Les auteurs remercient Dan Bess de Sigma-Aldrich pour la présentation de la vidéo. Nous remercions également la Direction générale de Don, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Olivier, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, et Eleanor Williams pour leurs résultats et leurs contributions à la conception, la synthèse de constructions de FLS et de déterminer l&#39;activité biologique.

Le protocole suivant décrit la procédure générique pour l&#39;insertion des constructions FLS (figure 1) dans les membranes biologiques. Par souci de simplicité du protocole fait référence uniquement aux cellules (kodecytes), qui sont à une concentration de 100%. Cependant, les cellules terme est interchangeable avec des virions (kodevirions) ou des organismes ou des structures cellulaires et leur concentration dans le diluant n&#39;est pas important, à condition qu&#39;il soit toujours cohérentes entre les essais, contrôles et essais. Avec les globules rouges du volume globulaire est généralement de 80%, mais avec des virions, d&#39;embryons et d&#39;autres cellules, il est généralement inférieur à 1%. La méthode est très robuste et va produire des membranes modifiées lorsqu&#39;ils sont utilisés par aucun de ses variations, mais le raffinement sera nécessaire d&#39;optimiser et de normaliser le degré de modification nécessaire pour des applications spécifiques. 1. Préparation de FLS Construit <ol><li> Pour préparer la solution de reconstituer FLS construire stock du produit sec FLS (tableau 1) par l&#39;ajout de 1,0 ml de diluant (ou comme spécifié dans la notice du produit) dans le flacon de produit. Brièvement soniquer (30 secondes). Cela préparera une solution 1mg/mL, qui peut être répartie dans 100 uL des contenants stériles et stocké à 2-8 ° C pendant une semaine, ou au congélateur jusqu&#39;à 3 mois. </li><li> Pour préparer travaille FLS construire des solutions pour l&#39;insertion, juste avant l&#39;utilisation brève sonication (30 secondes) de la solution stock d&#39;homogénéiser les micelles. Diluer la construction de FLS dans le tampon (de préférence ne contenant pas de lipides ou de matériau très hydrophobe) à la concentration requise ou sur une plage, si désiré. </li></ol> Notes: <ol><li> Les constructions de FLS sera généralement insérer dans les cellules dans les médias lipidique contenant, mais nécessite généralement autant qu&#39;une concentration 50X FLS travail le plus élevé que si les médias en PBS ou autre lipide libre. </li><li> Les dilutions plage de travail dépendra de la demande, la sensibilité méthode de détection, le type de FLS construire, et le degré de modification nécessaire. Typiquement la gamme de dilution sera compris entre 10 à 500 mg de FLS par mL de diluant pour les constructions de FLS et d&#39;hydrates de carbone de 100 à 100 ug / ml pour les constructions de FLS d&#39;autres tels que les fluorophores et la biotine. </li><li> Si la préparation des diluants d&#39;insertion contenant plusieurs FLS construire, il suffit d&#39;ajouter les constructions ainsi que dans le même diluant à la concentration normale de travail. Si une construction est à la concentration beaucoup plus élevée que l&#39;autre, une certaine adaptation (augmentation) de la concentration peut être requise pour la moindre construction. Alternativement constructions peuvent être ajoutés de manière séquentielle, de préférence avec la plus grande concentration de construire en premier, suivi par le moindre. </li><li> FLS concentrations de construire au-dessus de 1000 pg / mL peut introduire des quantités importantes de lipides dans une membrane cellulaire, et peut changer la forme de la cellule ou le rendre plus sensibles à la lyse. </li><li> FLS solutions de construire de travail doit être conservé à 2-8 ° C et utilisé dans quelques jours. </li><li> Les constructions de FLS peut être dilué dans l&#39;eau mais ont réduit la stabilité et doit être utilisé en quelques heures. Si la notice précise de l&#39;eau comme diluant de reconstitution du produit dans le flacon contient également des sels (comme spécifié dans la notice). </li></ol> 2. Insertion de FLS Construire (s) dans les membranes <ol><li> Commencez par vous laver les cellules pour FLS libre modification des lipides non liés par centrifugation et l&#39;utilisation de PBS ou de lipides cellulaires des médias libres comme solution de lavage. </li><li> Pack de cellules ou de suspendre dans 100 ul de diluant. </li><li> Simultanément, préparer les témoins qui devraient idéalement être à la fois les cellules non modifiées (incubés avec du PBS, plutôt que solution de FLS) et / ou des cellules modifiées avec un bénin mais liées construire FLS. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;une dilution appropriée de FLS solution (contenant une ou plusieurs constructions FLS) aux cellules et incuber pendant 1-2 heures à 37 ° C. Un résultat similaire peut être obtenu par 6 heures d&#39;incubation à 25 ° C ou une nuit (18 heures) à 4 ° C - un mélange est recommandé tous les quelques heures si lourdes suspensions cellulaires sont utilisés. </li><li> Laver (en option) à deux reprises avec du PBS ou des médias de supprimer tout construit sans FLS et préparer une suspension appropriée. </li></ol> Notes: <ol><li> Le diluant utilisé pour suspendre les cellules peuvent être des milieux de culture cellulaire, le PBS, les solutions de stockage de cellules, etc, mais de préférence sans lipides (par exemple sérum de veau fœtal) ou des détergents (par exemple le Tween). </li><li> Différents volumes (de 100 uL) des ratios (de 1h01 cellules / solution FLS) ou des conditions d&#39;incubation de temps et de température peuvent être utilisés à condition que le même rapport, la concentration et le volume sont utilisés pour obtenir des résultats reproductibles. </li></ol> 3. Manipulation et visualisation <ol><li> Une fois le processus de modification de FLS a été achevé le kodecytes peuvent être stockés à 4-8 ° C dans les lipides des médias libres ou utilisés. </li><li> Kodecytes et kodevirions généralement le même comportement que les cellules non modifiées / virions et peut être Handled et consultés dans les systèmes de test normal (microscopie, sérologie, la cytométrie de flux, etc.) Ils n&#39;ont généralement pas d&#39;exigences particulières, sauf pour l&#39;évitement des solvants / détergents / lipides qui peut éluer les constructions à partir des lipides des membranes. </li></ol> Notes: <ol><li> Construit restera dans la membrane des cellules inactives, comme les globules rouges, si elles sont stockées dans les lipides des médias libres pour la vie de la cellule. Dans les cellules avec des membranes actives les constructions seront internalisés et métabolisés, à un taux dépendant de l&#39;activité membrane cellulaire. </li><li> Les cellules mortes contiennent généralement des niveaux élevés des constructions de FLS, ce qui peut être utilisé pour séparer les cellules non viables à partir des cellules viables. </li><li> Si kodecytes sont stockés (ou utilisés in vivo) en lipide contenant des médias / des environnements, tels que le sérum / plasma, la construction va lentement éluer de la membrane sur une période de plusieurs heures ou jours, selon la température et les concentrations de lipides / compositions. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: <ol><li> Les résultats représentatifs suivants dépendent de la construction utilisé (tableau 1), sa concentration inséré et la sensibilité et la spécificité du système de détection (s). En général, toutes les constructions de FLS va insérer dans les cellules après 1 heure, mais les conditions optimales devront être établis pour chaque situation. </li><li> Les constructions de FLS peut être utilisé pour étiqueter l&#39;extérieur d&#39;une variété de cellules vivantes 3-9,11,14. Dans les exemples illustrés dans la Figure 2 embryons à des stades différents ont été utilisés (car ils sont fragiles d&#39;une cellule), mais d&#39;autres cellules (Figure 3) ou virions enveloppés (figure 4) peuvent aussi être étiquetés. FSL-fluorescéine permet le marquage direct des surfaces (figures 2-4), tandis que FLS-biotine et d&#39;autres constructions de FLS peut nécessiter l&#39;utilisation d&#39;un système de détection secondaire (généralement avidine / anticorps / lectines) pour montrer leur présence (figures 5) . </li><li> Le groupe sanguin des marqueurs de la spécificité humaine ou animale peut être attaché aux cellules, y compris les globules rouges 4-9 (figure 6). Comme la quantité de FLS construire sur un kodecyte est contrôlable et reproductible 4-6, kodecytes pour dosage des anticorps peut être faite (tableau 2 et graphique 6). La source réelle de cellules n&#39;est pas important, ils peuvent être n&#39;importe quelle espèce, voire de la même origine que la source d&#39;anticorps, ce qui garantit sur ​​l&#39;antigène seulement incompatible, c&#39;est que mis en place par le FSL 7,8 (figure 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tableau 2" /> Tableau 2. Représentant réactions sérologiques de trois différents FLS-A (tri) kodecytes globules rouges testé contre les dilutions d&#39;anticorps monoclonaux anti-A. La solution à 50 uM de FLS-A (tri) lorsqu&#39;elle est incubée avec un volume égal de cellules rouges du groupe O produite forte Un cellules antigène positif, qui pourrait être détectée par une dilution 1:512 d&#39;anticorps monoclonaux anti-A. Le 5 - et 10 fois plus faible FLS-A (TRI) des solutions produites kodecytes avec le groupe de moins de sang Une expression de l&#39;antigène. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FLS construire aperçu" /> Figure 1. FLS construire aperçu. Comme une fleur des constructions de FLS se compose de trois éléments majeurs. Le chef fonctionnel (F) dans le cas de la construction de FLS peut être une variété de différents groupes biologiquement fonctionnels, une entretoise (S) conçu pour induire l&#39;espacement des F loin de la membrane, d&#39;améliorer la dispersibilité dans l&#39;eau et être non réactifs avec le sérum, tandis que les lipides diacyle permet la construction d&#39;spontanément intégrer dans les surfaces. (I)-FLS GB3 avec un groupe sanguin Gb 3 (ou P k) trisaccharide Galα4Galβ4Glcβ épitope. (II) FLS-A (tri) avec un groupe sanguin A trisaccharide épitope GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FLS-fluorescéine. (IV) FLS-biotine avec un fragment biotine F unique. Le groupe fonctionnel des structures de I à III sont conjugués à un dérivé activé de l&#39;adipate dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) tandis que l&#39;entretoise de structure IV est carboxymethylglycine-adipate base. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-marqué à la fluorescéine embryons murins" /> Figure 2. FSL-marqué à la fluorescéine embryons murins. Toutes les images sont d&#39;embryons vivants qui ont été étiquetés lorsque leur zone pellucide (ZP) était intacte (c.-à la construction de FLS traversé la ZP à l&#39;étiquette de l&#39;embryon à l&#39;intérieur). Images I-IV sont de ZP-libres libérés de leurs embryons ZP avec de l&#39;acide après Tyrodes étiquetage avec FLS-fluorescéine. Coloration identique se produit indépendamment du fait que les embryons ont été modifiés avec FLS ZP ou ZP intacte libre. Les embryons sont directement marqué avec FLS-fluorescéine, à l&#39;heure 2 37 ° C Méthode dans le sérum sans milieux de culture cellulaire, lavées puis affichés sous microscopie à fluorescence. (I) ZP gratuite de deux cellules d&#39;embryons murins montrant également classique coloration intense corps polaire. (II-III) ZP gratuitement à quatre cellules et huit embryons de cellules murines, deux taches sombres montrant des cellules qui sont outide de l&#39;avion au microscope de mise au point. (IV) ZP libres de cellules d&#39;embryons murins 16. (V) ZP intacte embryons murins blastocyste (D4-D5) où les deux l&#39;embryon et le zona sont étiquetés. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-fluorescéine et le poisson-zèbre" /> Figure 3. FSL-fluorescéine et le poisson-zèbre 14. (I) microangiographie sur une larve 52 HPF poisson zèbre (heures après fécondation) directement injecté dans la circulation avec FLS-fluorescéine. La vascularisation de poisson zèbre est taché. (II) FLS-fluorescéine hétérogènes cellules Zebrafish tissu rénal (ZK kodecytes) ont été créées ex vivo, puis des micro-injecté dans la circulation d&#39;un poisson zèbre 52 HPF destinataire. Observations in vivo de l&#39;kodecytes ZK ont été faites deux heures après l&#39;injection par l&#39;imagerie de la vascularisation sous fluorescence avec la microscopie time-lapse. Montré est une image vidéo unique avec de grandes cellules lent ou immobile (indiqué par des flèches orange) et rapide des cellules en mouvement (images floues dues aux mouvements - indiquée par des flèches vertes). Étiquetage permet en temps réel dans l&#39;observation in vivo du comportement et de biodistribution du kodecytes ZK. (III) l&#39;absorption orale de FLS-fluorescéine réalisée en plongeant dans les embryons de poissons zèbres FLS-fluorescéine contenant des supports pour un maximum de 5 jours. Le lavage a été réalisé par le transfert d&#39;embryons dans les médias ne contenant pas les constructions de FLS (au moins 6 heures est requis, mais peut être de plusieurs jours). (IIIa) microscopie à champ lumineux du poisson-zèbre FLS-fluorescéine traités correspondant à l&#39;image adjacente à fluorescence (IIIb). La fluorescence est préférentiellement situé dans le tractus intestinal. Aucune coloration n&#39;a été observée chez les embryons témoins non traités (IVa et IVb). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-fluorescéine étiquetage des virions" /> Figure 4. FSL-fluorescéine étiquetage des virions 10 VSV et le virus H1N1. (I) virus de stomatite vésiculaire (VSV) a été directement marqué avec 10 ug / ml FLS-fluorescéine pendant 2 h à 37 ° C, suivie par la fixation au paraformaldéhyde 4% puis la cytométrie de flux. Pas de purification de la VSV kodevirion après étiquetage FLS a été nécessaire. (II) cytométrie de flux de porcs infectés par les cellules testiculaires humaines Un Rico/8/1934 / Porto (H1N1) kodevirions marqué à l&#39;aide FSL-fluorescéine. Les cellules non infectées sont considérés comme la ligne noire tout en fusion de la kodevirion H1N1 avec les résultats des cellules ST dans une cellule fluorescente (ligne rouge). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FLS-biotine cellules marquées" /> Figure 5. FLS-biotine cellules marquées et la visualisation ultérieure par avidine marquée 7,8. Toutes les cellules ont d&#39;abord été étiquetés avec FLS-biotine pendant 1 h à 37 ° C, lavées ensuite réagir avec fluorophore avidine marquée, lavés et humides montés pour la microscopie à fluorescence. (I) Compilé image confocale d&#39;un blastocyste d&#39;embryons murins. (II) Centrale tranche confocale de l&#39;embryon de l&#39;image précédente. (III) en direct spermatozoïdes mobiles humains - le flou se produit comme une conséquence de leur mouvement. (IV) fixe (insertion de 4% après paraformaldéhyde) spermatozoïdes humains. (V) des érythrocytes humains. (VI) fixe (4% de paraformaldéhyde pré-insertion) RL95 cancer de l&#39;endomètre humain. (VII) non fixés RL95 endomètre lignée humaine de cellules de carcinome. (VIII) Biotine RBC kodecytes observé dans un échantillon de sang prélevé 2 heures après une perfusion intraveineuse de kodecytes avec (VIII), représentant un champ de vue en microscopie optique tout (VIIIb) est le même domaine visible en fluorescence, l&#39;identification des deux kodecytes présents sur le terrain de vue. Calcul du ratio de kodecytes aux cellules non marquées peut être utilisé comme un indicateur de la survie. (IX) en direct humaine kodecytes biotine endomètre visualisées en se liant à des billes avidinylated. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Glucides d&#39;ajouter des marqueurs de groupe sanguin pour le profilage sérologique" /> Figure 6. FSL-Glucides d&#39;ajouter des marqueurs de groupe sanguin pour le profilage sérologique. (I) de globules rouges humains kodecytes Galili ont été créés avec une concentration ensemble de FLS-Galili (500 pg / mL) et testé contre les dilutions de sérum humain. Globules rouges humains n&#39;apparaissent pas naturellement avec l&#39;antigène xenoantigen Galili. Kodecytes peuvent être utilisés à des niveaux quantitatifs d&#39;anticorps dans le sérum. Dans cet exemple, le donneur était déterminé à avoir un titre d&#39;anticorps anti-Galili de 1:32. (II) En créant kodecytes avec diminution des niveaux de FLS («titres d&#39;antigène»), un niveau optimal d&#39;antigène pour détecter les anticorps peuvent être déterminés (dans cet exemple Le a). Les cellules peuvent être créées pour que donner un résultat positif lorsque le taux d&#39;anticorps dépasse un titre spécifique. Le niveau d&#39;antigène FLS nécessaires pour donner un résultat positif dépend de la qualité et le niveau des anticorps détectés. Pour antigènes glucidiques, une solution de FLS de 100 pg / ml entraîne habituellement une forte réaction positive. (III) de l&#39;homme du groupe O les globules rouges ont été modifiés pour avoir un niveau spécifique d&#39;une fourmiIGEN (normalisé A kodecytes), et utilisée pour quantifier précisément et de manière reproductible anti-A dans le sérum humain. Dans cet exemple, l&#39;anti-A titre dans le groupe O testé le sérum est 01h32 et le kodecytes ont été préparés à partir du donneur globules rouges. Groupe sanguin (IV) A et B simultanément les antigènes inséré dans un échantillon du groupe O cellule unique rouges sont utilisés pour créer un kodecytes B faible faible. Ces kodecytes peut être utilisé pour des fins de contrôle de qualité ABO. Ce résultat montre l&#39;analyse d&#39;un spécifiquement formulé une kodecyte B faible faible testée contre les réactifs anti-A et anti-B et donne attendus réactions faibles.

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Deborah A. Blank et Stephen M. Henry sont des employés et les actionnaires de KODE Biotech Limited le propriétaire du brevet de la technologie KODE. Dan Bess est un employé de Sigma-Aldrich, qui a parrainé la production de cette vidéo article.

Modification des cellules et des virions avec des constructions de FLS est une technique très simple et robuste 3-11. Pour décrire et distinguer FLS construire des cellules modifiées et des virions à partir des cellules non modifiées, ils sont appelés kodecytes et kodevirions respectivement 6-10, mais seulement lorsque le groupe a introduit fonctionnelle peut être montré à être présents sur leur membrane. Lorsque kodecytes sont faites avec différentes concentrations de constructions de FLS, ils peuvent être visés par la concentration de la solution de FLS de construction utilisé pour les créer, par exemple 15 mg / mL Un kodecytes, ou si plus d&#39;un FLS est utilisé, alors un terme combinés, par exemple A + biotine kodecytes 7,8. Lorsque différentes cellules doivent être comparés, y compris le type de cellule dans la description est recommandée, par exemple rouge kodecytes biotine cellulaire ou kodecytes biotine endomètre 7,8. Bien que le processus d&#39;insertion est très robuste et d&#39;insertion (quoique avec des taux différents) se fera sur une large plage de température de 4 à 37 ° C et en quelques minutes à quelques heures, pour obtenir le contrôle d&#39;insertion reproductibles stricte du temps de contact, température, concentration en FLS ( y compris la formulation de diluant), et dans une moindre mesure la concentration de cellules sont nécessaires. À ce jour, toutes les constructions de FLS peut être utilisé pour modifier les cellules par la même technique 4-11, cependant, il est prévu que certaines conditions seront plus favorables à des flux de travail et / ou les exigences de manutention optimale des cellules / virions d&#39;être modifiés . La concentration exacte de FLS pour obtenir l&#39;effet désiré doit être déterminée par l&#39;utilisateur 4. La résultante de FLS construire des cellules modifiées / virions peuvent généralement être utilisés de la même manière comme une cellule non modifiée / virion dans les systèmes biologiques ou analytique 4-11. Comme les constructions FLS va lentement éluer de surfaces modifiées en cas de contact avec les solutions de lipides 7,8, ou être consommé par les cellules actives 11, ces questions doivent être examinées en ce qui concerne le niveau de signal ou d&#39;activité obtenues sur des périodes de temps. Kodecytes peuvent être fixes (par exemple le glutaraldéhyde / formol) après l&#39;insertion à condition que le fixateur ne contient pas de lipides à élution de solvants et le groupe fonctionnel est compatible avec le fixateur. Alternativement cellules fixes peuvent être modifiés avec des constructions de FLS. En plus de la modification de la surface des cellules et des constructions virion FSL peut également être perfusée directement dans la circulation des animaux de laboratoire entraînant dans la modification in vivo des cellules circulantes 7 et 12 pour inhiber des virus, des toxines, 12 et 7 anticorps. Construit FLS ont également été utilisés pour décorer les liposomes et peuvent être imprimés sur 13 surfaces de papier, où ils immobilisent, et peuvent ensuite être utilisées dans des tests de diagnostic. La capacité de modifier facilement les cellules vivantes avec une gamme croissante de constructions FLS devrait se révéler être un outil de recherche utile et de développement pour l&#39;étude de la biologie de la surface cellulaire.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. Commercialement disponibles construit FLS décrites dans ce document.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

La possibilité de modifier / visualiser des surfaces biologiques, puis d&#39;étudier les cellules modifiées / virion dans une gamme de in vitro et in vivo dans des environnements est essentielle à l&#39;obtention de mieux comprendre le fonctionnement de certaines molécules ou de l&#39;entité entière. Etudes de modification de surface biologiques sont généralement limités à l&#39;ingénierie génétique de l&#39;organisme ou de la fixation covalente des groupements chimiques de la surface de la cellule 1,2. Cependant, ces techniques traditionnelles d&#39;exposer à la cellule de réactifs chimiques, ou qu&#39;ils nécessitent une manipulation importante pour atteindre le résultat souhaité, ce qui les rend lourdes, et ils peuvent, par inadvertance sur la viabilité / fonctionnalité des cellules modifiées. Une méthode simple pour modifier inoffensive la surface des cellules est nécessaire. Récemment, une nouvelle technologie, la technologie KODE a introduit une gamme de nouvelles constructions comportant trois volets: un groupe de tête fonctionnelle (F), une entretoise (S) et une queue lipidique (L) et sont connus comme fonction-Spacer-lipidiques ou de FLS constructs3. L&#39;entretoise (S) est choisi pour fournir une construction qui est dispersible dans l&#39;eau, mais spontanément et de façon stable incorporer dans une membrane. FLS construire des groupements fonctionnels (F) à ce jour incluent une gamme de saccharides dont le groupe sanguin déterminants liés, les acides sialiques, les polysaccharides hyaluronane, fluorophores, biotine, radiomarqueurs, et une gamme de peptides 3-12. Les constructions de FLS ont été utilisés dans des embryons de modifier, de spermatozoïdes, le poisson zèbre, les cellules épithéliales / endomètre, les globules rouges, et des virions de créer des contrôles de qualité des systèmes et des panneaux de diagnostic, de modifier l&#39;adhérence cellulaire / interaction / séparation / immobilisation, et pour in vitro et in d&#39;imagerie in vivo de cellules / virions 3-12. Le processus de modification de cellules / virions est générique et extrêmement simple. La procédure la plus courante est l&#39;incubation des cellules (dans les lipides des médias libres) avec une solution de FLS construit pendant 1-2 heures à 37 ° C 4-10. Durant l&#39;incubation le FSL construit spontanément, intégrer dans la membrane, et le processus est terminé. Le lavage est optionnel. Cellules modifiées par des constructions de FLS sont connus comme kodecytes 6-9, tandis virions sont kodevirions 10. FLS construit en perfusions directes et kodecytes / kodevirions ont été utilisés dans des modèles animaux expérimentaux 7,8,10. Tous kodecytes / kodevirions semblent conserver leur vitalité normale et la fonctionnalité tout en acquérant la nouvelle fonction de la fraction F 7,8,10,11. La combinaison de la dispersion dans les médias biocompatible, l&#39;incorporation spontanée dans les membranes cellulaires, et une faible toxicité apparente, rend FSL construit des outils de recherche précieux pour l&#39;étude des cellules et des virions.

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FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Fonction-Spacer-lipidique (FSL) des constructions permettent les caractéristiques de surface des cellules vivantes et des virions d&#39;être modifiée sans perte de vitalité. La méthode nécessite seul contact simple de construire une solution avec une cellule de FLS / virion et l&#39;incorporation de surface spontanée et stable se produit.

Construit en FLS: une méthode simple pour la modification des cellules / Virion surfaces avec une gamme de marqueurs biologiques sans affecter leur viabilité

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

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13.7K vues.  AUT University and KODE Biotech Ltd. Fonction-Spacer-lipidique (FSL) des constructions permettent les caractéristiques de surface des cellules vivantes et des virions d'être modifiée sans perte de vitalité. La méthode nécessite seul contact simple de construire une solution avec une cellule de FLS / virion et l'incorporation de surface spontanée et stable se produit.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

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Biologie

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabrication de constructions myogéniques de l&#39;ingénierie tissulaire

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Une méthode CLHP lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés d&#39;échantillons biologiques complexes

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthèse et d&#39;étalonnage des nanosondes phosphorescent pour l&#39;imagerie oxygène dans les systèmes biologiques

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Une méthode simple pour l&#39;imagerie Arabidopsis Feuilles utilisant perfluorodécaline comme un moyen d&#39;imagerie infiltratives

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocole simple pour extraire l&#39;hémocytes de chenilles sauvages

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering homologues constructions de recombinaison<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Une méthode pour micro-injection de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.