Stentor coeruleus a longtemps été utilisé comme organisme modèle pour comprendre la régénération unicellulaire. Bien que la chronologie de la régénération morphologique visuelle soit connue, la chronologie de la régénération fonctionnelle reste inconnue. Ce test suit la motilité de la population centrale subissant une régénération synchronisée de sorte que la récupération de la fonction de perte peut être quantifiée.
Il peut être adapté pour une utilisation avec d’autres types de cellules. L’absence d’un joint sécurisé de la chambre d’imagerie entraînera des fuites de puits les uns dans les autres ou la formation de bulles d’air à l’intérieur des puits. Pour les chercheurs qui ne sont pas familiers avec l’utilisation d’entretoises en silicone, nous recommandons fortement que le PSSP ou un autre milieu propre soit pipeté dans chacun des puits pour tester les fuites avant utilisation.
La construction des chambres d’échantillonnage est plus facile à montrer qu’à décrire verbalement. Tout comme le processus d’extraction des modèles de motilité à partir des données vidéo acquises. Pour commencer, coupez un morceau de feuille d’espacement en silicone de 250 micromètres d’épaisseur légèrement plus petit en hauteur et en largeur qu’une lame de microscope.
Utilisez un poinçon entier pour créer des puits circulaires laissant suffisamment d’espace entre les puits voisins pour assurer une bonne étanchéité. Initier la régénération de l’appareil buccal en incubant des cellules de stentor coeruleus dans 10% de saccharose ou 2% d’uri pendant deux minutes. Ensuite, lavez trois fois avec du milieu frais.
Pipettez doucement environ 10 pupitres dans chaque puits. En prenant soin de faire correspondre le volume de l’échantillon au volume du puits aussi étroitement que possible. Fermez les puits en abaissant doucement un morceau de verre de couverture sur les puits à partir d’un bord.
Utilisez un objet étroit et légèrement flexible, tel qu’une pointe de pipette de 10 microlitres pour appuyer sur le verre de couverture où il entre en contact avec la feuille de silicone pour assurer une bonne étanchéité. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et réglez le microscope sur le grossissement le plus bas disponible afin qu’il s’insère bien dans le cadre. Commencez le laps de temps et acquérez une vidéo de dix secondes à 30 images par seconde de chaque puits à chaque point temporel.
Pour calibrer, obtenez une image claire d’une diapositive d’étalonnage ou d’une règle claire avec les mêmes paramètres de grossissement que les vidéos. À l’aide de n’importe quel programme de visualisation d’images, comptez le nombre de pixels entre les marques d’une distance physique connue. Téléchargez les deux scripts, les cellules de suivi et nettoyez les traces dans un emplacement facile à retenir sur l’ordinateur et transférez également les vidéos de données sur cet ordinateur.
Organisez les vidéos de données dans des dossiers. Un pour chaque point de temps. Utilisez les cellules de piste de script pour effectuer un suivi automatisé des cellules dans les vidéos de données en ouvrant les cellules de piste et en exécutant le script Choisissez ajouter au chemin d’accès si vous y êtes invité par une fenêtre contextuelle qui ne se produira généralement que lorsque le script est exécuté pour la première fois à partir d’un dossier donné.
Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez une ou plusieurs vidéos de données pour lancer le suivi. Accédez aux vidéos de données et une fois satisfait de la liste des fichiers, cliquez sur ouvrir"Pour rejeter manuellement les traces anormales ou fausses, ouvrez les traces propres dans la fenêtre de l’éditeur MATLAB en double-cliquant sur le fichier. À l’invite, sélectionnez la sortie du dossier de données par cellules de piste.
Accédez à l’un des dossiers créés et sélectionnez-le. Lorsque vous y êtes invité, entrez un pour conserver la trace et zéro pour rejeter la trace. Appuyez ensuite sur Entrée pour passer à la trace suivante.
Commencez par télécharger le script intitulé spaghetti plots. Ouvrez et exécutez le script. Lorsque la fenêtre du navigateur de fichiers apparaît avec l’invite, sélectionnez le dossier à ouvrir.
Accédez au dossier de l’un des points temporels. Lorsque vous y êtes invité, étalonnage, quel est le nombre de pixels par millimètre? Saisissez la valeur d’étalonnage et appuyez sur Entrée.
Ajustez les axes du tracé si nécessaire en modifiant la ligne 55 du script, qui par défaut est définie sur RR égal à quatre. pour inclure un rayon allant jusqu’à quatre millimètres. Enregistrez le tracé.
Les résultats montrent la motilité collective de la population de cellules stentor à deux, trois, sept et huit heures dans le processus de régénération de l’appareil buccal. Ces graphiques montrent à la fois l’augmentation attendue du nombre d’individus mobiles et l’augmentation par quatre de la gamme des cellules les plus mobiles au sein de la population. Les cellules de nage les plus rapides, si elles sont démarrées près du bord, sont limitées à nager entièrement en ligne droite et leur amplitude de mouvement semble plus petite.
Les cellules du tractus ont été classées en trois catégories distinctes, non mobiles sans maintien visible, non mobiles avec maintien visible et mobiles. Le résultat a montré un histogramme empilé résumant le nombre relatif de cellules dans ces catégories en fonction de la nôtre en régénération. Plus tard, un nombre important de cellules ont été trouvées dans des colonies avec des jeûnes de maintien visibles suggérant fortement qu’elles avaient exploré l’environnement et s’étaient attachées de préférence près d’autres de leur espèce.
Il est important de sélectionner les dimensions du puits d’échantillonnage qui fonctionnent bien pour stentor coeruleus qui mesurent environ un millimètre. Cela comprend une épaisseur d’espacement en silicone de 5/16e de pouce de diamètre et 10 cellules par puits. Ces chiffres doivent être ajustés lors de l’adaptation de ce protocole à d’autres types de cellules.
Ce test peut être effectué en conjonction avec l’ARN-I pour étudier et comparer la régénération de différents phénotypes de stentor.
