Le projet décrit a été soutenue par la concession numéro R01HD050725 de l&#39;Institut national de la santé infantile et le développement humain de baliser le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national de la santé infantile et du développement humain ou de la National Institutes of Health. Nous remercions les membres du laboratoire Godenschwege ainsi que Barbara Schreader pour leur contribution au manuscrit et vidéo.

1. Dissection de la corde nerveuse ventrale Dissection et de teinture de remplissage de la GF peut être effectuée à température ambiante. Pour tous les dissections étapes froid (4 ° C) une solution saline devrait être utilisé pour ralentir le métabolisme cellulaire et de garder les neurones en vie plus longtemps. <ol><li> Anesthetize mouches adultes (4 jours ou plus) avec CO 2 ou les refroidir sur glace jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient immobilisés. Anesthésier avec de la glace, il faudra plus de temps (jusqu&#39;à 30 min), mais gardera les mouches immobilisé pendant plus longtemps. </li><li> Placez une mouche dans une boîte de Pétri Sylgard couché. Cette dissection nécessite l&#39;utilisation d&#39;un fort grossissement (80-100X) stéréomicroscope dissection. </li><li> Avec des ciseaux Vannas, retirez les jambes, trompe, et les ailes. </li><li> Utilisez une pince grossières et fines broches insectes (broches minutien) pour orienter le côté volée dorsale dans le plat Sylgard. Pin de l&#39;abdomen d&#39;abord et ensuite allongé l&#39;animal légèrement en plaçant deux broches de chaque côté du cou, derrière la tête, de sorte que le cou est légèrement étirée et accessibles (voir Figure 2). </li><li> Immerger la volée dans l&#39;eau douce, salée froide drosophile. Les plus couramment utilisés Salines drosophile sont suffisantes pour la dissection, mais ici nous avons utilisé une solution saline décrit dans Gu et O&#39;Dowd, 2006 4. Une bulle d&#39;air va entourer la volée. Retirer l&#39;air avec une seringue. </li><li> Faire une courte incision latérale dans l&#39;extrémité postérieure de l&#39;abdomen. À partir de l&#39;incision, faire un peu profonde, coupe droite le long de la ligne médiane dorsale de l&#39;abdomen vers le thorax. Puis poursuivre la faible profondeur, coupe longitudinale dans le thorax le plus précisément possible le long de la ligne médiane vers le conjonctif. Il est essentiel de faire des coupes peu profondes pour ne pas endommager la VNC (figure 1). </li><li> Utiliser deux broches insectes amende à ouvrir avec précaution le thorax. Fais le corps moitiés part en utilisant les broches et le lieu des broches à travers les muscles de vol (figure 2). Le thorax ne doit pas être ouvert d&#39;autres comme le montre le graphique 2 pour éviter de déchirer de la cuticule. Pour assurer une orientation droite de la VNC les broches doivent être placés dans la même position postérieure antérieure de chaque côté. </li><li> L&#39;accès à la VNC pour l&#39;injection de colorant et d&#39;imagerie appropriées peuvent être obstruées par des organes internes. Par conséquent, l&#39;utilisation de pinces et de ciseaux pour retirer l&#39;estomac, l&#39;intestin, le cœur et les organes reproducteurs. Tirez sur les glandes salivaires couché sur les deux côtés de la VNC. Rincer soigneusement la dissection avec une solution saline douce pour enlever les tissus flottants et les graisses. </li><li> Retirez la graisse du corps par le dessous du col de l&#39;utérus conjonctifs (CVC). La graisse du corps est mieux visible à fort grossissement. Utilisez une pince fine à saisir attentivement le tissu sur le côté et tirez. </li></ol> La dissection peut être effectuée dans les 5 à 10 minutes. En utilisant fraîche, salée froide de la disséquer, système nerveux endommagé restera vivant pendant au moins une heure. 2. Intracellulaire GF remplissez Il est recommandé d&#39;effectuer le colorant remplir dès que possible après la dissection. <ol><li> Placer le plat Sylgard à la mouche disséquée sous un microscope droit à une scène fixe (figure 3) et un objectif 10x de l&#39;air. Centre de l&#39;échantillon avec l&#39;extrémité postérieure de la mouche positionné vers le support d&#39;électrode de remplir colorant. Utilisez l&#39;interférence contraste différentiel (DIC) de mode et se concentrer sur le CVC. Les axones des grands de la SFP devraient être clairement visibles sur la surface dorsale de la CVC. </li><li> Diluer Lucifer Yellow CH dilithium sel dans H2O déionisée à une concentration de 1%. Tirez une électrode en verre borosilicate avec filament à une résistance d&#39;env. 60-80 MQ. La pointe de l&#39;électrode de verre doit être long et pointu. Remplissez la pointe de l&#39;électrode avec une solution de jaune Lucifer% en plaçant l&#39;électrode avec l&#39;extrémité opposée de la pointe de l&#39;électrode dans la solution de Lucifer Yellow pour env. 30-60 secondes. Puis remblai de l&#39;électrode avec 3M LiCl utilisant une seringue Hamilton laissant une bulle d&#39;air entre le colorant et LiCl. Connecter l&#39;électrode de teinture de remplir le stade la tête. </li><li> Insérer un chlorure d&#39;argent au sol électrode enrobée fil dans la saline et placer l&#39;électrode de teinture de remplir au-dessus des parallèles voler à la VNC en utilisant un micromanipulateur 3D hydraulique. L&#39;électrode de teinture de remplissage doit être connecté à un amplificateur qui permet de passer en cours afin de libérer positivement ou négativement chargés colorants de l&#39;électrode en passant hyper-ou courant dépolarisant, respectivement. </li><li> Basculer vers un objectif à immersion d&#39;eau 40x et inférieure de la pointe de l&#39;électrode de teinture de remplir sur l&#39;une des GFS. Les axones GF se trouvait près de la surface dorsale de la CVC. Utilisez un en avant (vers la tête) le mouvement d&#39;insérer l&#39;électrode dans la GF. </li><li> Changez votre source de lumière à la lumière épifluorescence et passer à un filtre jaune Lucifer. Appliquer un courant hyperpolarisante à l&#39;électrode de teinture de remplir avec l&#39;amplificateur à injecter le jaune Lucifer dans la GF. La quantité de colorant injecté peut être commandé par ee montant du courant transmis ainsi que la durée du courant est passé. Pour empêcher la teinture de se répandre hors du site d&#39;injection ou d&#39;endommager le GF, il est recommandé d&#39;injecter à l&#39;aide d&#39;un courant faible (environ 3-5 nA) sur 1-5 minutes. </li><li> Appliquer en cours jusqu&#39;à la terminale GF dans le VNC peut être vu clairement (figure 4A). Pour trans-synaptique des neurones postsynaptiques coloration, continuer à passer le courant jusqu&#39;à ce colorant peut aussi être vu dans les neurones post-synaptiques. Couper le courant et retirez l&#39;électrode de teinture de remplissage. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Un colorant représentant remplir pour un GF avec Lucifer jaune est montré dans la figure 4A. L&#39;image a été acquise dans une pile d&#39;images dans Nikon éléments logiciels en utilisant une caméra spot monté sur le microscope. Dans ce courant de l&#39;échantillon a été adoptée par l&#39;électrode pendant environ 2 minutes. Le GF est bien rempli et le terminal GF grande dans le thorax est bien étiqueté (figure 4A, ellipse). Pas de neurones postsynaptiques sont visibles dans ce cas, bien que Lucifer Yellow est assez petit pour passer à travers les jonctions communicantes. Si le colorant n&#39;est pas injecté suffisamment longtemps dans le GF, puis trans-synaptiques remplit des neurones postsynaptiques peuvent pas été vu parce que le signal est trop faible pour être détecté. Les neurones postsynaptiques de la SFP (figure 4B, pointes de flèches) peuvent être visualisées en utilisant de façon plus fiable, même petits traceurs neuronaux, tels que Neurobiotin. L&#39;injection d&#39;un Neurobiotin 7% en solution 2 M d&#39;acétate de potassium avec un courant de dépolarisation pendant 2 minutes est suffisante pour étiqueter les neurones postsynaptiques fortement. Neurobiotin peuvent être visualisées pour la microscopie confocale à l&#39;aide de streptavidine couplée à des colorants de longueurs d&#39;onde différentes. Parce Neurobiotin n&#39;est pas un colorant fluorescent, co-injection de Rhodamine-dextran ou hydrazides Alexa dans la même solution, peut être utilisé pour surveiller une injection réussie dans la GF (figure 4C, à partir de Boerner et Godenschwege, 2010 5). <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma de principe d&#39;une mouche vu latéralement. Le thorax est affiché avec une incision longitudinale de visualiser les structures internes. Lors de la dissection, les muscles dorsaux vol longitudinal (DLMS, bleu) ont été coupés, sans endommager la corde nerveuse ventrale (VNC, un rouge profond), qui se trouve dans les muscles ventraux vol. L&#39;intestin (vert) se trouve au-dessus du VNC. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Vue dorsale d&#39;une mouche disséquée. Deux broches sont placées derrière la tête à la position de l&#39;avion. Les broches fixée à travers les muscles de vol (DLM) détiennent le thorax ouvert. Les organes internes ont été enlevés afin d&#39;exposer la corde nerveuse ventrale (VNC). <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Dye configuration de remplissage. <img src="/files/ftp_upload/3080/3080fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. A) Z-projection de la partie postérieure de la VNC montrant un GF remplis avec Lucifer Yellow. L&#39;image a été acquise immédiatement après le remplissage de teinture avec un appareil photo spot. En animaux de type sauvage du terminal (ellipse) dans le thorax est clairement visible. B) l&#39;image confocale d&#39;un colorant GF remplir de Neurobiotin dans un avion de type sauvage. Les deux GFS (flèches) et les neurones postsynaptiques de la SFP (pointes de flèches) sont étiquetés. Neurobiotin été visualisées avec streptavidine couplée à Cy3. C) l&#39;image confocale de type sauvage rempli de GFS Alexa555.

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	<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Boerner, J., Duch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+shape+standard+atlas+for+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord.">Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+synaptic+transmission+in+adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+sity.">Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity.</a> J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).</li><li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+for+the+Drosophila+ventral+nerve+cord+standard+in+neuronal+circuit+reconstruction+and+in-depth+analysis+of+mutant+morphology.">Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology.</a> J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).</li><li>Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conderved+role+for+Drosophila+Neuroglian+and+human+L1-CAM+in+central-synapse+formation.">A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation.</a> Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).</li><li>Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+distinct+from+highwire+for+the+Drosophila+ubiquitin+conjugase+bendless+in+synaptic+growth+and+maturation.">A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation.</a> J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).</li><li>Storkebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+mutations+in+the+tyrosyl-tRNA+synthetase+gene+recapitulate+in+Drosophila+features+of+human+Charcot-Marie-Tooth+neuropathy.">Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+(GFS).">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS).</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li></ol>

Le système nerveux peut être disséqués sans l&#39;extraire du corps de la mouche. Cela a deux avantages, d&#39;abord, la dissection cause peu de dommages au système nerveux et, deuxièmement, la plupart des nerfs restent attachés à des muscles et des organes sensoriels. Exécution de la dissection, comme décrit, prépare l&#39;échantillon pour simple colorant d&#39;étiquetage de la SFP. Idéalement, les motoneurones postsynaptiques au GFS rester attaché aux muscles. Les axones, par conséquent, ne sont pas en...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Sylgard 184 Kit élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Ciseaux Superfine </td><td> Instruments académique </td><td> VS1023 </td><td></td></tr><tr><td> Pince Dumont Dumontstar 55 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Broches insectes Austerlitz </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Ø 0,1 mm </td></tr><tr><td> Les électrodes de verre borosilicate </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Verticale pipette Extracteur 700c </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modèle 700C </td><td></td></tr><tr><td> Lucifer Yellow CH dilithium sel </td><td> Sigma </td><td> L0259 </td><td> 1% dans H 2 O </td></tr><tr><td> Microscope scène fixe vertical et appareil photo </td><td> Nikon </td><td> FN-1 et DS-U2 Caméra </td><td></td></tr><tr><td> Objectif du Plan Fluor Air 10X </td><td> Nikon </td><td> FCI plan Fluor 10X NA 0,3 16mm DEO </td><td></td></tr><tr><td> Fluor 40X eau plongeant Objectif </td><td> Nikon </td><td> FCI Fluor 40X W NA 0,80 DEO 2.0mm </td><td></td></tr><tr><td> 3D Micromanipulateur hydrauliques </td><td> Narishige international </td><td> Modèle MW0-3 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur </td><td> Obtenir Instruments, Inc </td><td> Modèle 5A </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount preparation of the adult drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection

Pour analyser la morphologie axonale et dendritique des neurones, il est essentiel d&#39;obtenir un étiquetage précis des structures neuronales. Préparation des échantillons bien étiquetés avec peu ou pas endommager les tissus nous permet d&#39;analyser la morphologie des cellules et de comparer des échantillons individuels les uns aux autres, permettant ainsi l&#39;identification des anomalies mutant. Dans la méthode de dissection démontré le système nerveux reste le plus souvent à l&#39;intérieur de la mouche adulte. Grâce à une incision dorsale, l&#39;abdomen et le thorax sont ouverts et la plupart des organes internes sont enlevés. Seule la face dorsale de la moelle nerveuse ventrale (VNC) et le connectif cervical (CVC) qui contient les axones des fibres grands géants (GFS) 1 sont exposées, tandis que le cerveau contenant le corps cellulaire et des dendrites GF reste deux dans la tête intacte . Dans cette préparation la plupart des nerfs de la VNC doit rester attachés à leurs muscles. Après la dissection, le remplissage intracellulaire de la fibre géante (GF) avec un colorant fluorescent est démontrée. Dans le CVC les axones GF sont situés à la surface dorsale et peut donc être facilement visualisés au microscope à contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) optique. Cela permet l&#39;injection du colorant axones GF avec ce site à l&#39;étiquette du GF entier, y compris les axones et leurs terminaux dans le VNC. Cette méthode aboutit à coloration solide et fiable de l&#39;ETG permettant aux neurones à imager immédiatement après le remplissage avec un microscope à épifluorescence. Alternativement, le signal fluorescent peut être améliorée en utilisant des procédures standard de 3 immunohistochimie adapté à la microscopie confocale à haute résolution.

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Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Une<em&gt; In vivo</emDissection&gt; de l&#39;adulte<em&gt; Drosophile</emCordon&gt; nerveuse ventrale (VNC) est démontrée. Cette méthode de dissection particulier provoque peu de dégâts à l&#39;VNC permettant l&#39;étiquetage ultérieur de la fibre de neurones géants avec un colorant fluorescent pour l&#39;imagerie haute résolution.

Préparation Mont entiers de l&#39;Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

18.9K vues.  Florida Atlantic University. Une In vivo de l'adulte Drosophile nerveuse ventrale (VNC) est démontrée. Cette méthode de dissection particulier provoque peu de dégâts à l'VNC permettant l'étiquetage ultérieur de la fibre de neurones géants avec un colorant fluorescent pour l'imagerie haute résolution.

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Recherche

Neurosciences

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres Géant de D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection paires et test d&#39;électrophysiologie à l&#39;écran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-étiquetage des neurones DRG pour l&#39;étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Un<em&gt; In Vitro</emMuscle-nerf&gt; Adult Souris Préparation pour étudier les propriétés de cuisson des afférences musculaires

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...