La méthode d’enregistrement optique avec colorant sensible à la tension est considérée comme une technologie idéale pour visualiser le fonctionnement du cerveau. Cette méthode nous a permis d’enregistrer une dynamique neuropsychique de façon stably et fiable sur 12 heures, nous a donné un point de vue sur l’activité psychique. Nous essayons d’élargir l’application pour détecter les changements de circuit causés par les produits chimiques à toutes les étapes du développement, comme l’application d’acide précieux aux mères.
La technique est déjà bien établie. S’il vous plaît essayer de reproduire les études en suivant la méthode présentée ici. Pour commencer cette procédure, immerger la tête décapitée dans l’ACSF glacé dans un plateau chirurgical en acier inoxydable.
Extraire le cerveau en une minute et le placer dans un bécher contenant de l’ACSF réfrigéré pendant cinq minutes. Ensuite, divisez la section du cerveau à la ligne médiane avec un scalpel et placez les deux hémisphères sur un bloc d’agar de 4%. Ensuite, placez le bloc cérébral avec les deux hémisphères sur un bloc d’agar de 4%.
Essuyer l’excès d’ACSF du bloc à l’aide d’un papier filtre. Par la suite, appliquez de la superglue sur la plate-forme vibratoire. Placez le bloc d’agar dessus et essuyez l’adhésif excessif avec un papier filtre.
Appliquez doucement une petite quantité d’ACSF glacé à partir du haut du bloc d’agar du cerveau pour aider à solidifier l’excès de superglue et pour empêcher la colle de couvrir le cerveau et de perturber le tranchage. Par la suite, fixez la plate-forme au plateau vibratoire et versez l’ACSF modifié. Réglez le vibratome à une vitesse lente et avoir la fréquence de la lame à son réglage maximum.
Ensuite, commencez à trancher. Placez les tranches dans le coin de la chambre de tranche dans l’ordre de sorte que l’ordre des tranches puisse être facilement distingué. Habituellement, trois à cinq tranches peuvent être obtenues à partir d’un hémisphère.
Ensuite, coupez la partie du tronc cérébral à l’aide d’une aiguille de calibre 30. À l’aide d’un petit pinceau à pointes, placez la tranche sur le filtre membranaire retenu avec un anneau en plexiglas. Placez l’anneau dans une chambre de récupération humide et fixez le couvercle pour maintenir la pression intérieure élevée.
Lorsque vous placez la tranche sur le filtre membranaire, ajustez la direction et la position de la tranche à l’intérieur de l’anneau pour vous assurer qu’elle est bien centrée et qu’elle a une direction uniforme. Laissez le spécimen à 28 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à température ambiante pendant au moins 10 à 30 minutes pour la récupération. Pour tacher les tranches, appliquer délicatement 100 microlitres de la solution de coloration sur chaque tranche et incuber à 20 minutes pour la température ambiante.
Ensuite, préparez 50 à 100 millilitres d’ACSF dans un récipient. Placez l’anneau avec le spécimen dedans pour rincer la solution de coloration. Ensuite, transférez les tranches rincées dans une autre chambre d’incubation.
Attendez plus d’une heure pour récupérer avant l’expérience. Pour commencer cette procédure, allumez l’amplificateur, l’ordinateur et le système de caméra et ouvrez le logiciel. Verser l’ACSF dans un tube de 50 millilitres et le bouillonner de carbogen.
Utilisez une pompe périssaltique pour faire circuler l’ACSF et ajuster le débit à environ un millilitre par minute. Ensuite, ajustez la hauteur de la pipette d’aspiration de sorte que le niveau liquide à l’intérieur de la chambre d’expérience est toujours constant. Placez l’électrode au sol dans la chambre.
Par la suite, remplissez l’électrode de verre avec une petite quantité d’ACSF et placez-la dans le support d’électrode. Attachez le support à la tige du manipulateur. À l’aide d’un amplificateur, assurez-vous que la résistance aux électrodes est d’environ un mégaohm.
Dans la session d’enregistrement, transférer une tranche de la chambre humide à une chambre expérimentale. Appuyez fermement sur le bord de l’anneau dans l’anneau en silicone. Veillez à ne pas briser la membrane ou le fond de la chambre d’expérimentation.
Sous le microscope placer la pointe de l’électrode stimulante et l’électrode d’enregistrement potentiel sur le terrain sur la tranche. Vérifiez la réponse évoquée en fournissant un stimulus. Confirmez que le champ de vision couvre le circuit neuronal droit dans le système d’enregistrement optique.
Ensuite, ajustez l’intensité lumineuse d’excitation à environ 70 à 80% de la capacité maximale de la caméra. À l’aide de la source de lumière fluorescente, réglez la mise au point avec le système d’acquisition. Ensuite, démarrez l’enregistrement et analysez les données dans un logiciel d’acquisition d’images après l’acquisition.
Ce chiffre montre le signal optique représentatif lors de la stimulation électrique du collaterol schaffer dans la zone CA1 d’une tranche hippocampale de souris. Ces images consécutives montrent le signal optique avant que des filtres spacial et temporels aient été appliqués tandis que ces images montrent les mêmes données après application d’un filtre cube cinq par cinq par cinq deux fois. En raison de la vitesse d’image élevée et de la haute résolution spatiale, l’application du filtre n’a pas changé le signal, mais filtré le bruit qui peut également être observé dans le cours du temps enregistré en pixels dans un seul essai.
Voici la comparaison des réponses typiques dans la zone CA1 des tranches hippocampiques entre la souris et le rat. La petite réponse hyperpolarisante est observée dans le côté distal du CA1 après 24 millisecondes dans la tranche hippocampal de souris, mais la réponse hyperpolarisante plus massive a dépassé la réponse dépolarisante dans la tranche hippocampal de rat. Une fois que les tranches sont tachées, elles devraient durer plus de 12 heures et vous pouvez effectuer d’autres enregistrements électrophysiologiques sur eux.
