WPS a été soutenu en partie par des subventions du National Institutes of Health (CA129359), la Susan G. Komen pour la Cure Foundation (BCTR0706967), le Département de la Défense (BC084561), et le Seidman Cancer Center, tandis que MKW a été soutenue par une bourse de l&#39;American Cancer Society (PF-09-120-01). Un soutien supplémentaire pour ce travail a été fourni par le Centre Case for Imaging Research, le Centre du cancer de cas complète (P30 CA43703), et le Centre de la fibrose kystique (P30 DK027651).

1. Stabilité de l&#39;expression de la luciférase Renilla CMV-Driven <ol><li> Transfection et sélection d&#39;une population stable clonale est la méthode préférée pour l&#39;expression de la luciférase Renilla ce journaliste. Cette approche donne une approche plus cohérente et uniforme expression renilla luciférase après l&#39;introduction ultérieure d&#39;autres constructions rapporteurs secondaires (par exemple, la luciférase de luciole ou des protéines fluorescentes). </li><li> Transfecter des cellules malignes d&#39;intérêt avec la luciférase Renilla vecteur d&#39;expression codant, comme pcDNA3.1-Hygro ou un autre plasmide hébergeant un marqueur de sélection. </li><li> Après la transfection, les cellules transfectées placer sous une concentration optimisée de plusieurs antibiotiques-à-jour de semaine de faciliter l&#39;isolement des colonies individuelles, qui sont ensuite isolés individuellement et repiquées. </li><li> Sélectionnez ≥ 10 individuels luciférase de Renilla exprimant colonies de surveiller l&#39;étendue de l&#39;expression renilla. </li><li&gt; Colonies exprimant des quantités élevées de la luciférase de Renilla sont ensuite soumis à une analyse fonctionnelle afin de s&#39;assurer que les propriétés (i) physiopathologiques de leurs homologues parentaux sont conservés, et (ii) des valeurs d&#39;expression de Renilla ne s&#39;écartent pas ou changer au fil du temps. Ces étapes sont absolument essentiels pour éviter d&#39;isoler et d&#39;étudier des variantes clonales / déviants, et de valider la bonne intégration de la construction renilla dans le génome. </li><li> Une fois un transfectant stable est isolé et vérifié, on peut enlever la pression de sélection et d&#39;être assuré que l&#39;expression de la luciférase Renilla restera constante sur de longues périodes de temps à la fois in vitro et in vivo. </li></ol> 2. D&#39;expression, de sélection et de vérification fonctionnelle du promoteur inductible luciférase Firefly-Driven <ol><li> Sous-cloner le promoteur de l&#39;intérêt dans un rapporteur luciférase-pGL4 plasmide hébergeant un marqueur de sélection (par exemple, PURomycin) qui est distinct de celui utilisé pour sélectionner pour l&#39;expression stable de Renilla (par exemple, hygromycine). </li><li> Transfecter des cellules malignes comme à l&#39;étape I, et ensuite sélectionner une population stable polyclonal de la luciférase de luciole cellules exprimant. Parce que l&#39;endroit où un gène rapport s&#39;intègre dans le génome peut provoquer des effets erronées relatives à son expression et de la régulation, il est fortement recommandé de choisir des populations polyclonales de la luciférase de luciole cellules exprimant plutôt que des populations clonales de s&#39;assurer que (i) l&#39;expression du gène rapporteur reflète plus précisément celle du gène endogène dans les cellules parentales, et (ii) l&#39;intégration des effets sur l&#39;expression génique sont moyennées et diminué dans la population cellulaire hétérogène. </li><li> Les cellules malignes conçues pour exprimer de manière stable à la fois renilla et luciférases de luciole sont collectivement appelés les deux cellules rapporteuses bioluminescentes, ou des cellules DBR. </li><li> Utilisation &lt;traditionnelleem&gt; in vitro de cellules à base de luciférase dosages de gènes rapporteurs, vérifier que les cellules DBR réglementer expression de la luciférase de luciole, que ce soit positivement ou négativement, de manière concordante avec celle observée dans les cellules parentales transfectées de façon transitoire avec ces vecteurs. De même, vérifiez que le CMV axée sur l&#39;expression de renilla n&#39;est pas réglementé par des stimulations cellulaires ou de conditions différentes de traitement. </li><li> Pour ce faire, la culture et DBR cellules parentales dans des plaques 24 puits, et par la suite de façon transitoire co-transfecter des cellules parentales avec l&#39;original CMV-Renilla et promoteur-firefly constructions utilisées pour générer des cellules DBR. </li><li> Par la suite, traiter DBR et des cellules transfectées avec des facteurs parentaux ou d&#39;agents pharmacologiques connus pour réguler le promoteur de l&#39;intérêt, et par la suite quantifier luciole et la luminescence renilla l&#39;aide du kit Promega Luciferase Assay double. </li></ol> 3. Établir 4T1 tumeurs mammaires primaires <ol><li> Métastatique des cellules 4T1 carcinome mammaire que nousre trouve à des agents pathogènes manque de rongeurs adventice ont été conçus pour exprimer de manière stable une luciférase Renilla CMV-commandé (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciférase-hygro) et une SBE axée sur la luciférase de luciole (pGL4.2-SBE-luciférase de luciole-puro) comme décrit ci-dessus. Greffe orthotopique de ces résultats les cellules cancéreuses du sein dans la formation de métastases spontanées, principalement dans les poumons. </li><li> Cellules 4T1 devraient pas être autorisés à atteindre la confluence au cours de leur propagation dans traditionnels 2-dimensions des systèmes de culture de tissus, et ils doivent être repiquées la veille de leur inoculation dans vivo. </li><li> Les cellules 4T1 doit être dissocié par traitement à la trypsine, lavées soigneusement dans un milieu de croissance, et dilué dans du PBS à une concentration de 2x10 5 cellules / ml et stocké immédiatement sur ​​de la glace. </li><li> Femelles Balb / C femelles (4-6 semaines) devrait être anesthésiés par une dose d&#39;induction de 3% d&#39;isoflurane et maintenu sous anesthésie à la dose de 1% d&#39;isoflurane. Préparez le site d&#39;injection en tamponnant avec70% d&#39;alcool isopropylique. En utilisant une pince, pincez doucement et soulevez le 4 pad inguinale mammaire. Avec précaution, placer un côté aiguille de calibre 27,5 biseau vers le haut et injecter dans le tampon graisse mammaire directement sous le mamelon, en prenant soin de ne pas enfoncer l&#39;aiguille dans la cavité abdominale. Relâchez la glande et injecter lentement 50 ul de la suspension cellulaire (1x10 4 cellules) dans le tampon de graisse mammaire. </li></ol> 4. Initiale Dual Imaging luminescent <ol><li> Immédiatement après greffe des cellules 4T1 sur le bloc de graisse mammaire et tandis que les souris sont toujours anesthésié, injecter 100 ml de coelentérazine RediJect dans la veine latérale de la queue. Il s&#39;agit de la concentration du substrat optimal recommandé par le fournisseur et le mieux toléré par l&#39;animal. </li><li> Immédiatement placer la souris dans le cône de nez isoflurane dans le système IVIS-200 d&#39;imagerie et d&#39;acquérir une image de 0,5 à 1 minute luminescent. Efficacité entre l&#39;injection et l&#39;acquisition des images est très important, car le signalpour la luciférase Renilla descend abruptement à 30 secondes après l&#39;injection. Placez la souris de nouveau dans sa cage et lui permettre de récupérer pendant ≥ 1 heure, ce qui garantit que tout signal résiduel luciférase Renilla s&#39;est dissipée et que la souris a complètement récupéré de l&#39;anesthésie. </li><li> Administrer 150 mg / kg de sel de potassium de D-luciférine par injection IP et attendez 5 minutes. Il s&#39;agit de la concentration optimale de D-luciférine, qui fournit un signal luminescent stable pendant 5-15 minutes qui suivent son injection dans des animaux de laboratoire. Anesthésier la souris à l&#39;aide isoflourane et remplacer dans le IVIS-200, en prenant soin de placer l&#39;animal dans une position très similaire par rapport à l&#39;acquisition initiale renilla. L&#39;intensité globale de ce signal luciole dépendre de l&#39;activité du promoteur de l&#39;intérêt, et en tant que telle, l&#39;activité luciférase de luciole visualisation peut exiger de longues durées d&#39;acquisition. </li><li> En utilisant le logiciel Image IVIS Salon réglé sur &quot;photons&quot; mode, établir précieuxes à la fois pour l&#39;renilla et acquisitions luciole comme un moyen d&#39;établir des ratios de base relatives de luminescence (RLR). </li></ol> 5. Luminescent longitudinale d&#39;imagerie <ol><li> Cellules 4T1 sont très agressifs, tels que l&#39;inoculation de 1x10 4 cellules conduit généralement à la formation de tumeurs palpables dans 1 semaine, et à la létalité de l&#39;animal dans les 4-5 semaines. Tumeurs 4T1 ont une propension inhérente s&#39;ulcèrent de la semaine 4. La croissance et le maintien des tumeurs ulcérées peut exiger l&#39;approbation distincte IACUC. Les études présentées ici 4T1 tumorales ont été approuvés par le IACUC à la Case Western Reserve University. </li><li> Comme décrit ci-dessus, les souris doit être injecté par semaine avec coelentérazine RediJect pour surveiller la croissance tumorale et les métastases en général, ainsi qu&#39;avec la D-luciférine de suivre la voie de signalisation spécifique à divers stades de développement de la tumeur. Veillez à chaque fois pour assurer le signal de Renilla luciférase a complètement disparu avant l&#39;acquisitionle signal de la luciférase de luciole. </li><li> Comme les tumeurs 4T1 évoluer et progresser Renilla luciférase acquisitions doivent être normalisées aux valeurs initiales mesurées Renilla au moment de l&#39;inoculation des cellules tumorales comme un moyen de normaliser et de suivre la croissance de la tumeur primaire. Plus important encore, le calcul des valeurs RLR au fil du temps mettra en place la régulation temporelle de différents systèmes de signalisation relatifs à la croissance et la progression tumorale. </li><li> Manifeste métastase pulmonaire apparaît dans un délai de 3-4 semaines après la prise de greffe de cellules 4T1 sur le bloc de graisse mammaire. En comparant les valeurs RLR pulmonaires par rapport à ceux calculés pour la tumeur primaire établit la régulation spatiale des différents systèmes de signalisation relatifs à la croissance tumorale et les métastases. </li></ol> 6. Double imagerie bioluminescente de deux types de cellules uniques chez un seul animal <ol><li> Ingénieur une lignée cellulaire de cancer du sein à la luciférase Renilla expression stable au CMV axée sur la manière décrite ci-dessus. Répétez cetteprocessus d&#39;ingénierie en utilisant CMV-luciférase de luciole axée sur une deuxième ligne distincte des cellules cancéreuses du sein. </li><li> Ici, nous mixte renilla cellules exprimant la luciférase avec leurs 4T1 non métastatiques et isogéniques exprimant la luciférase de luciole homologues 4T07 10, 11. Des proportions variables de ces populations de cellules cancéreuses du sein mixtes sont ensuite injectés dans le coussinet de graisse mammaire comme décrit ci-dessus. </li><li> Immédiatement acquérir à la fois luciole et la luciférase Renilla images d&#39;établir initial représentant SRRL d&#39;un mélange de cellules inoculées donné. </li><li> Longitudinale d&#39;imagerie bioluminescente sera double de visualiser et de suivre les changements dans la composition cellulaire dans la tumeur primaire, ainsi que la métastase spatio-temporelle de chaque dérivé du cancer du sein par rapport à la croissance et la progression tumorale. </li><li> Alternativement, chaque populations cellulaires du cancer du sein peut être inoculé à des endroits différents chez la souris (c.-à droite et à gauche abdominaux mammaires coussinets adipeux)d&#39;évaluer les influences systémiques de ces deux populations présentent une sur l&#39;autre au cours de différentes étapes de la croissance tumorale et les métastases. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Un atout majeur de l&#39;imagerie bioluminescente double réside dans le fait que chaque image est cohérente et contrôlée, de sorte que les signaux continus provenant de la fonction de tumeur primitive comme une mesure importante pour évaluer le succès ou l&#39;échec de chaque renilla et l&#39;acquisition de luciole. Cet aspect de la procédure d&#39;imagerie est particulièrement important lors de l&#39;acquisition de l&#39;activité de la luciférase Renilla, dont coelentérazine substrat est très sensible à l&#39;oxydation qui se traduit par sa capacité à auto-luminescence. La figure 1A montre un exemple de cet effet secondaire, qui se manifeste d&#39;emblée comme non spécifiques des signaux luminescents provenant de l&#39;intestin, et non la tumeur primaire établie. En général, ces coelentérazine non spécifique signale transpirélectronique suivante échoué injections intraveineuses de ce substrat renilla luciférase. Cependant, une fois robustes signaux primaires Renilla dérivées de tumeurs ont été obtenus (figure 1B, image de gauche), il est prudent de procéder à la capture des mesures de signalisation voie-spécifiques issus de l&#39;imagerie luciférase de luciole (figure 1B, panneau de droite), dont la D-luciférine substrat est très stable lors de l&#39;injection IP et produit des niveaux négligeables d&#39;origine auto-luminescence. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" /> Figure 1. Acquisition renilla et lucioles dérivée images bioluminescentes de calculer SRRL in vivo. (A) Un exemple d&#39;une injection IV de coelentérazine échoué entraînant signal non spécifique dans le tractus intestinal. Cercle et PT indiquent l&#39;emplacement approximatif de la tumeur primitive. (B) Une acquisition réussie de renilla une souris portant une tumeur 4T1 primaire et pmétastases ulmonary (panneau de gauche; 4WK après une greffe du coussinet adipeux). L&#39;acquisition correspondant luciole permet de calculer à la fois SRRL de la tumeur primitive et ses métastases pulmonaires. (C) Représentation graphique de la tumeur primitive et des métastases pulmonaires SRRL calculée à partir des souris indiquées dans la partie B (n = 4).

<ol>
	<li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow:+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease.">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li><li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells.">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li><li>Wendt, M., Schiemann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+the+focal+adhesion+complex+prevents+oncogenic+TGF-beta+signaling+and+metastasis.">Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis.</a> Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).</li><li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis.">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li><li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis.">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li><li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages.">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li><li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors.">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells.">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li><li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression.">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li><li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Light,+No+Lysis.">Bright Light, No Lysis.</a> Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells. , (2005).</li><li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents.">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le pouvoir absolu des techniques d&#39;imagerie bioluminescente réside dans leur capacité à quantifier la croissance tumorale et les métastases dans les études longitudinales complexes, qui présente impliquait l&#39;utilisation de cellules 4T1 agressifs de cancer du sein. Parce que ces procédures s&#39;appuient sur l&#39;intégration stable des deux constructions rapporteurs luciférase, ces techniques peuvent être aisément adaptés et traduits dans d&#39;autres lignées de cellules cancéreuses de différentes latences tumorales et les capacités métastatiques. Comme pour les résultats présentés ici, le calcul SRRL spécifiques à l&#39;intérieur se développe lentement tumeurs primaires et leurs métastases éventuelles permet d&#39;identifier en temps réel spatio-temporelle des événements précis de signalisation qui transpirent pendant la progression métastatique des tumeurs quelle que soit la durée de leur temps de latence. Lors de l&#39;identification des événements promoteur réglementaires spécifiques, il est important d&#39;exciser la fois la tumeur primitive et ses métastases à l&#39;accomplissement de immunohistochimiques standard et différenciationl analyse d&#39;expression génique pour vérifier régulation similaire du gène endogène et / ou une protéine. Techniquement parlant, le principal défi des deux analyses bioluminescentes réside dans la durée relativement courte des signaux luciférase de Renilla. En tant que tel, cette technique d&#39;imagerie nécessite une optimisation significative de la procédure d&#39;injection queue veine, ainsi que l&#39;imagerie immédiat des animaux injectés individuellement, un processus qui prend du temps et relativement peu efficace à l&#39;imagerie luciférase de luciole. Récemment, Promega introduit &quot;Viviren», ce qui représente un substrat de deuxième génération luciférase dont les sites d&#39;oxydation sont bloqués par estérification jusqu&#39;à ce que les gains de cette molécule entrée dans les cellules, à quel point la molécule est rapidement désestérifié. Collectivement, ce nouveau substrat permet de réduire efficacement la modification auto-luminescence et non spécifique et / ou la dégradation couplée à renilla induite par l&#39;auto-luminescence 12. Ce faisant, cette nouvelle renillun substrat de luciférase produit brillantes signaux luminescents, mais les coûts excessifs liés à l&#39;acquisition et à l&#39;utilisation de «Viviren&quot; ont fourni relativement peu d&#39;études nécessaires pour évaluer l&#39;utilité globale de ce substrat dans deux analyses bioluminescentes. Enfin, la sensibilité de tout essai bioluminescent dépend essentiellement de la caméra CCD opérant dans l&#39;acquisition des unités individuelles de lumière. En effet, comme ces technologies améliorent, nous prévoyons un moment dans le futur où notre capacité à visualiser complexes lumière des réactions à médiation bioluminescentes peuvent transpirer efficacement sans déplacement des animaux 13.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vecteur </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> Glomax Mult-idection système </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> IVIS série 200 </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Double système de dosage de luciférase reporter </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject coelentérazine-h </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-luciférine K-Sel </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual substrate bioluminescent imaging

Notre compréhension de comment et quand les cellules du cancer du sein de transit établies à partir de tumeurs primaires vers des sites métastatiques a augmenté à un rythme exceptionnel depuis l&#39;avènement des technologies de bioluminescence in vivo d&#39;imagerie 1-3. En effet, la capacité de localiser et de quantifier la croissance tumorale longitudinalement dans une seule cohorte de l&#39;animal à l&#39;achèvement de l&#39;étude, par opposition à sacrifier certains groupes d&#39;animaux en période d&#39;essai spécifiques a révolutionné la façon dont les chercheurs étudient les métastases du cancer du sein. Malheureusement, les méthodes actuelles obstacle à l&#39;évaluation en temps réel des changements cruciaux qui transpirent dans les systèmes de signalisation cellulaire que les cellules cancéreuses du sein (i) l&#39;évolution au sein des tumeurs primaires, (ii) diffuser dans tout le corps, et (iii) relancer les programmes de prolifération des sites d&#39;une lésion métastatique. Toutefois, les progrès récents de l&#39;imagerie bioluminescente, il est maintenant possible de quantifier simultanément spatiotempor spécifiqueal modifications de l&#39;expression génique en fonction du développement et la progression tumorale métastatique via l&#39;utilisation de deux substrats réactions de luminescence. Pour ce faire, les chercheurs de profiter de deux enzymes produisant de la lumière luciférase isolé de la luciole (Photinus pyralis) et de la mer pensée (Renilla reniformis), toutes deux réagissent sur ​​des substrats mutuellement exclusifs qui, auparavant, ont facilité leur large utilisation dans in vitro de cellules basées sur des tests de gènes rapporteurs 4. Ici, nous démontrons l&#39;utilitaire vivo de ces deux enzymes telles qu&#39;une réaction de luminescence marque précisément la taille et l&#39;emplacement d&#39;une tumeur en développement, tandis que la deuxième réaction luminescente est un moyen de visualiser l&#39;état d&#39;activation des systèmes de signalisation spécifiques au cours des étapes distinctes de la tumeur développement des métastases et l&#39;. Ainsi, les objectifs de cette étude sont de deux ordres. Tout d&#39;abord, nous allons décrire les étapes nécessaires à la construction double ligne de bioluminescence de cellules rapporteurs, ainsi que ceux nécessaires pour faciliter leur utilisation dans la visualisation de la régulation spatio-temporelle de l&#39;expression des gènes au cours des étapes spécifiques de la cascade métastatique. En utilisant le modèle 4T1 de métastases du cancer du sein, nous montrons que l&#39;activité in vivo d&#39;un élément de liaison synthétique Smad (SBE) promoteur a diminué de façon spectaculaire dans les métastases pulmonaires par rapport à celle mesurée dans la tumeur primaire 4-6. Récemment, les métastases du cancer du sein a été montré pour être régulée par des changements dans le microenvironnement tumoral et du stroma primaire réactive, y compris ceux qui se produisent dans les fibroblastes et les cellules immunitaires infiltrant 7-9. Ainsi, notre deuxième objectif sera de démontrer l&#39;utilité des deux techniques bioluminescentes dans le suivi de la croissance et de la localisation des deux populations de cellules uniques abrités au sein d&#39;un seul animal pendant la croissance du cancer du sein et des métastases.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging at JoVE.com

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Ici, nous décrivons les méthodes pour construire, visualiser et quantifier les réactions bioluminescentes à la fois luciole et la luciférase Renilla enzymes exprimées en cellules cancéreuses mammaires métastatiques au cours de leur croissance et les métastases<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo double Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

in-vivo-dual-substrate-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

15.4K vues.  Case Western Reserve University. Ici, nous décrivons les méthodes pour construire, visualiser et quantifier les réactions bioluminescentes à la fois luciole et la luciférase Renilla enzymes exprimées en cellules cancéreuses mammaires métastatiques au cours de leur croissance et les métastases In vivo.

Vidéo: In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Modèle murin Bioluminescent tumeurs hépatiques

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Recherche

Médecine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health disorders such as chronic wounds. We report the development of a dual-mode imaging system for non-invasive and non-contact imaging of cutaneous tissue oxygenation and vascular function. The imaging system integrated an infrared camera, a CCD camera, a liquid crystal tunable filter and a high intensity fiber light source. A Labview interface was programmed for equipment control, synchronization, image acquisition, processing, and visualization. Multispectral images captured by the CCD camera were used to reconstruct the tissue oxygenation map. Dynamic thermographic images captured by the infrared camera were used to reconstruct the vascular function map. Cutaneous tissue oxygenation and vascular function images were co-registered through fiduciary markers. The performance characteristics of the dual-mode image system were tested in humans.

A dual-mode imaging system was developed for non-contact assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function.

Double mode d&#39;imagerie de l&#39;oxygénation des tissus cutanés et la fonction vasculaire

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Implantation intracrânienne avec 3D ultérieures In Vivo Bioluminescent imagerie des gliomes murin

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

Dans l&#39;imagerie in vivo de angiogenèse tumorale en utilisant la fluorescence confocale vidéomicroscopie

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modèle Orthotopique bioluminescente la progression du cancer du pancréas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Simulation pancréatique neuroplasticité:<em&gt; In Vitro</em&gt; Double-neurone Plasticité Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Induits par la chimiothérapie vasculaire Toxicité - en temps réel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie de déficience navire

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...