Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros du NCI.

1. Préparation des stocks de Maître <ol><li> Faire des stocks de base des composés à tester dans du DMSO. Préparer des stocks à une concentration standard de 20 mM. Remarque: une concentration supérieure à 10 mm peut être utilisé. Les composés qui peuvent être utilisés comme témoins positifs pour valider ce test comprennent RAL, EVG et DTG. </li><li> S&#39;assurer que les composés sont dissous dans du DMSO au vortex les solutions de multiples fois pendant 15 s et en incubant à température ambiante pendant 1 h. Conserver les solutions mM 20 dans l&#39;obscurité à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Préparation des plaques à 96 puits pour le composé dépistage <ol><li> Choisissez la lignée cellulaire à tester (par exemple HOS ou TZM-bl), et ensemencer 100 pi de ces cellules à une densité de 4 x 10 4 cellules / ml (4.000 cellules / puits) dans les médias (par exemple Eagle ou milieu DMEM modifié Dulbecco supplémenté avec 5% (v / v) de sérum de veau fœtal, 5% de sérum de veau nouveau-né, et de la pénicilline (50 unités / ml) plus streptomycin). </li></ol> 3. Génération des stocks de virus Produire VSV-G-VIH pseudotypé par transfection de cellules 293 (comme le montre la figure 1, étape 1) 32-34. <ol><li> Le jour avant la transfection, plaquer les cellules sur des boîtes de 293 100 mm de diamètre à une densité de 1,5 x 10 6 cellules. </li><li> Le jour de la transfection, la transfection de cellules 293 avec 16 ug de type sauvage ou mutant du VIH (pNLNgoMIVR - ΔLUC) et 4 pg de VSV (pHCMV-g) en utilisant le procédé au phosphate de calcium 35. </li><li> Environ 6 heures après le précipité de phosphate de calcium est ajouté, laver 293 cellules deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS) et incuber avec du milieu frais pendant 48 heures. [DMEM additionné de 5% (v / v) de sérum de veau fœtal, 5% de sérum de veau nouveau-né, et de la pénicilline (50 unités / ml) et streptomycine (50 ug / ml)]. </li><li> Récolter le virus surnageants contenant en enlevant le support du 100 mm de diamètreplats, clarifier les surnageants par centrifugation à faible vitesse à 3000 tours par minute pendant 10 minutes, filtrer le surnageant à travers un filtre de 45 um taille des pores de la seringue, de traiter les surnageants avec Turbo DNase pendant 30 min à température ambiante et diluer le surnageant dans les médias pour la préparation de tests d&#39;infection . Conserver les surnageants viraux congelés, en aliquotes, à -80 ° C. Note: la quantité de p24 dans le surnageant est déterminée en utilisant un kit d&#39;immuno p24 de HIV-1 dosage lié à une enzyme. La concentration de p24 est utilisé pour contrôler la quantité de virus dans l&#39;échantillon. Environ 500 ng de virus est ajouté aux cellules HOS plaquées sur des boîtes de 60 mm de diamètre à une densité de 1,5 x 10 5 cellules / boîte, le jour avant l&#39;infection. Après une incubation de 48 h, les cellules sont récoltées, recueillies par centrifugation, lavées et remises en suspension dans 100 ul de PBS. Ajouter une quantité égale de Luminescence reporter réactif de dosage génique et mesurer l&#39;activité de la luciférase comme décrit dans les sections 5.4.1 et5.4.2. De là, une dilution appropriée du virus peut être effectuée comme décrit dans l&#39;étape 4.6. </li></ol> 4. Composé dépistage en plaques à 96 puits Screen chaque composé en triple exemplaire et la moyenne des résultats. Remarque: l&#39;effet de chaque composé sur la réplication virale est corrigée par normalisation au niveau de la réplication obtenu en l&#39;absence de tout composé. <ol><li> Déterminer la gamme de concentration empirique à être projeté. Remarque: en général, les écrans de 11 dilutions en série sont fabriqués en ajoutant le composé de la colonne de la plaque par colonne et écrans de 7 dilutions en série sont fabriqués en ajoutant le composé par ligne. Une triple série de puits doit être réservé pour le contrôle pas composé. En outre, une colonne ou une ligne doivent rester vierge pour agir comme contrôle négatif / arrière-plan. Enfin, qu&#39;il s&#39;agisse d&#39;une cytotoxicité cellulaire ou un dosage d&#39;infectivité déterminera si le virus est ajouté. </li><li> Préparerdilutions en série de la solution stock de 20 mM. Les concentrations sont choisies en fonction de l&#39;intervalle déterminé de manière empirique des concentrations à tester (voir tableau 1). Préparer les dilutions dans les médias à 10x la concentration finale souhaitée, c&#39;est à dire si la concentration finale va être 100 uM, faire un stock de travail 1 mM. Note: Les composés ayant des CI50 uM 10.5 ci-dessus ne sont généralement pas de bons candidats pour le développement de médicaments. Dans les essais initiaux, nous testons les composés seulement contre le vecteur WT. Composés prometteurs qui inhibent efficacement le vecteur WT sont ensuite testés sur un panel de mutants résistants aux médicaments. </li><li> Retirer les plaques de 96 puits à partir de l&#39;incubateur et ajouter des dilutions en série des composés à tester dans les puits, en triple exemplaire (comme le montre la Figure 1, étape 2). Note: le volume ajouté au puits devrait être de 1/10 de volume de la concentration finale. Ainsi, ajouter 22 ul / puits (volume final pplus de virus ost est de 220 pi) pour les épreuves d&#39;infectivité. Pour les essais de cytotoxicité, ajouter 11 ul / puits (volume final est de 110 ul / puits). </li><li> Retourner les plaques à 96 puits à l&#39;incubateur. Pour un écran de cytotoxicité cellulaire, incuber les plaques à 96 puits 48 heures à 37 ° C et pas d&#39;autres manipulations sont nécessaires dans le protocole 4: procéder au protocole 5 Pour les épreuves d&#39;infectivité, continuer en suivant les instructions du protocole 4.. </li><li> épreuves d&#39;infectivité seulement. Retirer les plaques de l&#39;incubateur après un minimum de trois heures d&#39;incubation à 37 ° C avec les composés à analyser. Remarque: cela permet au composé d&#39;être absorbé par les cellules avant l&#39;infection avec le vecteur de VIH. </li><li> Préparer une dilution de virus de la 33, 34 (en général environ 1:3) qui va produire un signal de luciférase entre 0,2-1,5 unités relatives (RLU luciférase) dans les cellules non traitées. Une plaque entière prendra environ 10 ml de dilutionvirus de TED. Ajouter 100 ul de virus de chacun des puits, en utilisant soit une pipette multicanaux 8 ou 12. Ne pas ajouter de virus dans les puits de contrôle négatif / fond. Remettre les plaques à 37 ° C incubateur pendant 48 heures. Remarque: un magasin dilution 1:03 du virus est typique dilution qui va produire un signal de la luciférase entre 0,2 -1,5 RLU en fonction d&#39;un dosage de p24 montre que la concentration virale dans le surnageant est d&#39;environ 500 ng à 1,0 ml. </li></ol> 5. Préparation et évaluation de la cytotoxicité et de l&#39;infectiosité dans des plaques 96 puits <ol><li> Aspirer les médias des puits (phénol rouge dans les médias peut interférer avec le signal de la luciférase). Utiliser une pipette de verre avec un embout de pipette de 200 pi attaché à l&#39;extrémité. Commencez par le haut des médias et de travailler lentement vers le coin en bas du puits. Ne pas passer trop de temps au fond du puits, ou des cellules peuvent être retirées du puits. </li><li> Ajouter 100 pi de PBS complété avec 0,5 mMgCl 2 M à chaque puits. Ce qui doit être fait immédiatement après les médias est enlevé de sorte que les cellules ne se dessèchent pas. </li><li> Seulement pour les tests de cytotoxicité, ajouter 5 ml de tampon de substrat à partir de l&#39;essai de détection de la luminescence de l&#39;ATP à chaque flacon de réactif lyophilisé fourni. Un flacon est suffisant pour une plaque de 96 puits. <ol><li> Ajouter 50 ul de tampon de lyse de cellules à partir de l&#39;essai de détection de la luminescence de l&#39;ATP à chaque puits. Agiter la plaque de 96 puits à 700 rpm à température ambiante pendant 5 min en utilisant un thermomixer compact. </li><li> Ajouter 50 ul d&#39;reconstitué Luminescence ATP réactif d&#39;essai de détection de tous les puits à l&#39;exception des puits négatifs contrôle / fond. Agiter à 700 rpm à température ambiante pendant 5 min en utilisant un thermomixer compact. Incuber les plaques à température ambiante pendant 20 min pour donner le temps de développement du signal. </li><li> Lire la plaque à 96 puits en utilisant le luminomètre pour microplaques. Remarque: ouvrir le programme Pro microplaque de luminomètre SoftMax. Assurez-vous que le luminomètre est réglé pour mesurer luminescence à une sensibilité de 5 lectures / puits. </li></ol></li><li> Seulement pour les épreuves d&#39;infectivité, ajouter 10 ml de tampon de substrat de l&#39;analyse du gène de luminescence de reporter à chaque flacon de réactif lyophilisé fourni. Un flacon est suffisante pour que chaque plaque de 96 puits. <ol><li> Ajouter 100 ul de reconstitué Luminescence reporter réactif de dosage de gène à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 20 min pour donner le temps de développement du signal. </li><li> Lire la plaque de 96 puits en utilisant un luminomètre pour microplaques interprété dans la section 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Détermination de la CC 50 et IC 50 valeurs pour les composés <ol><li> Transférer les données de la luciférase luminomètre pour microplaques dans une feuille de calcul Excel. <ol><li> Fois la moyenne des données de la luciférase, en trois exemplaires et les données de signal de fond / contrôle. Soustraire la moyenne du signal de fond / commande du signal de trois exemplaires en moyenne pour l&#39;ensemble de la gamme de concentration. </li> &lt;li&gt; Normaliser l&#39;objet d&#39;une correction de signal moyen pour les gammes de concentration de l&#39;activité contre, s&#39;il s&#39;agit d&#39;une cytotoxicité ou d&#39;infectivité, en l&#39;absence de tout composé à déterminer le pour cent d&#39;inhibition. Remarque: inhibition en pour cent est définie comme l&#39;activité de luciférase en présence de médicament divisé par l&#39;activité de la luciférase en l&#39;absence de médicament, multiplié par 100. </li></ol></li><li> Utilisez logiciel Kaleidagraph obtenir CC 50 et IC 50 valeurs <ol><li> Transférer à la fois la plage de concentration déterminée empiriquement pour cent et l&#39;inhibition de l&#39;activité de la luciférase dans Kaleidagraph. </li><li> Tracer les données de la plage de concentration sur l&#39;axe des x et le pour cent d&#39;inhibition de l&#39;activité de la luciférase sur l&#39;axe y. </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Nous décrivons un dosage rapide, efficace et reproductible qui peut être utilisé pour cribler des composés pour la cytotoxicité et pour leur capacité à inhiber la replication à la fois de WT et du VIH-1 résistant aux médicaments. La capacité d&#39;identifier rapidement les composés et de tester leur efficacité et leur cytotoxicité est crucial dans le développement de médicaments nouveaux et améliorés contre le VIH-1. Une fois que les composés de plomb sont identifiés, des analogues du composé du plomb peuvent être préparés et testés en utilisant le même dosage. Le dosage est relativement simple. Il ya deux contrôles positifs et négatifs qui permettent à l&#39;utilisateur de diagnostiquer les problèmes les plus courants (composés toxiques, des problèmes avec le vecteur stock). L&#39;utilisation d&#39;un ensemble de triple puits sans composé ajouté montre que l&#39;infection virale s&#39;est produite. Le fait que la cytotoxicité est mesurée dans un test indépendant permet d&#39;éviter une mauvaise interprétation d&#39;une réduction de la luciférase de la cytotoxicité provoquée par un effet spécifique sur la réplication virale. Les étapes critiquesdans le protocole sont la préparation des plaques de sorte que les cellules sont uniformément réparties dans les puits, ce que les puits ont des concentrations appropriées des composés à tester, en ajoutant la même quantité de virus de chacun des puits, et la mesure de l&#39;activité luciférase à déterminer la CC 50 et IC 50 valeurs. Le test est sûr, quantitative et reproductible. Le test est sûr parce que le vecteur est déficient pour la replication. Le dosage est quantitatif et reproductible car il est basé sur un vecteur unique ronde qui exprime la luciférase, qui peut être dosé avec précision et commodément. Dans un dosage de réplication de virus tour multi, le CI 50 mesurée en fonction du nombre de cycles de vie viraux; il s&#39;agit d&#39;un problème particulier lorsque les dosages impliquent à la fois des virus WT et résistantes aux médicaments qui peuvent avoir des capacités différentes de façon significative de la réplication. Il ya eu plusieurs dosages enzymatiques indiqué précédemment que possibleêtre utilisés pour cribler des inhibiteurs IN. Des essais qui impliquent une technologie de PCR en temps réel pour mesurer ADN intégré nécessitent des protéines recombinantes purifiées (s), et sont, en général, à la fois plus de main-d&#39;oeuvre et onéreuse 36, 37. Bien qu&#39;il soit possible d&#39;utiliser des dosages enzymatiques pour mesurer l&#39;impact des composés sur les autres enzymes virales (RT et la protéase), chaque enzyme nécessite son propre système de dosage. Le seul essai de tour vecteur, tel que décrit, peut être utilisé, sans modification, pour dépister les inhibiteurs de la RT. Un dosage similaire peut être utilisée pour cribler des inhibiteurs de la protéase; Cependant, dans un essai d&#39;inhibiteur de la protéase, les composés doivent être ajoutés à des cellules utilisées pour produire les vecteurs. Un dosage liée, en utilisant différentes cellules et des vecteurs, peut également être utilisé pour le dépistage de l&#39;enveloppe (env) et des inhibiteurs de fusion du VIH entrée. Enfin, le dosage peut être utilisé, à plus grande échelle, avec des distributeurs robotiques automatisés. Ainsi, le test peut être utilisé pour cribler de grandes banques de composés contre le WT et le mutant VIH. Toutefois, le fait le test peut détecter un inhibiteur de la réplication du VIH qui agit à différents stades de points de cycle de vie viral à une limitation dans l&#39;interprétation des données. Par lui-même le dosage qui ne définit pas l&#39;étape dans le cycle de vie est bloqué par un composé. Si cette question se pose, il peut être résolu en utilisant des dosages de temps d&#39;addition 38, et en testant le composé contre des protéines virales recombinantes purifiées. Malheureusement, malgré le succès des médicaments anti-VIH, il ya encore des problèmes à la fois la résistance et la toxicité. En l&#39;absence d&#39;un vaccin anti-VIH efficace, il est nécessaire non seulement pour développer de nouveaux médicaments thérapeutiques qui seront efficaces contre les mutants résistants aux médicaments existants, mais également de développer des médicaments prophylactiques qui peuvent réduire la propagation du virus. Si l&#39;utilisation prophylactique de médicaments anti-VIH incudes le traitement des personnes non infectées, cette approche sera un fardeau spécial sur le développement de médicaments qui sont ont little ou pas de toxicité à long terme.

La disponibilité de médicaments ciblant plusieurs étapes essentielles du cycle de vie du virus VIH-1 a conduit à la thérapie de combinaison de médicaments (appelée thérapie antirétrovirale hautement active ou HAART) qui a grandement amélioré le traitement du VIH-1 infection, et la survie à long terme des patients. HAART, qui utilise typiquement des combinaisons de deux nucléosides de la transcriptase inverse (RT) et des inhibiteurs non plus un inhibiteur de la protéase ou un inhibiteur non nucléosidique de la RT, a converti une maladie mortelle dans un état ​​de longue durée de vie de 1-5. Cependant, malgré les nombreux succès de la multithérapie dans suppression soutenue de la réplication virale, il a ses limites. HAART n&#39;élimine pas le VIH, de sorte que les patients ne sont pas guéris et le traitement est long de la vie. Il existe des problèmes de toxicité des médicaments et à l&#39;émergence de souches résistantes aux médicaments. Résistance peut se manifester à tous les médicaments contre le VIH anti-approuvés, y compris les médicaments nouvellement approuvés qui ciblent l&#39;intégrase du VIH (EN). La résistance aux médicaments se pose probablement BECAutilisation des mutations spontanées qui se produisent au cours de la replication virale (taux de 3 x 10 -5 cycle de mutations / base / de réplication d&#39;erreur) 6. Lorsque des mutations se produisent dans les gènes codant pour les cibles de médicaments anti-rétroviraux, un petit sous-ensemble de ces mutations se traduira par une réduction de la sensibilité de la souche virale à des médicaments. Pour éviter le développement de la résistance aux médicaments, les concentrations de médicaments doivent être maintenus à des niveaux qui suppriment totalement la réplication du VIH. Une mauvaise observance du régime thérapeutique aggrave le problème, et peut conduire à l&#39;élaboration rapide d&#39;une résistance 7-9. Bien que les concentrations de médicament peuvent varier d&#39;un patient à cause de l&#39;absorption différente, le métabolisme, la distribution et les niveaux d&#39;excrétion, des concentrations élevées de médicaments peuvent conduire à une toxicité 10. Puisque la thérapie continue pour la vie du patient, il existe de graves préoccupations en matière de sécurité au sujet de la toxicité à long terme des anti rétroviraux. Les anti rétroviraux couramment utilisés dans HAART peuvent avoir des effets indésirables d&#39;une il ya eu des cas où les effets secondaires ont été la vie en danger 11-15. Les problèmes rencontrés avec les patients du développement de la résistance et de la toxicité à la base de la nécessité de développer de nouveaux médicaments qui bloquent efficacement la replication des souches communes de médicaments résistantes du virus avec peu ou pas de toxicité à long terme. Ainsi, il existe un besoin pour un dosage qui peut cribler des composés qui bloquent des étapes essentielles dans le cycle de vie viral rapidement. Nous décrivons ici un dosage efficace qui peut être utilisé pour évaluer la cytotoxicité d&#39;un des composés et leur capacité à bloquer la replication à la fois de WT et des souches de VIH résistantes aux médicaments rapidement et efficacement. Le test que nous utilisons est semblable à un essai qui a été développé pour le dépistage de la résistance aux médicaments dans les virus isolés à partir de patients de 16 à 18. Bien que le dosage peut être utilisé sans modification pour le dépistage de composés qui peuvent bloquer la transcription inverse du VIH, nous DescrBIE en utilisant le test pour évaluer inhibiteurs de l&#39;IN. IN est une enzyme virale essentielle qui insère l&#39;ADN viral dans le génome cellulaire 19. Bien qu&#39;un certain nombre de promettre inhibiteurs de l&#39;IN sont en cours d&#39;élaboration, dont certains font actuellement l&#39;objet d&#39;essais cliniques, ne Isentress 20, 21 (aussi connu comme le raltégravir ou RAL) et, plus récemment, l&#39;elvitegravir (EVG) 22 et dolutégravir (DTG) 23 ont été approuvé par la FDA. Ces composés sont actifs à la fois contre le VIH sous-types non B et B en culture cellulaire et chez les patients 24, 25. Cependant, le traitement avec RAL sélectionne les souches résistantes du VIH-1 chez les mutants, y compris Y143R, N155H, et G140S/Q148H 24, 26-31. N155H et G140S/Q148H réduisent également l&#39;efficacité des IEV, qui met l&#39;accent sur la nécessité de concevoir et de développer la deuxième génération DANS inhibiteurs de transfert de brin (INSTIs) qui sont efficaces contre ces mutations de résistance.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Bien qu&#39;un certain nombre de médicaments anti-VIH ont été approuvés, il ya toujours des problèmes avec la toxicité et la résistance aux médicaments. Cela démontre la nécessité d&#39;identifier de nouveaux composés qui peuvent inhiber l&#39;infection par les résistants aux médicaments souches VIH-1 en commun avec une toxicité minimale. Nous décrivons ici un dosage efficace qui peut être utilisé pour déterminer rapidement la cytotoxicité cellulaire et de l&#39;efficacité d&#39;un composé contre les souches virales WT et mutantes. La ligne souhaitée de la cellule cible est ensemencé dans une plaque à 96 puits et, après une incubation de 24 h, en série de dilutions des composés à tester sont ajoutés. Pas d&#39;autres manipulations sont nécessaires pour les tests de cytotoxicité cellulaire; Dosages des anticorps anti VIH d&#39;une quantité prédéterminée d&#39;un ou l&#39;autre médicament ou WT VIH-1 résistant vecteur qui exprime la luciférase est ajouté aux cellules. La cytotoxicité est mesurée en utilisant un dosage par luminescence dépendante de l&#39;ATP et de l&#39;impact des composés sur l&#39;infectivité est mesurée en déterminant la quantité de luciferasez en présence ou en l&#39;absence des inhibiteurs putatifs. Ce test de dépistage prend 4 jours pour compléter et de multiples composés peuvent être criblés en parallèle. Les composés sont criblés en triple exemplaire et les données sont normalisées par rapport à des niveaux infectivité / ATP en absence de composés cibles. Cette technique permet une mesure rapide et précise de l&#39;efficacité et de la toxicité des composés potentiels VIH anti-.

Si l&#39;essai (figure 1, les étapes 1 et 2) a été effectuée avec succès, les valeurs de luciférase doivent ressembler les données présentées dans le tableau 2 Balayez la gamme de concentration.; un composé potentiellement puissant révélera augmentation de l&#39;activité luciférase à partir de la gauche vers la droite, et le contrôle doit avoir la plus forte activité de la luciférase. Si l&#39;activité de la luciférase ne dépasse pas 0,1 unités de luciférase relatives (RLU) à travers la plage de concentration, ce qui indique généralement que le composé a tué les cellules. Si les données de la luciférase est supérieur ou égal à 2,0 dans tous les RLU des dilutions en série, alors les composés ne sont pas capables d&#39;inhiber les infections du VIH-1 aux concentrations testées. Traçant la concentration des composés pour cent par rapport à l&#39;inhibition de l&#39;activité luciférase dans Kaleidagraph (tableau 3, partie A), après l&#39;exécution d&#39;une analyse de régression linéaire, va produire des résultats similaires à t<html> Tuyau montre le tableau 3, partie B. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Préparation du VIH-1 stocks viraux et la configuration de cytotoxicité cellulaire et unique tour infectiosité dosages. L&#39;étape 1, les cellules 293T sont transfectées avec pNL4.3ΔEnv.LUC et VSV-G et incubé pendant 48 heures à produire un virus 34 . Le virus est récolté et stocké (congelé à -80 ° C en aliquotes) jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit utilisé dans les tests d&#39;infectivité. Pour l&#39;étape 2, les cellules HOS sont ensemencées dans une plaque à 96 puits et incubées pendant 24 heures. Les cellules sont ensuite pré-incubées avec des dilutions en série des composés à tester pendant 3 heures et ensuite infectées avec le virus (soit WT ou résistante aux médicaments). Après une incubation de 48 h, l&#39;activité luciférase est mesurée. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tableau 1. Criblage de médicaments série dilution Prototype. Un dépistage plus rigoureux implique 11 dilutions en série qui commencent généralement à 10 uM et se terminent à 0,0005 uM. Les dilutions en série sont préparées 10x; il existe 100 ul de cellules et 100 pi de virus dans chaque puits). A ce volume et la suite de ces calculs, les dilutions en série sera suffisant pour 3 lignes d&#39;une plaque de 96 puits entier. Les tests de cytotoxicité sont préparés de manière similaire; Mais les 11 dilutions en série commencent à 250 uM et se terminent à 0,05 uM. Seuls 11 pl des dilutions sont ajoutés dans les puits de la plaque qui contient 100 ul de cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Le tableau 2. Luciferase lecture du signal de données et de détermination de pourcentage d&#39;inhibition de l&#39;activité de la luciférase. La table de données montre un ensemble typique de la luciférase de données pour un composé de succès. Le tableau indique également les calculs nécessaires pour déterminer le pour cent d&#39;inhibition de l&#39;activité de la luciférase et la CC 50 et IC 50 valeurs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tableau 3. Analyse de régression linéaire tableau de données. Partie A. Représentation graphique de la gamme de concentration utilisée pour cent par rapport à l&#39;inhibition de l&#39;activité de la luciférase dans Kaleidagraph va produire les courbes d&#39;inhibition appropriées. Partie B, Les courbes d&#39;inhibition sont définis par la 3 paramétriquefonction sigmoïde et ajustement aux données par régression linéaire des analyses 18. Ce tableau de données est ensuite utilisé en conjonction avec Microsoft Excel pour calculer les concentrations de médicament nécessaire pour inhiber l&#39;intégration du virus et de la cytotoxicité cellulaire de 50%, par exemple, IC 50 et CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Nous décrivons ici la cytotoxicité cellulaire et simples essais d&#39;infectivité rondes qui permettent la sélection rapide et précise des composés de déterminer leur cytotoxicité cellulaire (CC 50) et les valeurs IC50 contre WT et VIH-1 résistant médicament.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K vues.  National Cancer Institute.  Nous décrivons ici la cytotoxicité cellulaire et simples essais d'infectivité rondes qui permettent la sélection rapide et précise des composés de déterminer leur cytotoxicité cellulaire (CC 50) et les valeurs IC50 contre WT et VIH-1 résistant médicament. 

Vidéo: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Recherche

Immunologie et infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Pathogènes d’origine alimentaire préalable à l’aide de magnéto-fluorescent NANOCAPTEUR : Détection rapide d’e. Coli O157 : H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Détection et suppression de nucléase Contamination durant la Purification de l’intégrase du Virus spumeux Prototype Recombinant

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...