Les travaux pris en charge par des subventions des National Institutes Health R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 base en recherche et établissements d&#39;enseignement supérieur. Son contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de NIH ou HEI. Les auteurs déclarent aucun conflit existant ou potentiel d&#39;intérêts.

1. Isolement des cellules ciliées externes <ol><li> Commencez cette procédure par la récolte os temporaux de porcs Guinée, souris ou votre modèle animal mammifères. </li><li> Ensuite, ouvrez l&#39;os temporal en utilisant une pince du marteau afin d&#39;exposer la cochlée, et les plonger dans Leibovitz L-15. Enlever l&#39;excès d&#39;os soigneusement, en gardant la coquille osseuse intacte. Considérant que la présente est une procédure générale applicable aux os temporaux de toute espèce de mammifère, des modifications mineures à la technique peut être nécessaire lorsqu&#39;il s&#39;agit d&#39;os temporaux très petits animaux. Chez les animaux de la vieille bulle est généralement calcifiée, introduisant une complication supplémentaire à la procédure. </li><li> Sous observation microscopique, ouvrez la région apicale de la cochlée et enlever strie vasculaire et de ligament spiral en utilisant la pointe d&#39;une lame de bistouri n ° 11, un point de micro et de prendre une pince fine. </li><li> Prenez l&#39;organe de Corti hors du modiolus cochléaire à l&#39;aide de la pince, et le mettre dans la collagénase 1mg/ml dans le L-15 à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Si CCE à partir tourne basale de la cochlée sont nécessaire, retirez la coquille osseuse recouvrant la base de la cochlée avec la pioche, et séparer la spirale de l&#39;os temporal à l&#39;aide de la lame du scalpel avant de retirer l&#39;organe de Corti. </li><li> Transfert l&#39;organe de Corti à la chambre d&#39;enregistrement en utilisant une seringue de 50 uL de Hamilton. Ensuite, les cellules se dissocient par le reflux de l&#39;aiguille. </li></ol> 2. Installation expérimentale <ol><li> Schéma du champ alternatif externe (EAEF) générateur électrique et de leurs liens avec le système de capture d&#39;image (Fig. 1). Le circuit de commande a été spécialement mis en place au cœur de l&#39;ingénierie House Ear Institute. </li><li> Le dispositif expérimental utilisé dans nos expériences se compose d&#39;un microscope inversé Axiovert 135TV (Zeiss, Thornwood, NY) avec un système d&#39;éclairage à base de LED de remplacement (High Power LED System-36AD3500, Technologies de Lightspeed, Campbell, CA), deux micromanipulateurs électronique (Eppendorf &quot;PatchMan&quot;, Allemagne), un PC contrôlé à ultra-haute vitesse Photron FastCAM X 1024 PCI caméra (Photron USA Inc) dans le port Keller et une caméra CCD ordinaire supplémentaire dans le port trinoculaire. La caméra FastCAM est capable de capturer des images à des fréquences élevées (jusqu&#39;à 100 000 fps) et haute résolution (par exemple, 1024 x 1024 pixels à 1000 images par seconde, 512 x 128 à 10 000 fps, 384 x 96 à 18.000 fps, et ainsi de suite). Les images fournies par la caméra à haute vitesse sont directement observés dans le moniteur du PC, tandis que la caméra CCD est connecté à un autre moniteur. Le système d&#39;éclairage à base de LED fonctionne en deux modes différents: faible puissance analogiques et numériques de haute puissance. Toutes les procédures préliminaires (positionnement des électrodes, le positionnement des cellules, la concentration, etc) sont effectuées en utilisant le mode de faible puissance analogique. L&#39;éclairage à haute puissance est activé par l&#39;ouverture de l&#39;obturateur de caméra et ensuite éteint par la fermeture de l&#39;obturateur, ce qui facilite la dissipation de chaleur. Logiciel maison, également développé au cœur House Ear Institut de génie, fonctionnant sur le même PC contrôle l&#39;élément déclencheur de la caméra à haute vitesse, le système d&#39;éclairage à base de LED, et le EAEF. Un appareil photo numérique conventionnel dans le port avant permet encore des images si nécessaire. (Fig. 2 A). </li><li> Électrodes (deux 0,25 mm de diamètre fils Ag avec la distance pointe de 0,8 mm) sont entraînés à la position en utilisant l&#39;un des micromanipulateurs électronique. La position des électrodes est contrôlé visuellement et par l&#39;image microscopique, un changement dans le plan focal de l&#39;image indique que les électrodes touché le fond de la chambre expérimentale. Initialement, le champ électrique est calibré en utilisant une électrode externe. Cette électrode mesure le potentiel électrique à différents points, générant une «carte» du champ électrique. Si une seule cellule isolée ciliées externes est placée entre les extrémités des électrodes avec son axe longitudinal parallèle à l&#39;EAEF appliquée, elle se déplacera allongeant et en raccourcissant à la même fréquence du champ électrique. Si la cellule est placée perpendiculairement au champ d&#39;un autre type d&#39;OHC réponse (flexion) peut être observé et étudié. (Fig. 2 B) </li></ol> 3. La stimulation et la capture d&#39;image EAEF <ol><li> Quatre protocoles de stimulation différentes sont sélectionnables (Fig. 3): <ol><li> continue à fréquence unique (Fig. 3 A). Notez que le type de mode de stimulation, la fréquence, l&#39;amplitude et la vague peut être sélectionné en utilisant la maison logiciel de contrôle (cercles rouges). </li><li> bursted fréquence unique (Fig. 3 B). La longueur des rafales et les écarts entre éclatement sont également sélectionnables. </li><li> balayage linéaire (fig. 3 C). Les fréquences initiales et finales sont sélectionnables. </li><li> multi-stimulation (Fig. 3 D). Fréquence unique et des balayages linéaires peuvent être combinés en une seule expérience. Après avoir sélectionné les paramètres correspondants, le logiciel de contrôle configure le système et permet à l&#39;opérateur de lancer léger synchronisé enregistrement vidéo et la stimulation des cellules en cliquant sur un bouton uniquel&#39;écran d&#39;ordinateur. </li></ol></li><li> Les images sont capturées au format AVI pour une analyse plus poussée à des fréquences élevées. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <ol><li> Dans ce film, deux isolés cellules ciliées externes montrent des changements dans la longueur ou la courbure quand ils sont stimulés par un champ électrique externe alternance qui est parallèle ou transversale, respectivement, à leur axe longitudinal. (Film n ° 2). </li><li> Réponses sont analysées CCE mobiles off-line en utilisant le logiciel ProAnalyst (Xcitex Inc, Cambridge, MA). «Tracking Feature&quot; fonction dans ce logiciel fournit la distance entre deux points de trame par trame (fig. 4). Pendant la cellule de raccourcir la distance entre les points sélectionnés à l&#39;apex (plaque cuticulaire; couleur rouge) et la base de la cellule (pôle basal; couleur verte) est plus petit, et augmente avec l&#39;élongation des cellules. Le film montre le logiciel analyse trame par trame des changements dans la longueur. Le panneau en bas de l&#39;image montre la trace du mouvement. Dans cet exemple, la variation totale de longueur est d&#39;environ 6,5 pixels. </li><li> &quot;Contour Tracking&quot; de fonction dans le logiciel peut détecter ProAnalyst bord des cellules et mesurer automatiquement l&#39;aire de la section optique (fig. 5). </li><li> Microsphères de polystyrène ajouté à la solution du bain de manière aléatoire et fixer solidement à la membrane plasmique (Fig. 6 A). Différents microsphères peuvent être sélectionnés simultanément, et le logiciel peut automatiquement suivre tous trame par trame. De cette façon, les cellules peuvent être divisés en sections et la motilité de chaque section évaluée indépendamment. (Fig. 6 A) </li><li> En sélectionnant microsphères situé sur les bords latéraux de l&#39;image des cellules, des changements dans la longueur de chaque segment et les changements de l&#39;angle d&#39;un point à d&#39;autres segments (flexion) peut également être évalué de manière indépendante. (Figure 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma du générateur EAEF et leurs liens avec le système de capture d&#39;image. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Une image) de l&#39;installation expérimentale. B) Détail de la platine du microscope, avec les caricatures des électrodes et un seul OHC placé entre eux avec son axe longitudinal parallèle au champ électrique. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Une interface utilisateur) du logiciel de contrôle maison configuré pour une seule fréquence de stimulation. Les paramètres sélectionnés sont entourées en rouge. B) Interface Utilisateur du logiciel maison de commande configuré pour seule rafale, la fréquence de stimulation. Interface Utilisateur C) du logiciel maison de commande configuré pour une stimulation balayage linéaire. L&#39;interface utilisateur D) du logiciel de contrôle maison configuré pour le multi-stimulation. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Cadre unique d&#39;une OHC à deux points sélectionnés à la base (vert) et l&#39;apex (rouge) de la cellule, respectivement, en utilisant le &quot;suivi Feature&quot; fonction du logiciel ProAnalyst. La courbe ci-dessous la cellule montre les changements périodiques de la distance entre les points sélectionnés associés à une stimulation électrique. Déplacement de la barre verticale des cadres différents peuvent être sélectionnés pour une analyse individuelle. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. Le &quot;suivi de contour&quot; fonction dans ProAnalyst détecte le bord des cellules et mesurer automatiquement l&#39;aire de la section optique. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. A l&#39;image) Capturé d&#39;une OHC isolés décorées avec microsphères de polystyrène (en haut), et la même image avec cinq microsphères sélectionnées individuellement (en bas). Une couleur différente est attribuée à chaque microsphère, et leurs déplacements peuvent être individuellement et automatiquement frame par frame suivis, analysés et comparés. B) des segments de longueur arbitraire peut être défini en sélectionnant microsphères de polystyrène situé sur les bords de la cellule, et les changements de longueur de ces segments ainsi que des changements dans l&#39;orientation d&#39;un segment à respecter les autres (cellulaire flexion) peuvent être automatiquement évalués image par cadre avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Film 1. Isolement des cellules ciliées externes de porc Guinée. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> Movie 2. CCE parallèles et perpendiculaires à l&#39;EAEF montrant électromotilité typiques et les réponses de flexion. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a>

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	<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells.">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+motility.">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li><li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin,+a+new+type+of+motor+protein.">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field.">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells.">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li><li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells.">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li><li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+cochlear+amplifier.">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li><li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field.">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li><li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+outer+hair+cell+motility:+corrections+and+addendum.">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li><li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells.">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility:+effects+of+the+membrane+filter.">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li><li>Inou&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Video Microscopy. , (1986).</li></ol>

La méthode expérimentale présentée ici permet d&#39;estimer les réponses OHC mobiles de la gamme kHz sans aucune restriction aux mouvements de la cellule. Différents protocoles de stimulation, d&#39;autres marqueurs (microsphères), comme des changements dans l&#39;orientation même de la cellule par rapport au champ électrique, permettant d&#39;étudier de nouveaux aspects de la motilité OHC avec un niveau de détail jusque-là inaccessibles. D&#39;autres méthodes, par exemple ceux utilisant des photodiodes <s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase (type 4) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 1mg/mL L-15 </td></tr></tbody></table>

investigating outer hair cell motility with a combination of external alternating electrical field stimulation and high-speed image analysis

CCE sont cylindriques cellules sensori situé dans l&#39;organe de Corti, l&#39;organe auditif dans l&#39;oreille des mammifères intérieure. Le nom de «cellules ciliées» découle de leur bundle apicale caractéristique de stéréocils, un élément essentiel pour la détection et la transduction de l&#39;énergie sonore 1. CCE sont en mesure de changer de forme allongée, de raccourcir et pliez-en réponse à une stimulation électrique, mécanique et chimique, une réponse motrice considérée comme cruciale pour l&#39;amplification des signaux acoustiques cochléaires 2. La stimulation OHC induit deux réponses différentes mobiles: i) électromotilité, alias la motilité rapide, les changements de longueur dans l&#39;ordre de la microseconde issus de propulsion électrique des changements conformationnels dans les protéines motrices denses dans OHC membrane plasmique, et ii) la motilité lente, les changements de forme dans le milliseconde à quelques secondes d&#39;intervalle sur la réorganisation du cytosquelette 2, 3. OHC flexion est associée à électromotilité, et résulter soit d&#39;une distribution asymétrique des protéines motrices dans la membrane plasmique latérale, ou asymétrique stimulation électrique de ces protéines motrices (par exemple, avec un champ électrique perpendiculaire à l&#39;axe longitudinal des cellules) 4. Stimuli mécaniques et chimiques induisent des réponses lentes essentiellement mobiles, même si les changements dans les conditions ioniques des cellules et / ou leur environnement peuvent aussi stimuler la membrane plasmique-embedded protéines motrices 5, 6. Depuis réponses OHC mobiles sont une composante essentielle de l&#39;amplificateur cochléaire, l&#39;analyse qualitative et quantitative de ces réponses mobiles à des fréquences acoustiques (environ de 20 Hz à 20 kHz chez l&#39;humain) est une question très importante dans le domaine de l&#39;audition de recherche 7. Le développement de la nouvelle technologie d&#39;imagerie combinant caméras vidéo à haute vitesse, des systèmes d&#39;éclairage à base de LED, et un logiciel sophistiqué d&#39;analyse d&#39;image offre désormais la possibilité d&#39;effectuer qualitatives fiables et des études quantitatives de la réponse motiles des CCEs isolées à un champ électrique externe en alternance (EAEF) 8. C&#39;est une technique simple et non invasive qui contourne la plupart des limitations des approches précédentes 9-11. Par ailleurs, le système d&#39;éclairage à base de LED offre une luminosité extrême, avec des effets négligeables thermique sur des échantillons et, en raison de l&#39;utilisation de la microscopie vidéo, la résolution optique est d&#39;au moins 10 fois plus élevée qu&#39;avec les techniques classiques microscopie optique 12. Par exemple, avec le dispositif expérimental décrit ici, les changements de longueur de cellules d&#39;environ 20 nm peuvent être systématiquement et de manière fiable détecté à des fréquences de 10 kHz, et cette résolution peut être encore améliorée aux basses fréquences. Nous sommes confiants que cette approche expérimentale permettra d&#39;étendre notre compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la motilité OHC.

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Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

Une méthode fiable pour enquêter sur des cellules ciliées externes (CCE) des réponses mobiles, y compris électromotilité, la motilité lente et à la flexion, est décrite. Motilité OHC est provoqué par la stimulation par un champ électrique externe en alternance, et la méthode tire parti de l&#39;enregistrement d&#39;images à haute vitesse, un éclairage à base de LED, et la dernière génération de logiciels d&#39;analyse d&#39;image.

Enquêter Outer motilité cellulaire cheveux avec une combinaison de stimulation externe champ électrique alternatif et analyse d&#39;images à haute vitesse

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

investigating-outer-hair-cell-motility-with-combination-external

Research

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Neuroscience

13.4K vues.  House Ear Institute. Une méthode fiable pour enquêter sur des cellules ciliées externes (CCE) des réponses mobiles, y compris électromotilité, la motilité lente et à la flexion, est décrite. Motilité OHC est provoqué par la stimulation par un champ électrique externe en alternance, et la méthode tire parti de l'enregistrement d'images à haute vitesse, un éclairage à base de LED, et la dernière génération de logiciels d'analyse d'image.

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Utilisation du protocole Theta-Burst à explorer Mechasnism de la plasticité chez les individus atteints du syndrome du X fragile et autisme

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Recherche

Neurosciences

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

A Human-machine-interface Integrating Low-cost Sensors with a Neuromuscular Electrical Stimulation System for Post-stroke Balance Rehabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing delivery of oxygen and nutrients. About half of the stroke survivors are left with some degree of disability. Innovative methodologies for restorative neurorehabilitation are urgently required to reduce long-term disability. The ability of the nervous system to reorganize its structure, function and connections as a response to intrinsic or extrinsic stimuli is called neuroplasticity. Neuroplasticity is involved in post-stroke functional disturbances, but also in rehabilitation. Beneficial neuroplastic changes may be facilitated with non-invasive electrotherapy, such as neuromuscular electrical stimulation (NMES) and sensory electrical stimulation (SES). NMES involves coordinated electrical stimulation of motor nerves and muscles to activate them with continuous short pulses of electrical current while SES involves stimulation of sensory nerves with electrical current resulting in sensations that vary from barely perceivable to highly unpleasant. Here, active cortical participation in rehabilitation procedures may be facilitated by driving the non-invasive electrotherapy with biosignals (electromyogram (EMG), electroencephalogram (EEG), electrooculogram (EOG)) that represent simultaneous active perception and volitional effort. To achieve this in a resource-poor setting, e.g., in low- and middle-income countries, we present a low-cost human-machine-interface (HMI) by leveraging recent advances in off-the-shelf video game sensor technology. In this paper, we discuss the open-source software interface that integrates low-cost off-the-shelf sensors for visual-auditory biofeedback with non-invasive electrotherapy to assist postural control during balance rehabilitation. We demonstrate the proof-of-concept on healthy volunteers.

A novel low-cost human-machine interface for interactive post-stroke balance rehabilitation system is presented in this article. The system integrates off-the-shelf low-cost sensors towards volitionally driven electrotherapy paradigm. The proof-of-concept software interface is demonstrated on healthy volunteers.

Une machine à interface humaine Intégration de capteurs à faible coût avec un système de stimulation neuromusculaire électrique pour post-AVC Solde Réhabilitation

A stroke is caused when an artery carrying blood from heart to an area in the brain bursts or a clot obstructs the blood flow to brain thereby preventing ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

Évaluation des systèmes neuromusculaire Fonction Utilisation percutanée électrique stimulation du nerf

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles d&#39;analyser motilité gastro-intestinale chez la souris

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Effets de la Stimulation transcrânienne courant alternatif sur le Cortex moteur primaire par en ligne approche combinée avec la Stimulation magnétique transcrânienne

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Stimulation transcrânienne électrique cérébrale chez les rongeurs alertes

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

La Stimulation électrique chronique transcrânienne et Intracortical enregistrement chez le rat

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...