Ce travail a été soutenu par le Clinical Technologies protéomiques pour le cancer initiative, 5U24CA126477-04.

1) Préparer lectine conjuguée colonnes POROS <ol><li> Mettez un masque pour se protéger contre l&#39;inhalation de Poros-AL perles au cours des étapes 1.1 à 1.2. Peser la quantité désirée de perles POROS (100 mg beads/300 volumes ul finale) et transférer dans un tube propre Eppendorf. </li><li> Lavez perles avec addition de 1 ml de tampon phosphate salin (PBS). Perles par centrifugation dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 3 minutes. Enlever le surnageant et répéter le lavage. </li><li> Peser la quantité désirée de lectine non conjuguée (1 - 4 mg / 200 perles ul) et transférer dans un tube propre Eppendorf. Ajouter PBS pour former un 5 - 20 mg / ml solution. Réserve 25 ul de cette solution. </li><li> Transférer la solution de lectine restantes aux billes Poros. Ajouter cyanoborohydrure de sodium à une concentration finale de 50 mM. Placer le tube sur une bascule et réagir une nuit à température ambiante. (Remarque:. Cyanoborohydrure de sodium est toxique et doit être manipulé sous une hotte de déchets contaminés doivent être éliminés de façon appropriée.) </li><li> Pellet les perles POROS comme à l&#39;étape 1.2. Retirer le surnageant et enregistrer en tant que solution de post-conjugaison. </li><li> Lavez perles avec une mémoire tampon Trempe ml (1 M de Tris-Cl, pH 7,4). Perles Pellet comme à l&#39;étape 1.2 et jetez le surnageant. </li><li> Bloquer les sites restants réactive sur les perles POROS avec 1 ml de tampon trempe. Ajouter cyanoborohydrure de sodium à une concentration finale de 50 mM. Placer le tube sur une bascule et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Perles Pellet comme à l&#39;étape 1.2 et éliminer le surnageant. </li><li> Lavez perles avec 1 ml de NaCl 1 M. Perles Pellet et éliminer le surnageant. Répétez quatre fois pour un total de cinq lavages. Les perles sont maintenant prêtes à emballer. </li><li> Pour déterminer la quantité de protéine qui a été conjugué à des perles Poros, effectuer un dosage de la concentration de protéines sur les solutions pré-conjugués lectine et post-conjugué. La différence dans les concentrations est la quantité de protéine qui a été conjugué à des billes. La quantité de protéines conjuguées par volume est égal à billes de la concentration de lectine sur les billes. Les concentrations cibles sont lectine entre 2 à 20 mg / mL. </li></ol> 2) Emballage des perles lectine conjuguée POROS dans une colonne en PEEK <ol><li> Assemblez le système d&#39;emballage (description ci-dessous) et l&#39;appuyer sur un stand anneau de métal. Le système d&#39;emballage se compose, de bas en haut, limiteur de pression, colonne de fin coupleur 1, fritte, la colonne (2 x 50 mm), coupleur colonne de fin 2, connecteur colonne, colonne de fin coupleur 3, colonne (4,5 x 50 mm), 4 coupleur extrémité de colonne et de raccord d&#39;extrémité. La colonne supérieure sert de réservoir pour les matériaux d&#39;emballage. </li><li> Resuspendre les perles POROS au volume désiré de tampon A. (10 mM tampon Tris, pH 7,4, chlorure de sodium 150 mM, 10 mM de chlorure de calcium, chlorure de magnésium 10 mM) Si l&#39;emballage d&#39;une colonne (~ 200 ul volume de lit), remettre en suspension dans 400 pi de tampon A. </li><li> Transfert conjugué perles POROS dans la colonne supérieure (réservoir). Ajouter le tampon A au réservoir jusqu&#39;à ce que la mémoire tampon atteint le sommet de la colonne. Placez délicatement l&#39;embout sur le haut de la colonne, en essayant d&#39;éviter les bulles d&#39;air dans la colonne. Branchez le raccord d&#39;extrémité de la colonne supérieure pour le système HPLC. </li><li> Pack de la colonne par l&#39;écoulement tampon A travers le système. Commencez avec un débit de 0,5 mL / min. Augmenter le débit de 0,5 ml / min jusqu&#39;à ce chaque minute soit 4 mL / min ou la pression maximale (3000 psi) a été atteint. Continuer au débit maximum possible au moins jusqu&#39;à 35 ml de tampon A sont passés par la colonne. </li><li> Éteignez les pompes et laisser la pression sur la colonne pour tomber à &lt;20 psi. </li><li> Doucement, démonter le système d&#39;emballage, en commençant par le haut. Lorsque le coupleur 2 extrémité de colonne est atteinte, retirez-le soigneusement. Certains documents doivent être emballés extrusion à partir du haut de la colonne. Avec une lame de rasoir ou semblable tranchant, doucement essuyer les perles extrusion, laissant une surface perles qui est encore avec le haut de la colonne. Ne pas appliquer de pression sur les billes pendant cette opération. </li><li> Dégagez la colonne remplie du stand anneau. Placez une fritte nouveau dans un coupleur nouvelle fin et tournez la colonne à garnissage plus se connecter cela avec le coupleur fritte / Fin de la fin de colonne (anciennement haut) ouvert. </li><li> Étiquette de la colonne appropriée. Il est maintenant prêt à l&#39;emploi. Lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé, la colonne peut être stockée dans du PBS avec 0,02% d&#39;azide de sodium à 4 ° C pour un maximum de 6 mois. </li></ol> 3) Programme de la méthode HPLC <ol><li> Les détails de la programmation de votre HPLC varient selon les spécificités du logiciel du fabricant. Nous utilisons un paradigme Michrom MG4 HPLC. Sur cette machine, les méthodes sont construites et sont accessibles sous la rubrique &quot;Configuration&quot; onglet en haut de l&#39;écran. Programme de la méthode suivante: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Temps </td><td> Débit (l / min) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tampon A: 10 mM tampon Tris, pH 7,4, chlorure de sodium 150 mM, 10 mM de chlorure de calcium, chlorure de magnésium 10 mM Tampon B: 0,5 M d&#39;acide acétique Le détecteur UV doit être programmé pour lire à 280 nm 0h00-19h50. L&#39;axe des y doit être ajustée afin de détecter des niveaux faibles d&#39;absorbance, par exemple, 0 -. 50 UA. </li><li> Si un échantillonneur automatique est disponible, le programme le calendrier suivant pour la collecte de fractions. Sinon, collecter les fractions par la main comme indiqué lors de l&#39;exécution de chromatographie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Fraction </td><td> Retard à la collecte d&#39;injection de l&#39;échantillon </td><td> Durée de la collecte (min) </td></tr><tr><td> Accréditives </td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td> Liés </td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Préparer les échantillons pour HPLC <ol><li> Avant d&#39;utiliser ce protocole, le plasma humain doit être appauvri sur les 14 protéines les plus abondantes en utilisant une colonne MARS (Agilent, Santa Clara, CA). Plasma appauvri, la lactoferrine humaine et l&#39;invertase de la levure doit être individuellement digérés par la trypsine et dessalé comme décrit précédemment 1. </li><li> Pour préparer la lectine spécifique lactoferrine standard, effectuer une chromatographie sur 50 ug digérés par la trypsine lactoferrine ni sur la AAD ou la colonne SNA en utilisant la méthode dans la partie 3. La fraction liée contiendra lectine spécifique glycopeptides lactoferrine. Neutraliser les échantillons que dans la partie 4.4, et dessaler comme dans la Partie 6. Resuspendre l&#39;échantillon dans une mémoire tampon A. mL L&#39;échantillon résultant est prêt à l&#39;emploi. </li><li> Trois expérimentale reproduit sera effectuée. Pour préparer l&#39;échantillon pour trois répétitions, ajouter 3 pmol de trypsine digère invertase et 1 pl de la lectine spécifique lactoferrine (AAD soit-ALC ou SNA-ALC) à 30 ul MARS appauvri, digérés par la trypsine équivalents à plasma, (PE). Un PE est définie comme le volume de plasma non-processed/intact/original partir de laquelle une quantité donnée de traitement du plasma (MARS-appauvri et la trypsine digéré) a été dérivé. Ajouter le tampon A à l&#39;échantillon pour atteindre un volume final de 330 pl. </li><li> Ajouter tampon de neutralisation (Tris 1 M pH 8,0), les flacons d&#39;échantillon qui permettra de recueillir l&#39;éluat. Le nombre et le volume des flacons que vous travaillez avec dépendra des contraintes de votre échantillonneur automatique. Pour le paradigme MG4, un flacon recueille les accréditives et deux recueillir l&#39;éluat. Il aura besoin d&#39;environ 1,5 ml de tampon Tris pour neutraliser 1 ml d&#39;éluat. PH cible neutralisée est de 7,0 à 8,0; pH test de test final avec un papier indicateur de pH. </li></ol> 5) Effectuer la chromatographie <ol><li> Toutes les pistes vierges et de l&#39;échantillon qui suivent utiliseront la méthode décrite dans la Partie 1. La colonne et les tampons sont à température ambiante pendant son utilisation. Les colonnes sont stockées à 4 ° C, tandis que les tampons sont stockés à température ambiante. </li><li> Fixez soit l&#39;AAL ou la colonne de lectine SNA au système HPLC et exécuter deux méthodes vierge (injection de tampon que A). Assurez-vous que la colonne de lectine correspond à la lactoferrine lectine spécifique (Partie 2). </li><li> Chromatographe les trois échantillons de plasma, l&#39;injection d&#39;un vide entre chaque échantillon injecté, pour un total de pistes HPLC 7. Les fractions de passe vierge ne pas être collectées. </li></ol> 6) Dessaler fractions collectées Pour chaque fraction utiliser un 1 ml Eaux Oasis HLB cartouche SPE comme suit: <ol><li> Fixer le nombre de cartouches nécessaires pour collecteur à vide. </li><li> Mouiller chaque cartouche avec une ACN ml à 80% dans l&#39;acide formique 1% (indicateur de vide sur le collecteur doit lire 5 à 20 lnHg). </li><li> Equilibrer les cartouches avec 1,5 ml d&#39;acide formique à 0,1% (jauge à vide sur le collecteur doit lire 5 à 20 lnHg) </li><li> Chargez le volume entier d&#39;un échantillon sur une cartouche (Vacuomètre sur le collecteur doit lire 2 - 2.5. LnHg, et le débit ne doit pas dépasser 1 mL / min) </li><li> Lavez les cartouches avec 3 x 1 ml d&#39;acide formique à 0,1% (Vacuomètre sur le collecteur doit lire 5 à 20 lnHg) </li><li> Peptides Eluer / glycopeptides dans des tubes Eppendorf étiqueté avec 1 x 1 ml d&#39;acétonitrile de 80% dans l&#39;acide formique à 0,1%. (Vacuomètre sur le collecteur doit lire de 2 à 2,5 lnHg, et le débit ne doit pas dépasser 1 mL / min.) Un tube de prélèvement unique devrait être utilisé pour chaque cartouche. </li><li> Neutraliser éluat en ajoutant 60 pl 0,5 M de bicarbonate d&#39;ammonium dans chaque tube de collecte. Target neutrpH de 7.0 à 8.0 est croissante est; pH test final avec un papier indicateur de pH. </li><li> Concentré de peptides élués / glycopeptides à ~ 50 pl en les exécutant sur ​​une centrifugeuse sous vide (par exemple, un Thermo Savant SpeedVac) pour ~ 2 hrs @ 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-digestion <ol><li> PH de l&#39;échantillon de test pour s&#39;assurer qu&#39;elle se situe entre 7,0 à 8,0. Si nécessaire, ajoutez du bicarbonate d&#39;ammonium 50 mM pour augmenter le pH. Si le volume de l&#39;échantillon final est&gt; 100 pi, l&#39;échantillon speedvac jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit entre 50-100 ul. </li><li> Ajouter 0,5 ul (250 U) de glycérol sans PNGase F à chaque tube d&#39;échantillon et incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 8) échantillons Astuce Zip <ol><li> En commençant par la PNGase F-digérée échantillons, ZipTip chacun comme suit. </li><li> ZipTip humide avec 10 ul d&#39;acétonitrile 100%, suivie par 10 à 80% d&#39;acétonitrile ul, 0,1% d&#39;acide formique. </li><li> Equilibrer ZipTip avec 20 ul d&#39;acide formique 0,1%. </li><li> Chargez l&#39;échantillon sur l&#39;ZipTip en le pipetage haut et en bas à travers la matrice ZipTip 10 fois. </li><li> Laver les ZipTip par pipetage 10 ul d&#39;acide formique 0,1%, 5 fois. </li><li> Eluer l&#39;échantillon dans un tube propre eppendorf avec 10 ul d&#39;acétonitrile 80%, 0,1% d&#39;acide formique. </li><li> Répéter l&#39;élution et ajouter le second 10 ul dans le même tube. </li><li> Speedvac les échantillons d&#39;un volume de &lt;2 pl. </li><li> Remettre en suspension dans les échantillons d&#39;acide formique 20 ul de 0,1%. Les échantillons sont maintenant prêtes pour l&#39;analyse par LC-MS/MS. </li></ol> 9) Les résultats représentatifs: La conjugaison POROS rendements généralement sur-perle concentrations lectine dans la gamme de 2 - 20 mg / mL. Ceci est optimal pour la chromatographie d&#39;affinité. Chromatographie lectine de digérés par la trypsine plasmatique MARS appauvri humaine enrichit généralement glycopeptides dans la fraction liée. Comme les glycopeptides sont PNGase F-traités avant LC-MS/MS, ils sont identifiés comme des peptides avec la séquence consensus N-liés, NXS / T (où X est un résidu, mais la proline), dans laquelle l&#39;asparagine a été converti en un acide aspartique par l&#39;action des peptides de F. PNGase avec ces caractéristiques sont considérées comme des peptides déglycosylé (ou &quot;deglycopeptides&quot;). En moyenne, le flux continu (FT) fraction d&#39;AAL ou SNA chromatographie contient deglycopeptides 2-4%, alors que 30-50% des peptides récupérés dans la fraction liée sont deglycopeptides. Généralement, l&#39;aide d&#39;une élite QStar, 1000-1300 peptides seront identifiés dans la fraction FT, et 200-400 peptides seront identifiés dans la fraction liée. Deux ou plusieurs deglycopeptides invertase distinctes doit être observée dans la fraction FT et deux ou plus distinctes deglycopeptides lactoferrine dans la fraction liée (tableau 1). <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1.

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li></ol>

Ce protocole fournit une méthode rapide pour isoler et identifier les glycopeptides de manière glycane-spécifiques. Comme glycosylation varie largement au sein d&#39;un organisme, en particulier pendant le développement et la pathogenèse, cette technique peut être applicable à aborder un large éventail de questions. En particulier, nous utilisons la méthode de façon sélective d&#39;enrichir glycopeptides qui ont été modifiés avec le cancer associés à des épitopes comme une première étape vers la découverte de biomarqueurs.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aleuria aurantia lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sambucus nigra agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

Glycanes sont une classe importante de modifications post-traductionnelles. On trouve généralement sur sécrétées et les molécules extracellulaires, structures glycanniques de signal du statut interne de la cellule. Glycanes sur les cellules tumorales ont tendance à avoir en abondance des fragments d&#39;acide sialique et le fucose. Nous proposons que ces variantes associées au cancer glycane être exploité pour le développement de biomarqueurs visant à diagnostiquer à un stade précoce de la maladie. En conséquence, nous avons développé un spectromètre de masse à base de workflow qui intègre une chromatographie sur des matrices d&#39;affinité formé à partir des lectines, des protéines qui se lient structures glycanniques spécifiques. Les lectines Sambucus nigra (SNA) et Aleuria aurantia (AAL), qui lient l&#39;acide sialique et le fucose, respectivement, ont été couplés de manière covalente à des billes Poros (Applied Biosystems) et emballés dans des colonnes PEEK pour la chromatographie liquide à haute pression (CLHP). Brièvement, le plasma était appauvri des quatorze protéines les plus abondantes en utilisant un système d&#39;affinité plusieurs retrait (MARS-14; Agilent). Plasma appauvri a été digérés par la trypsine et séparés en flux continu et des fractions lié par SNA ou AAD HPLC. Les fractions ont été traitées avec PNGaseF pour enlever N-glycanes, et analysés par LC-MS/MS sur une Elite QStar. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel Mascot. Le dispositif expérimental comprenait contrôles positifs-fucosylé et sialylées humaine glycopeptides et la lactoferrine négatifs des contrôles de haut glycopeptides mannose à partir de Saccharomyces cerevisiae, qui ont été utilisés pour contrôler la spécificité de la capture lectine. Les principales caractéristiques de ce flux de travail comprennent la reproductibilité dérivé du format HPLC, l&#39;identification positive des glycopeptides capturé et PNGaseF traités de leurs motifs Asn-Xxx-Ser/Thr désamidés, et évaluation de la qualité selon les normes glycoprotéine. Protocole d&#39;optimisation comprenait également déterminer le ratio approprié de matériau de départ à la capacité de la colonne, l&#39;identification de la capture la plus efficace et tampons d&#39;élution, et le suivi des traitements PNGaseF pour assurer déglycosylation plein. Les orientations futures comprennent l&#39;utilisation de ce flux de travail pour effectuer des expériences de masse de découverte basée sur la spectrométrie de plasma de patients du cancer du sein et les individus de contrôle.

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A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Lectine conjuguée perles POROS étaient employés pour la HPLC. Normes glycopeptides ont servi de contrôles positifs et négatifs. MARS-14 appauvri, digérés par la trypsine plasma humain a été chromatographié et accréditives (FT) et les fractions collectées liés à des analyses ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides ont été enrichis dans la fraction liée par rapport à FT.

Une méthode CLHP lectine pour enrichir sélectivement peptides glycosylés d&#39;échantillons biologiques complexes

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

a-lectin-hplc-method-to-enrich-selectively-glycosylated-peptides-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K vues.  University of California, San Francisco - UCSF. Lectine conjuguée perles POROS étaient employés pour la HPLC. Normes glycopeptides ont servi de contrôles positifs et négatifs. MARS-14 appauvri, digérés par la trypsine plasma humain a été chromatographié et accréditives (FT) et les fractions collectées liés à des analyses ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides ont été enrichis dans la fraction liée par rapport à FT.

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T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

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Biologie

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects on bone repair in a unicortical defect model. Treatment of mesenchymal cells produced an increase in alkaline phosphatase activity, showed nodule formation by the cells, and increased the expression of genes for runx2, osterix, bone sialoprotein, and osteocalcin. A collagen sponge soaked with peptide promoted repair of bone defects, whereas the control was less effective. The results from this study demonstrated that mesenchymal cells treated with peptide in vitro differentiate towards osteogenesis, and, that peptides delivered in vivo using a collagen sponge promote the repair of unicortical defects.

A phage display library was used to identify peptide sequences that target bone. The objective was to investigate the effect of these peptides on mesenchymal cell differentiation and to determine their effect on bone regeneration.

Les peptides de la bibliothèque de Phage Display modulent l&#39;expression génétique dans les cellules mésenchymateuses et potentialiser l&#39;ostéogenèse dans des défauts osseux Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Une méthode de génotypage basé sur la PCR pour distinguer les variétés de type sauvage et les plantes ornementales de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec l&#39;érythromycine complexe de l&#39;antibiotique A produite par<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Une méthode pour micro-injection de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purifier l&#39;impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d&#39;animaux associés

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Une méthode hybride d&#39;extraction d&#39;ADN pour l&#39;évaluation qualitative et quantitative des communautés bactériennes de la volaille Échantillons de production

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d&#39;enquêter sur l&#39;Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Préparation et observation d&#39;échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation