Nous remercions un fonds interne de l&#39;Université de l&#39;Oklahoma (BZ) et une subvention de la NSF (IOS-1025556, BZ et RAB) pour soutenir la Fondation, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, et cette recherche. Une subvention du NIH (RO1 NS060878, BZ) partiellement pris en charge RAB. RAB reconnaît une NRSA NIH (T32 NS07292) de formation subvention accordée à l&#39;Université Brandeis, et une subvention du NIH (RO1 GM21473) a décerné à Jeffrey Hall à Brandeis, pour soutenir les premières étapes de cette étude. Nous remercions Jeffrey Hall pour ses encouragements continus pour ce projet. Nous remercions le Dr Kristin Scott pour nous avoir fourni avec la baignoire P&gt; GAL80 contrainte&gt;.

1. Souches de drosophile <ol><li> Gal4 conducteur: GMR-Gal4, qui exprime Gal4 de cellules photoréceptrices. </li><li> Lignes SAMU SAMU-MJD78Q (ou UAS-polyQ), ce qui provoque la dégénérescence neuronale dans les cellules exprimant Gal4. UAS-GFP, qui exprime la GFP dans les cellules exprimant Gal4. </li><li> Lignes FLP ey-FLP, qui exprime FLP dans les photorécepteurs et en sous-ensembles de régions cérébrales. HE-FLPx2 lignes, qui sont enhancer-trap lignes contenant deux copies du FLP (FLP-IRES-FLP). Nous avons généré ~ 1000 HE-FLP lignes (Bohm et al., 2010), dont l&#39;expression schémas ne sont pas encore caractérisés. Ici, nous décrivons la caractérisation du profil d&#39;expression de sélectionner HE-FLPx2 chez la mouche système central larvaire et adulte nerveux central (SNC). </li><li> Reporter FLP yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), qui relève du modèle d&#39;expression de l&#39;ET-FLPx2 travers actine P&gt; Gal4; UAS-GFP sur FLP-médiée excision par recombinaison des&gt; CD2. </li><li> Deux complémentaires GAL80-conversion des outils Baignoire P&gt; GAL80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), la construction flip-out, qui exprime de manière constitutive GAL80 dans tous les tissus piloté par un promoteur de la tubuline forte. Sur FLP médiée recombinaison&gt; GAL80 est retournée sortir et GAL80 expression est terminée seulement en ET-FLPx2 exprimant tissus. Baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 (Bohm et al., 2010), le flip-de construire, qui n&#39;exprime pas GAL80 dans des conditions normales. GAL80 expression est allumé par le promoteur de la tubuline seulement dans l&#39;ET-FLPx2 exprimant des tissus dans lesquels FLP éjecté arrêter&gt; et des culbutes dans GAL80. </li><li> Mouches pour tester l&#39;activité FLP dans les yeux composés GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 (Bohm et al, 2010.), Qui a dégénéré et les yeux dépigmentées. En exprimant FLP cellules photoréceptrices, l&#39;expression polyQ est éteint suivantes GAL80 flip-in. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) baignoire P&gt; GAL80&gt;, qui a les yeux normaux. En exprimant FLP cellules photoréceptrices, l&#39;expression polyQ est allumé suivantes GAL80 flip-out. </li></ol> 2. Réactifs Tampon phosphate salin (PBS, 1X), pH 7,4. 4% de paraformaldéhyde (PFA), dilué dans du PBS de 16% PFA, EM grade (Cat # 15710, sciences de la microscopie électronique, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS contenant 0,1% de Triton X-100 (Sigma) Anti-Elav (MAB, 9F8A9; études développementales hybridomes Banque, Université de l&#39;Iowa), les taches de tous les neurones de la drosophile. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies hybridomes Banque, Université de l&#39;Iowa) taches cellules gliales chez la drosophile. Alexa 594 poulets contre les anticorps de souris secondaire (Invitrogen) 3. Cartographie du modèle d&#39;expression des lignes FLPx2 enhancer-trap (* étapes critiques) <ol><li> Recueillir les femelles vierges de la yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP en ligne et croix pour les hommes de chaque HE-FLPx2 lignes. Le premier sert un journaliste GFP pour l&#39;expression tissulaire de l&#39;ET-FLP. </li><li> * Disséquer errance 3 ème stade F1 larves, conservent le SNC (par exemple, le cerveau et la moelle nerveuse ventrale, VNC) et la paroi du corps, fixer pendant 1 heure à 4% PFA sur la glace, laver 3x avec PBS glacé suivie par lave 3X avec PBT. Dissection <ol><li> Retirer errance 3 ème stade F1 larves et les placer dans un plat propre Sylgard (35 mm x 10 mm boîte de Petri remplie de 2 grammes de Sylgard - mélangés selon les instructions de fabrication). <ol><li> Enlevez les débris alimentaires avec le pinceau </li></ol></li><li> Remplir le plat avec glacée 1XPBS et le placer sur la glace pour anesthésier les larves </li><li> Tenir les crochets d&#39;une larve de la bouche avec une paire de pinces et de saisir la cuticule à proximité de la spiracle étendre antérieure avec une autre paire de pinces et le zeste de la cuticule vers l&#39;extrémité postérieure. Le CNS sera joint à la bouche des crochets avec les glandes salivaires, l&#39;intestin, et les disques imaginaux. </li><li> Retirer l&#39;excès de tissus et de disques imaginaux entourant le SNC. </li><li> Transférer la SNC en PBS-remplie 3 bien plat en pyrex. <ol><li> Un siliconé P200 pointe de la pipette peut être utilisé pour éviter le dessèchement des tissus. </li></ol></li><li> Fix pendant 1 heure dans 200 ul de 4% PFA sur la glace. <ol><li> Assurez-vous que le SNC est complètement immergé dans la PFA. <ol><li> Si le SNC flotteurs, ce qui suggère généralement que le SNC n&#39;est pas correctement nettoyée par les tissus environnants. </li></ol></li></ol></li><li> Laver 3x avec PBS glacé suivie de lavages 3X avec PBT. </li></ol></li><li> * Disséquer le SNC de mouches F1 adulte. <ol><li> Anesthésier les mouches avec du CO 2 ou le lieu des mouches contenue dans un flacon vide sur la glace pendant 10 minutes. </li><li> Placez adulte vole dans un plat en verre rempli de EtOH à 95% sur la glace pendant 30 sec. </li><li> Transférer les mouches adultes dans un plat en verre remplis 1XPBS sur la glace. <ol><li> Lavez 3X avec glacée 1X PBS pour éliminer EtOH résiduelles </li></ol></li><li> Placez une mouche dans une Sylga 35mmvaisselle ème rempli glacée PBS 1X </li><li> Placez la face ventrale vers le haut et insérez un stylo petit insecte (broches minutiens 0,1 mm) à mi-chemin à travers l&#39;abdomen. <ol><li> En utilisant une paire de pinces tenir la base des jambes et retirer les jambes avec une autre paire de pinces. </li></ol></li><li> Enlever la cuticule tête <ol><li> Tout en saisissant la trompe avec une paire de pinces, placer un autre sous l&#39;oeil et le zeste de la cuticule vers la ligne médiane dorsale de la tête de la mouche. </li><li> Prenez l&#39;autre œil et retirer la cuticule qui restent de l&#39;autre côté. </li><li> En utilisant une pince forte et / ou d&#39;une aiguille de tungstène aiguisé, enlever le tissu entourant le cerveau trachéale <ol><li> Un mauvais nettoyage de la trachée se traduira par une forte auto-fluorescence, obstruant expression de la GFP, et permettre au cerveau de flotter lors de la fixation </li></ol></li></ol></li><li> Dissection VNC <ol><li> Enlever la cuticule thoraciques <ol><li> À partir de l&#39;extrémité postérieure du thorax, placer deux pinces de chaque côté de l&#39;preepisternum 3 e (ie, en saisissant la base des pattes postérieures). </li><li> Séparez doucement les cuticules loin de la ligne médiane ventrale, répétez cela jusqu&#39;à ce que vous atteigniez la base du cou. </li><li> Écartez doucement les deux moitiés de la cuticule thoraciques exposer la VNC </li></ol></li><li> Retirer ensuite l&#39;abdomen du thorax. Tout en utilisant une paire de pinces pour tenir le thorax à la base la deuxième étape, utiliser une autre paire de pinces pour attraper l&#39;abdomen près du premier sternite abdominal et tirez hors de l&#39;abdomen. </li><li> Pour enlever la VNC du tissu environnant thoracique. Tenez la région humérale avec une paire de forceps et avec une autre paire de pinces à la déchirure douce loin la majorité de la carcasse thoracique. </li><li> A ce stade il doit y avoir un anneau de tissu conjonctif entourant le connectif cervical (cou). En utilisant deux pinces lacrymogènes en dehors de l&#39;anneau. </li><li> Retirez tout excès de tissu entourant le thorax VNC </li></ol></li><li> Transfert du cerveau et VNC pour 9-même en pyrex plat contenant du PBS 1X sur la glace <ol><li> Un siliconé P200 pointe de la pipette peut être utilisé pour éviter le dessèchement des tissus </li></ol></li></ol></li><li> * Correction du SNC adulte pendant 1 heure à 4% PFA sur la glace et lave-glace 3X avec du PBS froid et 3X avec PBT. </li><li> Incuber la préparation pour adultes du SNC ou la CNS larvaire et paroi du corps à 4 ° C pendant la nuit avec des anticorps soit neurones (anti-Elav, 01h10) ou des cellules gliales (anti-Repo. 1:10). Laver la préparation 5X avec PBT. </li><li> Incuber à la préparation des adultes ou larves avec Alexa 594 poulets contre la souris anticorps secondaire (1:100) à température ambiante pendant 2 heures, et laver la préparation avec du PBS. </li><li> Montez le SNC larvaire ou adulte sur une diapositive. Afin de préserver la forme naturelle de la SNC, utiliser un anneau en plastique en forme de O (Label Renforcement Clair, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) sur la lame comme un pont mini-pour suspendre la lamelle. </li><li> Examinez la préparation de modèles d&#39;expression de GFP et Elav (ou Repo) sous un microscope à fluorescence. </li></ol> 4. L&#39;application de deux complémentaires GAL80-convertissant les outils de la répression dans les photorécepteurs Gal4 <ol><li> Retournement GAL80 par l&#39;intermédiaire baignoire P&gt; GAL80&gt; (figure 5A). <ol><li> Recueillir les mâles de la GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; GAL80 ligne&gt;. Notez que les yeux composés sont normales dans ces mouches. </li><li> S&#39;accoupler avec ey-FLP vierges. </li><li> Recueillir les mouches F1 et d&#39;examiner le phénotype des yeux. </li></ol></li><li> Retournement GAL80 en via baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 (figure 5B). <ol><li> Recueillir GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mouches mâles et examiner le phénotype des yeux. Remarque dégénérés et les yeux dépigmentées dans ces mouches par rapport aux souches de type sauvage (Canton-S) </li><li> S&#39;accoupler avec ey-FLP vierges; </li><li> Recueillir les mouches F1 et d&#39;examiner le phénotype des yeux. </li></ol></li><li> Sélectionnez HE-FLPx2 lignes avec une expression dans les cellules photoréceptrices </li></ol> Étapes 4.1 et 4.2 peuvent être répétées en utilisant ET-FLPx2 lignes qui expriment FLP dans un sous de cellules photoréceptrices. Alternativement, soit le GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mouches ou GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; GAL80&gt; mouches peuvent être croisées pour chaque HE-FLPx2 lignes à l&#39;écran des lignes qui expriment FLP dans les cellules photoréceptrices. Valuable HE-FLPx2 lignes sont celles qui ne FLP exprimer dans un sous-ensemble ou cellules photoréceptrices unique (figure 6). 5. Les résultats représentatifs Le profil d&#39;expression d&#39;un particulier HE-FLPx2 ligne peut être facilement examiné et documenté dans les larves F1 ou mouches adultes issus du croisement entre yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP vierges et HE-FLPx2 hommes (figure 1) . Typiquement, trois à cinq répétitions des animaux F1 sont disséqués et examinés pour déterminer la reproductibilité du modèle de l&#39;expression du FLP (Bohm et al., 2010). <strong&gt; Figure 2 montre le profil d&#39;expression de FLP ET-173A FLPx2 ligne dans le SNC larvaire et adulte. Le modèle FLP peut encore être analysées à l&#39;aide d&#39;un marqueur neuronal ou gliales (Figure 3 &amp; 4). Les résultats présentés dans la figure 7 illustrent l&#39;efficacité de GAL80 flip-dans et flip-out des systèmes dans la répression intersectionnelle de Gal4 suivantes FLP médiée recombinaison. La baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 de construire ne semble pas avoir toute expression qui fuient des GAL80 (basé sur la dégénérescence uniforme et dépigmentation des photorécepteurs), et pourtant il est efficace à 100% dans le retournement GAL80 avec l&#39;aide de eyFLP pour réprimer GMR- Gal4 et restaurer l&#39;œil aux apparences normales (figure 7A). Au contraire, baignoire P&gt; GAL80&gt; entièrement réprime GMR-Gal4 avant l&#39;introduction de eyFLP. Après GAL80 flip-out, GMR-Gal4 disques SAMU-polyQ d&#39;expression, conduisant à dégénérer et les yeux dépigmentée (Fig. 7B). Dans cet exemple, nous avons utilisé une FLP pan-photorecetor au Plan «circuits» le photorécepteur, mais n&#39;a pas examiné les conséquences comportementales. En utilisant des approches similaires avec behaviorally pertinentes Gal4 lignes, nous avons cartographié une partie du CCAP-Gal4 circuit de régulation d&#39;expansion dans l&#39;aile des mouches adultes (Bohm et al., 2010). Nous croyons que la méthode FINGR seront précieuses pour aider notre compréhension de la base neuronales du comportement. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. . Examiner le schéma d&#39;expression d&#39;une HE-FLPx2 ligne Le profil d&#39;expression FLP (ovales bleu) à partir d&#39;une ligne de HE-FLPx2 peut être déterminé en traversant une HE-FLPx2 mâle (en haut à gauche) avec une actine P&gt; CD2&gt; Gal4; SAMU- GFP vierge (en haut à droite). Ubiquitous actine P&gt; Gal4 expression dans la femelle parentale est entravée par l&#39;insertion de la FRT (triangles gris) séquence CD2 flanqué. Dans la descendance F1, FLP accise de la séquence du CD2, permettant d&#39;actine P&gt; Gal4 de conduire UAS-GFP expression. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Modèle de l&#39;expression d&#39;une ligne de HE-FLPx2 dans le système larvaire et adulte nerveux central. Ces images montrent le SNC (moelle nerveuses du cerveau et ventrale, VNC) disséqué de la progéniture produite à partir de l&#39;accouplement yw, actine P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP aux parents de l&#39;ET-173A FLPx2 ligne. En recombinant les&gt; CD2&gt; cassette, FLP active actine P&gt; GAL4 expression (l&#39;expression conséquente de UAS-GFP). Ainsi, le modèle GFP rapports FLP cellules exprimant. Le panneau A montre le schéma d&#39;expression alors que les larves de FLP panneau B montre le profil d&#39;expression des adultes en 173A ligne. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Caractérisation des types de cellules qui expriment flippase dans ET-FLPx2 Line # 688A. Un, Une image composite d&#39;une larve fixée F1 3 ème stade teinté d&#39;anti-REPO d&#39;un croisement entre ET-FLPx2 ligne # 688A et une ligne GFP rapports flippase. BD, un fort grossissement (Zeiss Plan-Apochromat 63x huile) vue prise de l&#39;extrémité postérieure d&#39;un VNC à partir d&#39;un 3 ème stade des larves. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Caractérisation des types de cellules dans le corps de champignons de l&#39;ET-FLPx2 Ligne n ° 150. AC, Une image à fort grossissement (63x immersion dans l&#39;huile) du corps de champignons à partir d&#39;une larve fixée F1 au 3ème stade teinté d&#39;anti-REPO. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. Illustration de GAL80 Stratégies de prise de contrôle et Flip-out. A. Dans la stratégie de flip-out, la tubuline promoteur axée GAL80 (baignoire P&gt; GAL80&gt;) est constitutivement actif, résultant dans la répression de la GMR-Gal4 et un phénotype oculaire de type sauvage (yeux rouges). Cette répression est éliminé par l&#39;introduction de FLP (violet), qui sera retourner GAL80 sortir (au milieu, rouge) et permettre GMR-Gal4 de conduire SAMU-polyQ expression. Il en résulte une dégénérescence des cellules photoréceptrices (illustré par des points blancs dans l&#39;œil). B. Dans la réciproque de la stratégie précédente, la tubuline promoteur axée GAL80 expression est interrompu par FRT (triangles gris) flanqué &quot;stop&quot; codon. En l&#39;absence de GAL80, GMR-Gal4 se lie à la SAMU-polyQ provoquant une dégénérescence neuronale dans les photorécepteurs (illustré par des points blancs dans l&#39;œil). En franchissant les GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mâles avec des femelles vierges qui expriment FLP dans les cellules photoréceptrices, FLP (violet) va catalyser la recombinaison à des sites FRT, excisant le &quot;stop&quot; codon (milieu, rouge), permettant ainsi GAL80 expression et répression de la GMR-Gal4. Cette réserve la neurodégénérescence dans les cellules photoréceptrices (illustrée par le manque de white points dans l&#39;œil). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. L&#39;application de la méthode de retournement FINGR GAL80 à l&#39;aide de l&#39;ET-FLPx2 Line # 688A descendance F1 d&#39;un croisement entre ET-FLPx2 ligne # 688A vierge pour GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 masculins. L&#39;absence de pigment dans le milieu de l&#39;oeil représente l&#39;expression ommatidies FLP en ligne # 688A. Dans ce domaine GAL80 suppression de GMR-Gal4 été soulagé permettant Gal4 de conduire SAMU-polyQ. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Figure 7"/> Figure 7. L&#39;application de la méthode de retournement FINGR GAL80 dans ou hors de croiser Gal4 dans les photorécepteurs. A. La baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 flip-dans le système restreint GAL4 expression dans une manière FLP-dépendante. En GMR-Gal4, UAS-polyQ; baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 mouches, les cellules photoréceptrices sont dégénérées et dépigmentées (mouche à gauche). Après l&#39;introduction de eyFLP, GAL80 est exprimée dans les cellules photoréceptrices, résultant en une répression complète de la GMR-Gal4, qui à son tour éteint la polyQ expression et produit des mouches aux yeux normaux (mouche de droite). B. La baignoire P&gt; GAL80&gt; Flip -out système fonctionne de la manière opposée comme la baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 flip-dans le système. Baignoire P&gt; GAL80&gt; constitutivement réprime GAL4 et supprime l&#39;expression de polyQ (à gauche volée, avec des yeux normaux). Après l&#39;introduction de eyFLP, GAL80 est retournée à partir de cellules photoréceptrices, soulageant la suppression de la GMR-Gal4 et en tournant sur la polyQ expression. Cela conduit à mouches avec dégénèrent et les yeux dépigmentées (mouche de droite).

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	<li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila.">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila.">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li><li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4.">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li></ol>

Le système Gal4/UAS a été largement et utilisé avec succès par Drosophilists pour diverses études biologiques (Marque &amp; Perrimon, 1993; Duffy, 2002). À ce jour, la communauté mouche a généré des milliers de promoteur à moteur et enhancer-trap Gal4 lignes. Une des grandes forces de la méthode FINGR est qu&#39;il est compatible avec le système Gal4/UAS, ce qui permet d&#39;élargir considérablement la puissance de Gal4 dans des études chez la drosophile. Une application importante de la méthode FINGR est de circuits neuronaux sous-jacents d&#39;affiner le comportement travers Gal4/Gal80 intersection. Ces comportements peuvent inclure, mais ne sont pas limités à, l&#39;apprentissage et la mémoire, la parade nuptiale, le sommeil et le rythme circadien. La méthode FINGR peut également être utilisé pour cartographier les neurones essentiels qui sont sujettes à la neurodégénérescence dans la modélisation des maladies neurodégénératives humaines comme la maladie d&#39;Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les maladies de Parkinson. De même, des foyers de neurones ou circuits neuronaux cruciale pour la cocaïne médiation, l&#39;alcool et la toxicomanie d&#39;autres pourraient être cartographiés à l&#39;aide de la méthode FINGR. Il convient de noter que Gal4s conditionnelle (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) pourrait être utilisé avec la méthode FINGR afin d&#39;obtenir le contrôle temporel des circuits neuronaux et les comportements. Modification de la GAL80-conversion d&#39;outils en utilisant un GAL80 sensibles à la température (TS GAL80, McGuire et al., 2003) peut produire baignoire P&gt; arrêter&gt; GAL80 ts ou baignoire P&gt; GAL80 ts&gt;, ajoutant flexibilités supplémentaires temporelle dans la manipulation du circuit. Au-delà du système nerveux, la méthode FINGR est également applicable à restreindre Gal4 expression dans des sous-ensembles de cellules si c&#39;est l&#39;aile ou la jambe. Les lignes HE-FLPx2 sera une ressource précieuse pour tous les biologistes s&#39;intéressent à la drosophile FRT / FLP-analyse clonale (Xu &amp; Rubin, 1993), y compris MARCM (Lee &amp; Luo, 1999). Il est également prévu que certaines HE-FLPx2 lignes peuvent remplacer heatshock-FLP pour produire des clones reproductibles et répétés des analyses morphologiques et comportementales. Comme enhancer-trap Gal4 lignes, la plupart des HE-FLPx2 lignes sont peu susceptibles d&#39;être exprimé spécifiquement dans les cellules de son intérêt. La plupart des lignes vont exprimer FLP dans les cellules d&#39;intérêt et dans d&#39;autres cellules ou de tissus ainsi. Cependant, le manque de &quot;spécificité tissulaire» des deux Gal4 et ET-FLPx2 ne sera pas une préoccupation majeure pour la méthode FINGR aussi longtemps que leur zone de chevauchement est souhaitable pour une expérience particulière. FINGR est conçue pour transformer deux «grands» systèmes en un raffiné. Les méthodes illustrées dans ces protocoles sont plutôt standard et doit être reproductible. Les principales étapes mises en garde qui requièrent son attention sont la sélection et l&#39;utilisation du fixateur. Fixateurs autres que l&#39;IFP doit être évitée car ils vont étancher signal de la GFP. Nous avons également noté que le plat de dissection ne doit pas être utilisé pour la fixation au PFA afin d&#39;éviter la possibilité que l&#39;expression FLP ne sera pas fiable rapportés par la GFP.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

La méthode binaire Gal4 / UAS est puissant pour le gène et la manipulation de circuits neuronaux chez la drosophile. Pour la plupart des études neurobiologiques, cependant, l&#39;expression de Gal4 est rarement tissu-spécifique suffisante pour permettre la corrélation précise du circuit avec affichage de comportement. Pour surmonter cet obstacle majeur, nous avons récemment développé la méthode FINGR pour parvenir à une plus restrictive Gal4 expression dans le tissu d&#39;intérêt. La méthode FINGR a trois composantes: 1) le système traditionnel Gal4/UAS; 2) un ensemble de FLP / FRT médiée GAL80 outils de conversion, et 3) enhancer-trap FLP (HE-FLP). Gal4 est utilisé pour définir les circuits primaires de neurones d&#39;intérêt. Parure du Gal4 avec un SAMU-effectrices, telles que SAMU-MJD78Q ou SAMU-Shi ts, régule l&#39;activité neuronale, qui est à son tour, se manifeste par des modifications dans le comportement voler. Avec un supplément de SAMU-rapporteur comme UAS-GFP, le circuit neuronal impliqué dans le comportement spécifique peut être simultanément mappé pour l&#39;analyse morphologique. Pour Gal4 lignes avec une expression large, Gal4 expression peut être restreinte en utilisant deux complémentaires GAL80-conversion outils: baignoire P&gt; GAL80&gt; (&#39;flip out ») et le bain à P&gt; arrêter&gt; GAL80 (« flip »). Enfin, les enquêteurs peuvent se tourner GAL80 allumé ou éteint, respectivement, avec l&#39;aide de tissu-spécifique HE-FLP. Dans le flip-en mode, GAL80 va réprimer l&#39;expression de Gal4 où Gal4 et HE-FLP se croisent. Dans le mode flip-out, GAL80 soulagera Gal4 la répression dans les cellules qui se chevauchent Gal4 et FLP. Les deux approches permettent la restriction du nombre de cellules dans le circuit de Gal4-défini, mais dans une tendance inverse. La méthode FINGR est compatible avec la vaste collection de Gal4 lignes dans la communauté voler et extrêmement polyvalent pour l&#39;analyse clonale traditionnelle et pour la cartographie du circuit neuronal. Dans ce protocole, nous démontrons la cartographie des profils d&#39;expression FLP dans certaines HE-FLPx2 lignes et l&#39;efficacité de la méthode dans les cellules photoréceptrices FINGR. Le principe de la méthode FINGR devraient également être applicables à d&#39;autres organismes modèles génétique dans lequel Gal4/UAS, GAL80 et FLP / FRT sont utilisés.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Nous décrivons une flippase induite intersectionnelle Gal80/Gal4 répression (FINGR) méthode, permettant tissu-spécifique FLP pour déterminer les profils d&#39;expression GAL80. Partout où Gal4 et le chevauchement FLP, Gal4 expression est activée (GAL80 flippé) ou désactiver (GAL80 basculé dans). La méthode FINGR est polyvalente pour l&#39;analyse clonale et la cartographie des circuits neuronaux.

Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

mapping-application-enhancer-trap-flippase-expression-larval-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K vues.  University of Oklahoma - Norman. Nous décrivons une flippase induite intersectionnelle Gal80/Gal4 répression (FINGR) méthode, permettant tissu-spécifique FLP pour déterminer les profils d'expression GAL80. Partout où Gal4 et le chevauchement FLP, Gal4 expression est activée (GAL80 flippé) ou désactiver (GAL80 basculé dans). La méthode FINGR est polyvalente pour l'analyse clonale et la cartographie des circuits neuronaux.

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisation des larves nerfs segmentaires en 3 Rd Instar Drosophile Les préparatifs des larves

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

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Neurosciences

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophile adulte olfactive apprentissage choc

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imagerie fonctionnelle du cortex auditif chez chats adultes à l&#39;aide de haut-champ IRMf

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analyse fonctionnelle du circuit d&#39;alimentation des larves dans Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Acquisition de haute qualité vidéo numérique de<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportements larvaire et adulte à partir d&#39;un point de vue latéral

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire Ramper Comportement

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...