Nous remercions C. Park pour la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIAMS sous Award Nombre K01AR061434 et un prix Leukemia &amp; Lymphoma Society Bourse (5127-09) à DP et des subventions des Instituts nationaux de la santé pour le CPL et DTS Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

1. Souris et préconditionnement Remarque: Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes et tous les protocoles ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l&#39;Hôpital général du Massachusetts. Toute chirurgie doit être réalisée dans des conditions stériles en utilisant du matériel stérile à l&#39;autoclave. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), et Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomate), étaient achetées auprès de Jackson Laboratories. souris ostéocalcine-GFP ont été fournies par le Dr Henry Kronenberg. Pour l&#39;analyse quantitative de la migration et de la prolifération OSPC in vivo, + (couleur unique journaliste) souris Mx1-Cre + Rosa-YFP ont été utilisés. Pour un suivi plus détaillé de leur différenciation en ostéoblastes ostéocalcine + matures, nous avons utilisé trigenic Mx1-Cre + Rosa-tomate + OCN-GFP +les souris. <ol><li> Pour marquer Mx1 cellules + in vivo, préparer l&#39;acide polyinosinique-polycytidylique (PIPC, 2,5 mg / ml) dans une solution de PBS stérile et injecter 200 pi pour 20 g de Mx1-Cre + souris par voie intrapéritonéale reporter une fois tous les deux jours pendant 10 jours. </li><li> Pour éliminer les cellules hématopoïétiques MX1 + résidentes, irradier les souris avec une seule dose de 9,5 Gy. Après 24 heures d&#39;irradiation, les cellules de greffe de type sauvage de la moelle osseuse (1x10 6 cellules / souris) par voie intraveineuse 16. Remarque: Comme les cellules Mx1 inductibles comprennent les cellules hématopoïétiques et les ostéoclastes hématopoïétiques dérivés, l&#39;élimination de Mx1 + cellules hématopoïétiques améliore la qualité d&#39;image et la quantification de Mx1 + cellules ostéogéniques. </li><li> Après la transplantation de moelle osseuse, de surveiller les animaux pendant quatre à six semaines pour atteindre une repopulation réussie de cellules donneur de moelle osseuse. </li></ol> 2. MoPréparation utiliser <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de 50 ul de la kétamine / xylazine (100 mg / kg, xylazine 12 mg / kg de poids corporel) en utilisant une procédure IACUC approuvé. Remarque: La durée de l&#39;effet peut être prolongée par une dose supplémentaire de kétamine / xylazine. </li><li> Déterminer si la souris est totalement anesthésié par l&#39;absence de réponse aux pieds et / ou de la queue pincées. (Facultatif) Lorsque la souris est anesthésiée, obtenir un masque à gaz isoflurane sur le nez en collant. Réglez le niveau de l&#39;isoflurane à s&#39;assurer que l&#39;animal est entièrement sous sédation. </li><li> Couper les poils du cuir chevelu à l&#39;aide d&#39;une tondeuse électrique ou de petits ciseaux. Retirer les fragments de cheveux et stériliser la peau exposée avec 70% tampon imbibé d&#39;alcool. Appliquer le gel lacrymogène pour empêcher la déshydratation de la cornée. </li></ol> 3. Microfracture blessures <ol><li> Après s&#39;être assuré que l&#39;animal est entièrement sous sédation, faire une incision unique en forme de L inversé pour ouvrir la peau du cuir chevelu. En bref, faire une première incision transversale (moins de 1 cm) starting d&#39;une oreille à l&#39;autre oreille. Tournez ~ 60 ° et continuer à inciser vers le nez jusqu&#39;à ~ 2-3 mm de nez. Remarque: cette incision minimise la formation de tissus cicatriciels au-dessus de la zone à imager. </li><li> Séparez les lambeaux de peau en tirant vers les côtés avec une pince. Les deux os frontaux et l&#39;intersection des sutures coronale et sagittale devront être clairement exposés. </li><li> Nettoyer la surface ouverte par rinçage avec du PBS stérile et essuyage doux avec gaze ou de coton-tige stérile jusqu&#39;à ce que tous les poils résiduels sont éliminés. </li><li> Pour générer des microfractures sur la calotte crânienne, tenir la tête de la souris avec une main et une aiguille G 30 avec une autre main. Faire une micro-perforation (~ plaie de 0,2 mm de diamètre &lt;1 mm de profondeur) sur l&#39;os frontal gauche près de l&#39;intersection des sutures sagittale et coronale en insérant la pointe d&#39;une aiguille 30 G avec une légère pression et mouvement de torsion. Attention: Il est essentiel d&#39;éviter l&#39;aiguille de pénétrer dans le cerveau, réduisant ainsi bleeding et des lésions tissulaires. </li><li> Passez à une plus grosse aiguille (20 ou 25 G) et élargir le trou de perforation en tournant l&#39;aiguille (~ de 0,5 mm de diamètre). </li><li> Répétez l&#39;étape 3.3 à 3.5 pour générer deuxième ponction sur l&#39;os frontal controlatéral. </li><li> Essuyez les taches blessés par la chute continue de PBS jusqu&#39;à ce que le saignement s&#39;arrête. Remarque: Bleeding sur les sites de fracture va interférer avec l&#39;imagerie appropriée et induire la formation de cicatrices. </li><li> Appliquer une goutte de solution stérile de sérum physiologique ou de 2% Methocel sur le crâne pour éviter le séchage. Remarque: Ne laissez pas la surface du crâne à sécher, ce qui réduira la clarté d&#39;image. Il est important d&#39;utiliser une quantité suffisante de gel ou de solution saline pour couvrir la zone. </li></ol> 4. Imagerie intravitale <ol><li> (Facultatif) Avant imagerie, certaines souris sont injectés avec un colorant vasculaire pour visualiser les vaisseaux sanguins. Injecter rétro-orbitale avec 20 pi de Qtracker non ciblé 705 (2 uM solution dans 50 mM de tampon borate) dilué dans 80 ml de PBS. Utiliser une seringue à insuline pour réduire les déchets de réactif. Si le signal n&#39;est pas suffisamment clair, des montants supplémentaires pourraient être nécessaires. </li><li> Mettez le scanner. Remarque: Un scanner laser à base de polygones permet multi-canal d&#39;acquisition d&#39;image simultanée à la cadence vidéo (30 images par seconde). balayage de taux de la vidéo est très important pour l&#39;imagerie des animaux vivants. </li><li> Allumez le laser multi-photons (femto-seconde titane: saphir laser). Régler la longueur d&#39;onde de 880 nm et d&#39;ajuster la puissance pour la deuxième imagerie par génération d&#39;harmoniques (440 nm) de l&#39;os. Pour la GFP et tdTomato excitation, tournez sur la 491 nm et 561 lasers à l&#39;état solide nm. </li><li> Allumez le PMT (photomultiplicateurs) détecteurs pour chaque signal (a ± 20 nm de filtre 435 passe-bande pour la deuxième génération d&#39;harmoniques, un ± 19 nm filtre 528 passe-bande pour la GFP, et 590 ± 20 pour tdTomato.) (Facultatif) Utilisez une 638 nm laser hélium-néon et un PMT avec un ± 27,5 nm filtre 695 passe-bande pour détecter Qtracker 705 signaux. </li><li> Place l&#39;animal sur une platine de microscope motorisée axes XYZ. Gardez la souris dans la position la plus confortable avec un coussin chauffant électrique pour aider à maintenir la température du corps (ce qui réduit le risque de perte de l&#39;animal). Utilisez du ruban adhésif pour maintenir la souris pour minimiser le mouvement lors de l&#39;imagerie et de maintenir la zone imagée aussi horizontale que possible. </li><li> Appliquer une goutte de gel de méthylcellulose à chaud de 2% ou une solution saline physiologique sur le crâne pour éviter le séchage. Mettre une lamelle couvre-objet sur la zone de formation d&#39;image. Utilisez un objectif de faible grossissement (30x objectif immersion dans l&#39;eau à 0,9 NA) pour numériser la calotte crânienne. </li><li> Utiliser le contrôleur axes XYZ, trouver la surface de calotte crânienne par détection du signal SHG à partir d&#39;os et d&#39;identifier un emplacement de point de repère essentiel, comme l&#39;intersection entre les sutures sagittale et coronale sutures. Acquérir une image et enregistrer les coordonnées XYZ. </li><li> Continuer à rechercher l&#39;emplacement de la blessure en observant les signaux de SHG et de fluorescence. </li><li> Lorsque les sites de blessures ou la région of intérêt se trouvent, acquérir une image de la meilleure plan focal contenant les signaux de fluorescence à partir de SHG et les cellules d&#39;intérêt. Sauvegarder coordonnées XYZ et la distance à l&#39;intersection des sutures sagittale et coronale de définir leur emplacement précis pour les prochains cycles de l&#39;imagerie. </li><li> Pour recueillir des structures 3D cellulaires et des os de blessure de fracture, d&#39;enregistrer des images par Z-piles (2 - 5 Intervalle de um) avec ~ 100 um de profondeur de la surface de l&#39;os endostéale. Après l&#39;achèvement de l&#39;imagerie d&#39;un côté de la lésion, répéter le processus d&#39;imagerie pour venir sites de blessures. </li></ol> Procédures 5. Opération de post <ol><li> Après l&#39;imagerie, rincer site d&#39;imagerie avec une solution saline stérile pour enlever le gel de méthylcellulose à partir de la boîte crânienne. L&#39;utilisation d&#39;un coton-tige stérile, appliquer une petite quantité d&#39;onguent antibiotique triple sur la surface. Couvrir les lambeaux de peau et re-fermer le cuir chevelu par suture chirurgicale. Cela peut être fait avec un fil de suture hypoallergénique (de polyglactin absorbable suture) et 5-0 taille aiguille de suture. Attention: Bonne technique de suture minimise la formation de cicatrices. </li><li> Traiter tous les animaux avec injection IP de 0,05-0,1 mg / kg toutes les 12 heures de la buprénorphine pendant 48 heures après la chirurgie. Gardez les animaux dans une chambre de récupération à chaud jusqu&#39;à ce qu&#39;ils reprennent conscience suffisante. Après 3 à 5 jours, rouvrir la suture et répétez les étapes d&#39;imagerie intravitale pour suivre le changement cellulaire pendant la guérison des fractures. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice.">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50, 1357-1367 (2012).</li><li>Kovar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared-labeled+tetracycline+derivative+is+an+effective+marker+of+bone+deposition+in+mice.">Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice.</a> Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).</li><li>Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+promotes+progress+in+orthopedic+research.">Molecular imaging promotes progress in orthopedic research.</a> Bone. 39, 965-977 (2006).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).</li><li>Tu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix+overexpression+in+mesenchymal+stem+cells+stimulates+healing+of+critical-sized+defects+in+murine+calvarial+bone.">Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone.</a> Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La régulation des cellules souches du squelette peut être d&#39;une grande importance pour définir de meilleures méthodes pour atteindre la régénération osseuse. Imagerie quantitative et séquentielle au niveau cellulaire a été un défi technique. Bien que le long os modèle de fracture de la souris a été largement utilisé et adapté pour les études biomécaniques 17, son emplacement profond des tissus, la taille de fracture inégale, lésions des tissus mous, et l&#39;application des fixateurs d...

Maladies dégénératives des os et la perte osseuse liée à l&#39;âge, entraînant un risque élevé de fracture ostéoporotique est devenue un enjeu majeur de santé publique 1. maintien de l&#39;os est contrôlée par les ostéoblastes formant l&#39;os et les ostéoclastes de résorption osseuse. Défauts de cellules osseuses formant sont une cause principale de la perte osseuse liée à l&#39;âge et les maladies dégénératives osseuses 2,3. Alors que de nombreuses recherches ont porté sur l&#39;amélioration de la guérison de la fracture, la découverte de médicaments fiables pour guérir les maladies dégénératives osseuses et d&#39;inverser la faiblesse des fractures ostéoporotiques reste un problème important. Ainsi, l&#39;étude de la source de formation de cellules osseuses et de leurs mécanismes de contrôle de la régénération osseuse et la réparation concerne une nouvelle idée pour améliorer la régénération du squelette et inverser les maladies de perte osseuse. L&#39;existence de cellules mésenchymateuses multipotentes dans la moelle osseuse a été proposée sur la base de l&#39;identification des populations clonogéniques différente qui pourraitLiée en ostéogénique, lignées adipogéniques et chondrogènes ex vivo 4. Récemment, plusieurs études ont montré que les cellules souches du squelette / mésenchymateuses (SSC / MSC) sont une source naturelle d&#39;ostéoblastes et sont essentiels pour le renouvellement osseux, le remodelage et la réparation de fracture 5,6 . En outre, notre étude de la lignée de traçage révélé que les ostéoblastes matures ont une demi-vie de façon inattendue à court (~ 60 jours) et sont continuellement renouvelées par leurs cellules souches / progénitrices dans les conditions homéostatiques et la réparation des fractures normales 6. Cependant, l&#39;identité in vivo de cellules souches et de la manière dont ces cellules réagissent pour fracturer des blessures et de fournir des cellules formant l&#39;os ne sont pas claires. Par conséquent, il est important de développer un procédé qui est capable d&#39;analyser la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses / SSC endogènes dans des circonstances physiologiques. réparation de fracture est un processus multi-cellulaire et dynamique régie par un ensemble de complexecytokines et des facteurs de croissance 7. L&#39;approche la plus populaire pour les études de fracture est d&#39;utiliser un modèle animal avec fracture des os longs et d&#39;analyser les os par sectionnement de la moelle et des techniques d&#39;immunofluorescence 8-10. Ce processus de réparation peut être surveillée par plusieurs techniques d&#39;imagerie, y compris les micro-CT 11, la fluorescence dans le proche infrarouge 12, et la chimioluminescence imagerie 13. Cependant, chaque technique a certaines limites et il n&#39;y a pas moyen efficace de surveiller la fonction SSC / MSC au niveau cellulaire in vivo. Récemment, confocale / deux photons microscopie intravitale a été développé et utilisé pour détecter des cellules cancéreuses transplantées et les cellules souches hématopoïétiques dans le cadre de leur microenvironnement de la moelle osseuse, même à une seule cellule de résolution dans les animaux vivants 14. En combinant cette technologie avec une série de modèles lignée de recherches, nous avons pu définir que les cellules souches ostéogéniques / progénitrices peuvent être génétiquement marqués par ac transitoirevation de la résistance de myxovirus -1 (MX1), le promoteur et les progéniteurs induite MX1 peut maintenir la majorité des ostéoblastes matures au cours du temps, mais ne participent pas à la production de chondrocytes chez la souris adulte 6. En outre, nous avons démontré que OSPCs Mx1 marqués fournissent la majorité des nouveaux ostéoblastes dans la guérison des fractures 6. Ici, en utilisant des modèles de suivi ostéo-lignage et la microscopie intravitale, un protocole est prévue pour définir la cinétique in vivo de Mx1 + cellules souches / progénitrices ostéogéniques dans la réparation des fractures. Ce protocole offre imagerie séquentielle pour suivre le déplacement de ostéogéniques souches / progéniteurs dans les sites de fracture et la mesure quantitative de l&#39;expansion de ostéoprogénitrices dans le processus de réparation rapide. Cette approche peut être utile dans de multiples contextes, y compris l&#39;évaluation des candidats thérapeutiques pour améliorer la réparation osseuse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">C57BL/6J (H-2b)</td>
			<td style="width:140px;">Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td>
			<td style="width:195px;">000664</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride Injection</td>
			<td style="width:140px;">Bionichepharma</td>
			<td style="width:195px;">67457-001-10</td>
			<td>&#160;Vial size: 10 ml (50 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine Sterile Solution</td>
			<td style="width:140px;">Lloyd Inc.</td>
			<td style="width:195px;">NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buprenorphine Hl</td>
			<td style="width:140px;">BEDFORD LAB</td>
			<td style="width:195px;">NDC 55390-100-10</td>
			<td>Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS, 1X</td>
			<td style="width:140px;">CORNING cellgro</td>
			<td style="width:195px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol)</td>
			<td style="width:140px;">Kendall WEBCOL</td>
			<td style="width:195px;">5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine Surgical Scissor</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">14568-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extra fine Forceps</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VICRYL*Plus Suture</td>
			<td style="width:140px;">Ethicon</td>
			<td style="width:195px;">VCP490G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qtracker 705 non-targeted quantum dot</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:195px;">Q21061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methocel 2%</td>
			<td style="width:140px;">OmmiVision</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P0913-50MG</td>
			<td>100 &#956;l (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers</td>
			<td style="width:140px;">Spectra Physics</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser</td>
			<td style="width:140px;">Cobolt AB</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radius-635 HeNe laser</td>
			<td style="width:140px;">Coherent</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential in vivo imaging of osteogenic stem/progenitor cells during fracture repair

Os tourne en permanence et est fortement régénération suite à une blessure. Cellules souches / progénitrices ostéogéniques ont longtemps été émis l&#39;hypothèse d&#39;exister, mais sur une démonstration in vivo de ces cellules a récemment été atteints. Ici, les techniques d&#39;imagerie in vivo dans d&#39;enquêter sur le rôle des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes (OSPCs) et leur progéniture dans la réparation osseuse sont fournis. Utilisation de cellules ostéo-lignée traçage modèles et imagerie intravitale de microfractures induites dans les os de la voûte crânienne, OSPCs peut être directement observée au cours des premiers jours après l&#39;accident, dans lequel les événements critiques dans le processus de réparation se produisent tôt. sites de blessures peuvent être visualisés en séquence révélant que OSPCs déplacer à la blessure, d&#39;augmenter en nombre et se différencier en ostéoblastes formation osseuse. Ces méthodes offrent un moyen d&#39;étudier le rôle des régulateurs moléculaires des cellules souches intrinsèques et extrinsèques pour la régénération et la réparation osseuse.

<html> Le long modèle de fracture osseuse stabilisé a été populaire dans les études de fracture. Cependant, l&#39;os long ou grands modèles de fracture causer des dommages aux tissus multiples et, par conséquent, avoir une limitation dans la mesure quantitative de la fonction des cellules de l&#39;os. Nous avons développé une blessure mini-invasive (moins de 1 mm de diamètre avec peu ou pas d&#39;invasion dans la dure-mère) sur la voûte du crâne avec os frontaux forage d&#39;aiguille (figures 1A-1C)....

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Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

La mesure quantitative de la fonction progénitrices de l&#39;os dans la guérison des fractures nécessite haute résolution technologie d&#39;imagerie de série. Ici, les protocoles sont fournies à l&#39;aide de la microscopie intravitale suivi et l&#39;ostéo-lignée pour quantifier séquentiellement l&#39;image et la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes dans le processus de réparation de fracture osseuse.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

10.4K vues.  Harvard Stem Cell Institute.  La mesure quantitative de la fonction progénitrices de l'os dans la guérison des fractures nécessite haute résolution technologie d'imagerie de série. Ici, les protocoles sont fournies à l'aide de la microscopie intravitale suivi et l'ostéo-lignée pour quantifier séquentiellement l'image et la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes dans le processus de réparation d...

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In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

In vivo double Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Recherche

Médecine

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration of specific neural processes in the central nervous system. However, information is lacking on the molecular impact of these changes, especially on the endogenous opioid system during migraine headaches, and neuronavigation through these changes has never been done. This study aimed to investigate, using a novel 3D immersive and interactive neuronavigation (3D-IIN) approach, the endogenous &#181;-opioid transmission in the brain during a migraine headache attack in vivo. This is arguably one of the most central neuromechanisms associated with pain regulation, affecting multiple elements of the pain experience and analgesia. A 36 year-old female, who has been suffering with migraine for 10 years, was scanned in the typical headache (ictal) and nonheadache (interictal) migraine phases using Positron Emission Tomography (PET) with the selective radiotracer [11C]carfentanil, which allowed us to measure &#181;-opioid receptor availability in the brain (non-displaceable binding potential - &#181;OR BPND). The short-life radiotracer was produced by a cyclotron and chemical synthesis apparatus on campus located in close proximity to the imaging facility. Both PET scans, interictal and ictal, were scheduled during separate mid-late follicular phases of the patient's menstrual cycle. During the ictal PET session her spontaneous headache attack reached severe intensity levels; progressing to nausea and vomiting at the end of the scan session. There were reductions in &#181;OR BPND in the pain-modulatory regions of the endogenous &#181;-opioid system during the ictal phase, including the cingulate cortex, nucleus accumbens (NAcc), thalamus (Thal), and periaqueductal gray matter (PAG); indicating that &#181;ORs were already occupied by endogenous opioids released in response to the ongoing pain. To our knowledge, this is the first time that changes in &#181;OR BPND during a migraine headache attack have been neuronavigated using a novel 3D approach. This method allows for interactive research and educational exploration of a migraine attack in an actual patient's neuroimaging dataset.

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient&#039;s Brain During a Spontaneous Migraine Headache

In this study, the authors report for the first time a novel 3D-Immersive &#38; Interactive Neuronavigation (3D-IIN) through the impact of a spontaneous migraine headache attack in the &#956;-opioid system of a patient's brain in vivo.

3D-Neuronavigation<em&gt; In Vivo</em&gt; Dans le cerveau d&#39;un patient pendant une spontanée migraine

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

En Vivo Dynamique de la rétine microglial activation cours neurodégénérescence: confocale ophtalmoscopique Imaging and Cell Morphometry dans Souris glaucome

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The amount of the different tissues in the callus provides important information on the fracture healing progress. Available in vivo techniques to longitudinally monitor the callus tissue development in preclinical fracture-healing studies using small animals include digital radiography and &#181;CT imaging. However, both techniques are only able to distinguish between mineralized and non-mineralized tissue. Consequently, it is impossible to discriminate cartilage from fibrous tissue. In contrast, magnetic resonance imaging (MRI) visualizes anatomical structures based on their water content and might therefore be able to noninvasively identify soft tissue and cartilage in the fracture callus. Here, we report the use of an MRI-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice. The experiments demonstrated that the fixator and a custom-made mounting device allow repetitive MRI scans, thus enabling longitudinal analysis of fracture-callus tissue development.

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

The evaluation of tissue development in the fracture callus during endochondral bone healing is essential to monitor the healing process. Here, we report the use of a magnetic resonance imaging (MRI)-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice.

In Vivo Évaluation du développement de cals de Fracture au cours de la guérison osseuse chez la souris en utilisant un dispositif d’ostéosynthèse IRM-compatible pour le fémur de souris

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Occlusion de l’artère cérébrale moyenne permettant une Reperfusion par l’intermédiaire de réparation de l’artère carotide commune chez les souris

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

A Simplified Stepwise Approach to Echo Guidance during Percutaneous Mitral Valve Repair

Percutaneous transcatheter edge-to-edge reconstruction of the mitral valve is a safe and well-established therapy for severe symptomatic mitral regurgitation in patients with high surgical risk. Echocardiographic guidance in addition to fluoroscopy is the gold standard and should be performed using a standardized technique.
This article lays out our reproducible step by step echocardiographic guide including views, measurements as well as highlighting possible difficulties that may arise during the procedure.
This article provides detailed and chronological echocardiographic views for each step of the procedure, especially preferences between 2D and 3D imaging. If needed, pulse wave, continuous wave and color doppler measurements are described. Furthermore, as there are no official recommendations for the quantification of mitral regurgitation during the percutaneous edge-to-edge-repair procedure, advice is also included for echocardiographic quantification after grasping the mitral leaflets and after device deployment. In addition, the article deals with important echocardiographic views to prevent and deal with possible complications during the procedure.
Echocardiographic guidance during transcatheter mitral valve repair is mandatory. A structured approach improves the collaboration between interventionist and imager and is indispensable for a safe and effective procedure.

This protocol presents in detail how to perform real-time echocardiographic guidance during transcatheter mitral valve repair. The fundamental views and the necessary measurements are described for each stage of the procedure.