La façon dont les axones naviguent dans la matrice complexe du système nerveux central est une question fondamentale en neurobiologie. Ce protocole permet d’étudier la croissance des axones et la dynamique des cônes de croissance dans l’environnement physiologique avec une imagerie à haute résolution. Ce protocole décrit un pipeline convivial de bout en bout pour la livraison d’ADN dans le cerveau embryonnaire de la souris, des préparations pour des tranches organotypiques de haute qualité et un guide étape par étape pour l’acquisition et l’analyse d’images.
Bien qu’à l’origine conçu pour étudier la dynamique des axones dans le système nerveux central embryonnaire, ce protocole pourrait être ajusté pour permettre la culture organotypique et la visualisation de la plasticité axonale après des conditions traumatiques ou pathologiques. Le protocole lui-même est relativement simple. Cependant, la réalisation de son premier étiquetage et la préservation des structures cérébrales sont des points critiques.
Par conséquent, les étapes d’électroporation, de dissection cérébrale et de tranchage nécessitent des soins supplémentaires. La démonstration de la procédure sera utile, et le doctorant est du laboratoire de Bracket. Après avoir anesthésié une souris femelle enceinte, faites une incision pour extraire les deux cornes utérines à l’aide d’un coton-tige imbibé d’une solution saline chaude ou d’une pince, en saisissant soigneusement les espaces entre les embryons.
Ensuite, placez les embryons sur de la gaze humide. Après avoir ouvert le sac utérin, retirez chaque embryon. Placez les embryons dans un plat de 10 centimètres contenant du HBSS complété par du glucose sur de la glace.
Pour l’électroporation ex utero, ramassez un embryon et placez-le dans le support. Ensuite, insérez soigneusement le capillaire en verre contenant le mélange vert rapide d’ADN à travers le crâne embryonnaire dans le ventricule latéral et injectez deux à trois microlitres du mélange de plasmides d’ADN dans chaque ventricule. Ensuite, maintenez la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à platine à l’angle approprié pour cibler la zone cérébrale souhaitée, la cathode faisant face à la zone où le transfert d’ADN est prévu.
Pour l’électroporation in utero, après avoir retiré les cornes utérines et placé les embryons sur une gaze humide comme démontré précédemment, utilisez le bout des doigts pour faire pivoter doucement l’embryon à l’intérieur de l’utérus jusqu’à ce que les sutures lambdoïdales et saggitales soient localisées. Ensuite, insérez soigneusement le capillaire en verre contenant le mélange vert rapide de l’ADN à travers la paroi utérine et le crâne embryonnaire dans le ventricule latéral, et injectez deux à trois microlitres du mélange de plasmides d’ADN dans un ou les deux ventricules comme souhaité avec un maximum de deux microlitres par ventricule. Après l’injection, maintenez la tête de l’embryon entre les électrodes de la pince à platine à l’angle approprié pour cibler la zone cérébrale souhaitée avec la cathode face à la zone où le transfert d’ADN est prévu.
Une fois que tous les embryons requis ont été électroporés, utilisez un coton-tige trempé dans une solution saline pour replacer doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale. Suturez les incisions musculaires et cutanées à l’aide d’un matériau de suture 5-0, puis fixez la plaie à l’aide de clips de suture et désinfectez la plaie en la pulvérisant avec de la bétadine. Replacez la souris dans la cage de récupération et maintenez la chaleur à l’aide d’une lumière chauffante infrarouge lointaine pendant au moins 20 minutes après la procédure.
Fixez la tête de l’embryon sous un microscope à dissection. Ensuite, retirez la peau du crâne en coupant le long de la ligne médiane en partant de la base de la tête vers le nez. Pelez la peau du crâne latéralement en faisant un espace assez grand pour que le cerveau soit excisé.
Ensuite, pour retirer le cerveau, insérez la pointe fermée de ciseaux de dissection stériles commençant sous le bulbe olfactif et se déplaçant vers le tronc cérébral. Ensuite, coupez le tronc cérébral et coupez de nombreux morceaux de méninges autour du cerveau. À l’aide d’une cuillère perforée, ramassez le cerveau et retirez l’excès de liquide en tamponnant le fond de la cuillère contre du papier de soie sec.
Ensuite, placez le cerveau dans un plat d’agarose sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une cuillère plus petite, mélangez l’agarose pendant 10 secondes pour un refroidissement uniforme, puis manœuvrez le cerveau au milieu du plat en le plaçant horizontalement avec la face dorsale vers le haut et en vous assurant qu’il est complètement recouvert d’agarose de toutes les directions. Ramassez doucement le bloc d’agarose du poste de travail Vibratome et séchez le fond en tamponnant contre du papier de soie.
Placez ensuite le bloc sur la zone collée du porte-spécimen avec le côté rostral du cerveau vers le haut et mettez le porte-spécimen sur la glace. Laissez sécher la colle pendant une minute. Coupez le cerveau en tranches coronales à un angle de 15 degrés.
Ensuite, à l’aide de spatules propres, collectez les tranches de cerveau et placez-les sur une membrane en PTFE immobilisée dans un plat à fond en verre de 35 millimètres à l’aide de Parrafin. Collectez jusqu’à cinq tranches de cerveau par membrane. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez l’excès de solution de glucose HBSS autour des tranches de la membrane, laissant les tranches semi-sèches, puis ajoutez 500 microlitres de milieux de tranches préavertis directement dans l’espace sous la membrane et incubez les tranches à 35 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Pour l’imagerie de la croissance des axones, localisez une région du cortex avec une densité cellulaire faible à moyenne. Alors que pour l’imagerie de la dynamique du cône de croissance, localisez un cône de croissance dans la zone immédiate ou la zone sous-ventriculaire du cortex. Définissez ensuite une taille de pile Z.
Pour la croissance axonale dans une grande pile Z, définissez une taille de pas de deux micromètres et pour les cônes de croissance dans une pile Z plus petite, définissez une taille de pas d’un micromètre. Pour l’analyse des données, ouvrez le fichier image aux Fidji en cliquant sur fichier, puis en l’ouvrant et en sélectionnant l’image. Obtenez la projection d’intensité maximale du laps de temps en cliquant sur l’image, suivie des piles, de la projection Z et de la projection d’intensité maximale.
Parcourez le laps de temps et localisez un axone en croissance. Une fois localisé, tracez une ligne à travers l’axone en croissance, en commençant par la pointe de l’axone dans la première image et en suivant l’axone tout au long du laps de temps. Ensuite, chantez le plugin kymo re-slice large.
Définissez l’échelle du kymographe en accédant à l’image, puis aux propriétés. Après avoir défini la distance en micromètres, la largeur des pixels et le temps en secondes ou en minutes, ainsi que la hauteur des pixels, allez analyser et cliquez sur Mesurer. Pour mesurer le volume du cône de croissance, ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’image en cliquant sur fichier, ouvrir et en sélectionnant le fichier d’intérêt.
Ensuite, sélectionnez l’assistant d’ajout de nouvelles surfaces à la première étape, sous Paramètres de l’algorithme, sélectionnez segmenter uniquement une région d’intérêt et, à la deuxième étape, recadrez l’image pour l’adapter à l’ensemble du cône de croissance dans toutes les images. Ensuite, à la troisième étape, maintenez le seuil à l’intensité absolue et, à la quatrième étape, assurez-vous que toute la région du cône de croissance est seuillée. Ensuite, à l’étape cinq, sous le type de filtre, sélectionnez le nombre de voxels LMG à un.
Sélectionnez le bouton Exécuter pour effectuer toutes les étapes de création et mettre fin à l’assistant d’ajout de nouvelles surfaces. Enfin, dans l’onglet Statistiques en haut de la fenêtre de l’assistant, sélectionnez des valeurs et un volume spécifiques sous l’onglet détaillé. En règle générale, les tranches de cerveau cultivées avec succès dérivées de l’électroporation in utero ou ex utero montrent une distribution cellulaire normale et un ensemble organisé de glie radiale avec des processus de contact pilo orientés vers l’ap.
Parfois, une électroporation ex utero a marqué des perturbations dans l’échafaudage glial radial et les tranches de cerveau cultivées sont observées, ce qui rend cette coloration de contrôle recommandable. Un neurone cortical pyramidal représentatif projetant exprimant Lyn-mNeonGreen et le comportement dynamique de son cône de croissance est montré ici. De plus, les neurones ont été marqués à l’aide d’une sonde d’actine exprimant le plasmide pour analyser la dynamique de l’actine des cônes de croissance axonale in situ.
Des expériences in situ ont également été réalisées avec un double fluorophore cre dre exprimant la conception plasmidique, où les fluorophores tRFP ou ZsGreen pourraient être activés spécifiquement et individuellement par dre ou cre recombinases, respectivement dans les neurones voisins. À partir des kymographes, les paramètres de croissance dynamique tels que la vitesse de croissance de plusieurs axones et le volume du cône de croissance au fil du temps sont facilement obtenus. Cela peut être utilisé pour évaluer la vitesse du tapis roulant d’actine et l’équilibre entre les filopodes et les lamellapodies pendant l’activité d’exploration du cône de croissance.
Il est important de maintenir la structure du cerveau et d’affiner les concentrations de plasmides pour obtenir un marquage clairsemé. Ceci est crucial pour une visualisation précise des axones et des cônes de croissance dans le cortex. En fonction des plasmas sélectionnés et du fond génétique, ce protocole permet aux utilisateurs de modifier les neurones ou l’environnement dans lequel ils se développent, ce qui permet un large éventail d’études.
En permettant un accès haute résolution aux neurones in situ, cette technique permet aux neuroscientifiques d’interroger l’interaction dynamique entre les cônes de croissance et les mesures du système nerveux central aux niveaux morphologique et moléculaire.
