Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de l’audition et de l’équilibre. Il décrit comment détecter deux aspects importants de la fonction des cellules capillaires sensorielles, la mécanotransduction et l’activité présynaptique. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle nous permet de visualiser la fonction des cellules cils chez un animal vivant, et d’étudier comment les collections de cellules cils détectent et transmettent des informations sensorielles.
Pour commencer cette procédure, utilisez des forceps fins et du fil de tungstène pour façonner les broches à utiliser pour immobiliser la larve à travers la tête et la queue, sur l’encapsulant durci. Pour faire des épingles à tête, maintenez un morceau de fil de tungstène de 0,035 millimètre dans une main. À l’aide de forceps fins dans l’autre main, plier le fil d’un millimètre vers le haut de l’extrémité, à 90 degrés.
Échangez les forceps contre des ciseaux fins, et coupez un millimètre après le virage, pour créer la goupille. Ensuite, utilisez des forceps pour insérer les broches dans l’encapsule durci sur la chambre. Placez la larve au centre de la chambre de perfusion de sorte qu’elle se trouve à plat sur le côté contre l’encapsulant en silicone.
À l’aide de forceps fins, apportez la goupille de tête de 0,035 millimètre vers le bas perpendiculairement à la larve. Insérez la goupille de tête entre l’oeil et la vésicule otic, et vers le bas dans l’encapsulant. Utilisez un deuxième ensemble de forceps pour stabiliser la larve le long de son côté dorsale et ventral, tout en épinglant.
Assurez-vous que la partie horizontale de la goupille entre en contact avec la larve et n’appuie pas tout le chemin dans l’encapsulant. Inclinez la goupille ventrally, ou pointant légèrement vers l’antérieur de la larve, pour éviter d’interférer avec l’injection cardiaque suivante et l’imagerie cellulaire de cheveux. À l’aide des forceps, insérez une goupille arrière de 0,025 millimètre dans le notochord, aussi près que possible de l’extrémité de la queue.
Pour injecter de l’alpha bungarotoxine dans la larve, remplissez trois microlitres de la solution dans l’aiguille d’injection, à l’aide d’une pointe de pipette à chargement de gel. Chargez la solution uniformément à la pointe, sans bulles. Insérez ensuite l’aiguille d’injection cardiaque dans un porte-pipette fixé à un micromanipulateur manuel.
Sous un microscope stéréo, placez l’aiguille de façon à ce qu’elle soit alignée perpendiculairement à l’axe AP de la larve anesthésiée, pointant vers le bas à un angle de 30 degrés. Ensuite, connectez le support pipette à l’injecteur de pression. Injectez un bolus d’alpha bungarotoxin dans la solution, pour tester si la pointe de l’aiguille est claire.
Si aucune couleur rouge n’est vue, grattez très doucement la pointe de l’aiguille contre le bord d’une goupille, et réessayer, jusqu’à ce que l’aiguille soit claire. Par la suite, avancez l’aiguille vers le cœur, jusqu’à ce qu’elle touche la peau à l’extérieur du cœur. Appuyez sur l’aiguille dans la larve, et chercher l’indentation de la cellule pigmentaire sur la peau en face du cœur pour s’assurer que l’aiguille est positionnée dans le plan correct, par rapport à la larve.
Ensuite, avancez l’aiguille plus loin, jusqu’à ce qu’elle perce la peau et pénètre dans la cavité cardiaque. Tirez légèrement l’aiguille vers l’arrière et injectez un bolus d’alpha bungarotoxine dans la cavité cardiaque. Recherchez l’inflation de la cavité cardiaque, ou pour le colorant rouge entrant dans la cavité.
Rincez doucement la larve trois fois, avec un millilitre de tampon neuronal pour enlever le MS222 résiduel. N’enlevez jamais tout le liquide. Maintenir la larve dans environ 1 millileter de tampon neuronal dans la chambre de perfusion.
Dans cette procédure remblayer 10 microlitres de tampon néonal dans une aiguille fluide-jet correctement cassée à l’aide d’une pointe de chargement de gel. Chargez la solution uniformément à la pointe sans bulles. Ensuite, insérez l’aiguille dans le porte-pipette fixé au micromanipulateur motorisé.
Placez la chambre de perfusion dans un adaptateur circulaire de chambre sur l’étape de microscope. Déplacez la scène motorisée de sorte que la larve soit au centre du champ de vision. Par la suite, tournez l’adaptateur circulaire de chambre de sorte que l’accès d’AP à la larve soit approximativement aligné avec la trajectoire de l’aiguille fluide-jet.
À l’aide de la lumière transmise et du contraste différentiel des interférences, mettre la larve au point et la centrer sous l’objectif 10x. Ensuite, augmenter l’objectif 10x. À l’aide du micromanipulateur motorisé, amener l’aiguille à jet fluide au centre du champ de vision, de sorte qu’elle est éclairée par la lumière transmise et touche à peine le tampon neuronal.
Abaissez l’objectif 10x de se concentrer sur la larve afin de confirmer son emplacement. Fuous l’objectif sur l’aiguille fluide-jet. Déplacez l’aiguille à jet fluide avec le micromanipulateur dans l’axe x et y jusqu’à ce qu’elle soit en position parallèle au côté dorsale de la larve.
Ensuite, concentrez-vous sur la larve. Amenez l’aiguille dans l’axe Z et placez l’aiguille le long du côté dorsale du poisson, à 1 millimètre du corps. Déplacez soigneusement l’adaptateur circulaire de chambre pour s’assurer que l’aiguille fluide de jet est alignée le long de la ligne médiane d’AP de la larve.
Ensuite, passez à l’objectif 60x eau. Assurez-vous que l’objectif est emersed dans le tampon neuronal. Utilisez la mise au point fine pour localiser un neuromast.
Déplacez ensuite l’étape motarisée pour placer le neuromast d’intérêt au centre du champ de vision. Gardez la pointe fluide de l’aiguille du jet le long du côté dorsal du poisson. Ne touchez pas la pointe de l’aiguille du jet fluide à la larve ou à la surface de la chambre.
Placez l’aiguille à jet fluide avec le micromanipulateur de sorte qu’elle soit à 100 micromètres du bord externe du neuromast. Ensuite, concentrez-vous jusqu’à l’extrémité des faisceaux de cheveux apical. Le fond de l’aiguille fluide-jet doit être au point dans cet avion.
Réglez la pince de pression à grande vitesse du manuel au mode externe pour recevoir l’entrée du logiciel d’imagerie. Zéro la pince de pression à grande vitesse en appuyant sur le bouton zéro, et utilisez le bouton de point de réglage pour régler la pression de repos légèrement positive. Confirmez la sortie de repos de la pince à pression à grande vitesse à l’aide d’un manomètre PSI fixé à la sortie de l’étage de tête.
Pour déterminer la pression nécessaire pour stimuler les faisceaux de cheveux, appliquez un stimulus d’essai avec une sortie de 0,125 et 0,25 volt pendant 200-500 millisecondes. Pour chaque stimulus d’essai, mesurer la distance de déflexion des extrémités des brosses à cheveux, la kinocilia. Choisissez une pression qui déplace les faisceaux sur une distance d’environ 5 micromètres.
Assurez-vous que les extrémités de la kinocilia restent au point tout le temps. Pour acquérir des images mono-plan, sélectionnez un stimulus à livrer lors de l’acquisition de 80 images, après le cadre 30, à 3 secondes. Pour mesurer les réponses mécanosensibles au calcium, concentrez-vous sur la base des faisceaux de cheveux apical et commencez l’acquisition d’images.
Pour mesurer les réponses présynaptiques en calcium, concentrez-vous à la base des cellules cils et commencez l’acquisition d’images. Les étapes pour visualiser les changements spatiotemporaux de l’intensité de GCaMP6S, dans un neuromast pendant la simulation, sont décrites ici. Le temps est représenté de gauche à droite selon l’horodatage.
La rangée supérieure montre cinq des quatorze bacs temporels d’une séquence d’image GCaMP6S F de 70 images. Dans la deuxième rangée, la ligne de base a été supprimée de chaque image binned GCaMP6S F pour créer des images delta F. Dans la troisième rangée, les images delta F ont été converties de l’échelle grise à la table de regard rouge chaud.
Dans la rangée inférieure, la troisième rangée a été superposée sur les images F dans la rangée supérieure. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que la larve est épinglée correctement et d’utiliser les contrôles appropriés, comme décrit dans le manuscrit pour exclure les artefacts de mouvement de vos données. Travailler avec de l’alpha bungarotoxine peut être dangereux.
Il est important de prendre des précautions, comme le port de gants pendant sa manipulation.
