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Connectome Project. , (2009).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification,+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Jian-Kong Qiang est un employé de Precisionary Instruments, Inc, qui fabrique un produit utilisé dans cet article.

Compte tenu de l&#39;application généralisée de l&#39;utilisation de protéines fluorescentes de cibler des sous-ensembles neuronaux pour enquête par l&#39;intermédiaire microscopie optique, la nécessité de dépister rapidement, l&#39;image, et d&#39;analyser les réseaux de neurones dans le tissu cérébral intact est devenu une valeur inestimable. Les progrès techniques dans le développement de convivialité vecteurs viraux, en techniques d&#39;électroporation in viv...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th&gt; Nom de l&#39;élément</th&gt;<thEntreprise&gt;</th&gt;<thNuméro de catalogue&gt;</th&gt;<th&gt; Commentaires (optionnel)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ciseaux d&#39;os</td&gt;<td&gt; TSF</td&gt;<td&gt; 16044-10</td&gt;<td&gt;-Ou équivalent</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdCiseaux de dissection&gt;</td&gt;<td&gt; TSF</td&gt;<td&gt; 14084-08</td&gt;<td&gt;-Ou équivalent</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; De type IB agarose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Instruments Precisionary</td&gt;<td&gt; VF-200</td&gt;<td&gt;-Autres vibratomes sont compatibles</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adhésif double face</td&gt;<td&gt; Grace Bio-Labs</td&gt;<td&gt; SA-S-1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Superfrost Plus diapositives</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdLe verre de couverture&gt;</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glycérol</td&gt;<td&gt; EMD Chemicals Inc</td&gt;<td&gt; GX0185-6</td&gt;<td&gt;-Ou équivalent</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

a rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices

Un objectif fondamental à la fois fondamentales et cliniques en neurosciences est de mieux comprendre les identités, composition moléculaire, et des modèles de connectivité qui sont caractéristiques de neurones dans le cerveau normal et pathologique. Vers ce faire, un grand effort a été mis sur le renforcement cartes à haute résolution neuroanatomiques 1-3. Avec l&#39;expansion de la génétique moléculaire et les avancées en microscopie optique est venu la possibilité d&#39;interroger non seulement les morphologies neuronales, mais aussi la composition moléculaire et cellulaire des neurones individuels et leurs réseaux associés 4. Des avancées majeures dans la capacité de marquer et de manipuler des neurones et des gènes transgéniques par le biais des technologies de ciblage dans le rongeur désormais permettre aux enquêteurs de sous-ensembles neuronaux «programme» à volonté, 5-6. Sans doute, l&#39;une des contributions les plus influents au contemporain neurosciences a été la découverte et le clonage de gènes codant pour des protéines fluorescentes (PC) chez les invertébrés marins 7-8, aux côtés de leurs ingénieurs ultérieure pour obtenir une boîte à outils sans cesse croissant de journalistes vitale 9. Exploiter une activité de promoteur spécifique du type cellulaire pour conduire l&#39;expression ciblée de PF dans discrètes populations neuronales offre désormais enquête neuroanatomiques avec précision génétique. Ingénierie FP expression dans les neurones a considérablement amélioré notre compréhension de la structure et la fonction cérébrales. Cependant, les neurones individuels d&#39;imagerie et de leurs réseaux associés dans les tissus du cerveau profond, ou en trois dimensions, est restée un défi. Grâce à forte teneur en lipides, le tissu nerveux est assez opaque et autofluorescence expositions. Ces propriétés inhérentes biophysiques font qu&#39;il est difficile de visualiser et d&#39;image neurones marqués par fluorescence à haute résolution en utilisant la microscopie à épifluorescence standards ou confocale delà des profondeurs de plusieurs dizaines de microns. Pour contourner cette difficulté ont souvent recours à des enquêteurs de série à section mince d&#39;imagerie et de 10 méthodes de reconstruction, ou la microscopie laser à 2 photons de numérisation 11. Inconvénients actuels de ces approches sont la préparation des tissus associés de main-d&#39;œuvre, ou coût prohibitif d&#39;instrumentation, respectivement. Ici, nous présentons une méthode relativement simple et rapide de visualiser les cellules marquées par fluorescence dans les fixes semi-épais tranches de cerveau de souris en compensation optique et d&#39;imagerie. Dans le protocole ci-joint, nous décrivons les méthodes de: 1) le tissu cérébral de fixation in situ par perfusion intracardiaque, 2) la dissection et l&#39;enlèvement de cerveau entier, 3) intégrer le cerveau stationnaire dans l&#39;agarose, 4) préparation de tranches de précision semi-épais à l&#39;aide de nouveaux instruments vibratome tissus, 5) du cerveau de compensation à travers un gradient de glycérol, et 6) de fixation sur lames de verre pour la microscopie optique et z-stack de reconstruction (figure 1). Pour la préparation de tranches de cerveau nous avons mis un morceau relativement nouveau de l&#39;instrumentation appelé «Compresstome &#39;VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Cet instrument est un microtome semi-automatique équipé d&#39;une avance motorisé et le système de vibration des aubes avec des fonctions similaires en fonction de vibratomes autres. Contrairement à d&#39;autres vibratomes, le tissu à découper en tranches est montée dans un bouchon d&#39;agarose dans un cylindre en acier inoxydable. Le tissu est extrudé à des épaisseurs souhaitée dans le cylindre, et coupé par la lame vers l&#39;avant avancer vibrante. La fiche d&#39;agarose / système de vérin permet de tissus reproductibles de montage, l&#39;alignement et une coupe de précision. Dans nos mains, le «Compresstome« rendements élevés des tranches de tissu de qualité pour l&#39;électrophysiologie, l&#39;immunohistochimie et directe fixe les tissus de montage et d&#39;imagerie. Combiné avec la compensation optique, ici nous montrent la préparation de semi-épais tranches de cerveau fixes à haute résolution pour l&#39;imagerie de fluorescence.

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices at JoVE.com

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Nous décrivons ici une méthode rapide et simple à l&#39;image des cellules marquées par fluorescence dans les tranches de cerveau semi-épais. En fixant, le tranchage, et optiquement compensation du tissu cérébral, nous décrivons comment la norme d&#39;imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et des réseaux neuronaux dans les tissus nerveux intact.

Une approche rapide à l&#39;imagerie de fluorescence à haute résolution dans les tranches de cerveau semi-épais

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

a-rapid-approach-to-high-resolution-fluorescence-imaging-semi-thick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K vues.  Baylor College of Medicine (BCM). Nous décrivons ici une méthode rapide et simple à l'image des cellules marquées par fluorescence dans les tranches de cerveau semi-épais. En fixant, le tranchage, et optiquement compensation du tissu cérébral, nous décrivons comment la norme d'imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et des réseaux neuronaux dans les tissus nerveux intact.

Vidéo: A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Recherche

Neurosciences

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Haute résolution magnétique fonctionnelle Méthodes d&#39;imagerie par résonance mésencéphale humain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Haute résolution<em&gt; In Vivo</em&gt; Protocole de segmentation manuelle pour les sous-zones de l&#39;hippocampe humain Utilisation 3T imagerie par résonance magnétique

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Haute résolution structurelle Imagerie par résonance magnétique de la sous-cortex humain<I&gt; In Vivo</I&gt; Et Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d&#39;imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato - encéphalique : imagerie, Reconstruction 3D et la Quantification de la transcytose

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

Haute résolution Volume Imaging de neurones par l’eXclusion de l’utilisation de la Fluorescence méthode et dédié des dispositifs microfluidiques

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imagerie 3D haute résolution de l'infection par le virus de la rage dans un tissu cérébral éclairci par solvant

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...