Ce travail a été financé par la National Science Foundation IOS 0844948 et 1024811 IOS

Gardez toute l&#39;eau de mer ou eau de mer artificielle (SW), les animaux adultes, et les cultures à 15 ° C autant que possible. Veiller à ce que les œufs et les zygotes sont maintenus immergés dans le sud ouest. Sels de mer préparés commercialement reconstituées avec de l&#39;eau distillée ou d&#39;osmose inverse sert bien comme une source de SW. Vérifiez la salinité aide d&#39;un densimètre et ajuster sels ou d&#39;eau pour obtenir un niveau optimal. Maintenir le niveau de densité entre 1,020 à 1,025. Gardez tout verre et en plastique distinct de tous les autres appareils de laboratoire pour éviter toute contamination par des produits chimiques. Clean embryon qualité du matériel de laboratoire d&#39;un rinçage à l&#39;eau désionisée ou de temps en temps de trempage dans de l&#39;hypochlorite de sodium dilué suivi d&#39;un rinçage à l&#39;eau plusieurs fois. 1 Obtention et de maturation des gamètes de Patiria miniata adultes <ol><li> Sélectionner un animal pour exciser les gonades. Déterminer le sexe après l&#39;excision par la recherche de la présence d&#39;ovaires ou testicules car P. miniata ne sont pas en soixually dimorphisme. </li><li> Couper une petite ouverture, ne dépassant pas 1 cm, le long du côté d&#39;un bras de l&#39;étoile de mer avec une lame de scalpel (Figure 1A). En utilisant de petites pinces à bouts ronds Tirez bords de l&#39;incision pour accéder au tissu des gonades et tirez tissus des gonades à travers l&#39;incision. REMARQUE: Évitez de tirer sur le tissu intestinal, qui est un tissu gris ou brun lâche (figure 1B). Les ovaires sont généralement orange, jaune ou brun clair (figure 1C), tandis que les testicules sont de couleur blanche ou beige et quand perturbés provoquera l&#39;eau de mer devienne laiteuse ou trouble en apparence (figure 1D). </li><li> Femelles Retour aux aquariums. Isoler les hommes pour une heure ou deux dans un conteneur de SW depuis le stress de manipulation peut provoquer la ponte. Animaux guérissent le long du site de l&#39;incision et continuent de fournir des gamètes pendant plusieurs mois. </li><li> Recueillir les testicules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml avec aussi peu que possible SW et stocker sur la glace jusqu&#39;à utilisation. Magasin des testicules ne noused sur le jour du prélèvement à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Recueillir des ovaires dans une petite boîte de culture de verre dans un plusieurs millilitres de SW. Pour libérer les ovocytes à partir du tissu des ovaires, démêler le tissu avec deux paires de pinces jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne reste de gros morceaux. REMARQUE: Dans l&#39;idéal, la majorité des ovocytes sont pleinement développé. Ces ovocytes sont grands, ronds, et clair jaune ou brun clair avec une vésicule germinative distincte dans l&#39;ovocyte (figure 2A), par rapport au sous-ensemble d&#39;ovocytes sous-développés qui sont plus petits, brun, granuleux et opaque (figure 2B). Si plus de 25% des ovocytes sont de la variété développée, sélectionnez une femme différente pour obtenir des ovocytes. </li><li> Verser les ovocytes et le reste du tissu au moyen d&#39;une cuvette de filtre à mailles avec une taille de pores de 200 um et recueillir s&#39;écouler à travers. Celui-ci contiendra toutes les variétés d&#39;ovocytes mais enlever le tissu ovarien. Déloger ovocytes restants du tissu pris par le filtre par pulvérisation wvec SW à partir d&#39;un vaporisateur. Filtrer les coupes sont faites au moyen d&#39;un tube conique de 50 ml (figure 3A-A &#39;). </li><li> Verser le débit à travers l&#39;étape 1.6 par 100 um filtre à tamis tasse. Jetez les ovocytes dans l&#39;écoulement à travers. Ovocytes grandes pleinement développés qui sont prêts pour la maturation va rester sur le filtre. Rincer les ovocytes dans un récipient propre bécher de 200 ml. </li><li> Ajouter 95 ml de SW à 200 ml verre bécher d&#39;ovocytes. Ajouter 5 ml de 200 uM de 1-méthyladénine pour une concentration finale de 10 uM. </li><li> Transférer les ovocytes à un grand plat peu profond de la culture et le lieu à 15 ° C. Une grande aire de surface au volume boîte de culture permettant l&#39;échange d&#39;oxygène. Les ovocytes ne mûrissent pas ou ne peuvent pas bien se développer si elles sont surpeuplées pendant cette phase de maturation. Partagé en plusieurs plats du Sud-Ouest, plus de 10 uM 1-methlyadenine jusqu&#39;à la culture est à moins de 200 ovocytes / ml. </li><li> Autoriser les ovocytes de mûrir pour 45-90 min, mais pas plus que cela rendra les ovocytes sont incapables d&#39;être fertilized. Pour déterminer si la maturation est terminée, regardez les ovocytes sous un microscope à dissection. Les mouvements de vésicules germinales vers et fusionne avec la membrane cellulaire pendant la maturation. Il se décompose alors et n&#39;est plus visible dans les ovocytes matures (figure 2C) donc. </li></ol> 2. fécondation des ovocytes matures <ol><li> Choisissez un petit groupe de tissu testiculaire, à peu près la taille de pois, et la viande hachée dans une petite boîte de culture en verre avec environ 1 ml de SW. </li><li> Utiliser une pipette Pasteur pour transférer 2-3 gouttes de l&#39;eau de mer laiteuse résultante à environ 100 ml des ovocytes matures et agiter la boîte de culture à mélanger. Éviter de transférer des morceaux de tissu testiculaire. Évitez d&#39;ajouter une plus grande quantité de sperme, car cela pourrait entraîner des Polyspermie du faible développement ultérieur. </li><li> Après plusieurs minutes d&#39;observer les ovocytes sous un microscope à dissection. Les œufs fécondés, ou zygotes, ont une enveloppe de fertilisation, qui est une bulle transparente qui se lève au large de la cell membrane (figure 2D). REMARQUE: Ne pas procéder à la culture si moins de 90% des œufs féconder puisque les taux de fécondation pauvres sont une indication d&#39;une culture malsaine qui peut aussi ne pas bien se développer. </li><li> Après la fécondation est terminée, modifiez le SW sur les zygotes en versant à travers un filtre de maille de 100 um et de rinçage dans une boîte de culture avec SW frais. Il est important d&#39;enlever l&#39;excès de sperme pour éviter la privation d&#39;oxygène. Placer la boîte de culture à 15 ° C pendant 15 à 30 min. </li></ol> 3.-De gélifiant et d&#39;aviron des ovocytes fécondés <ol><li> Préparer des plats d&#39;injection en prenant le couvercle d&#39;une boîte de Pétri de 60 x 15 mm de polystyrène. <ol><li> Tracez une ligne permanente de marqueur sur le dos de la boîte, autour de la zone qui correspond au champ de vue sur le microscope de la micro-injection. Cela garantit que tous les embryons sont ramé dans le champ de vision du microscope. </li><li> Utiliser une pipette Pasteur en verre pour marquer une ligne à travers le cercle, preferably sur un côté du cercle (figure 3B). Utilisez cette ligne plus tard à casser les aiguilles d&#39;injection (étape 4.5). NOTE: Les réactifs couramment utilisés pour respecter les embryons d&#39;oursins, par exemple, le sulfate de protamine ou poly-L lysine, sont inutiles. De-gelée P. zygotes miniata collent très bien au plastique non. Notez qu&#39;ils ne collent pas bien à plats en verre. </li></ol></li><li> Ajouter environ 10 ml SW à chaque plat de sorte que la surface est couverte, mais l&#39;eau ne sera pas éclabousser de façon excessive dans le plat, car cela pourrait perturber embryons Rama. </li><li> Retirez le P. manteau zygote miniata de gelée avec SW acide avant l&#39;aviron. Cette couche de gelée est plus étendu que celui observé pour les espèces d&#39;oursins de mer modèle. <ol><li> Préparer l&#39;acide SW dans la gamme de pH 4,0-4,2. Le pH est essentielle pour permettre l&#39;élimination efficace de la couche de gelée tout en permettant un développement normal. </li><li> Ajouter quelques gouttes uniques de 1 N (1 M) HCl dans SW à 1 L stocks de SW. Permettre à chaque goutte de mélanger complètementet contrôler le pH avant d&#39;ajouter plus d&#39;HCl. REMARQUE: Une à plusieurs ml de résultats HCl de pH approprié, mais ne pas ajouter la totalité du volume à la fois. NOTE: Préparer HCl 1 N dans une hotte avec SW et 12 N (12 M) HCl. </li><li> Retirer SW sur zygotes en les versant sur un filtre de maille de 100 um. Rincer dans un bécher de 200 ml dans la plus petite quantité de SW possible (environ 10 ml). Remplir le bécher de 150 ml avec SW acide (pH 4,0) et permettent les zygotes de s&#39;asseoir dans le sud-ouest de l&#39;acide pendant 3 min. </li></ol></li><li> Bande de revêtement de gelée des zygotes en versant, dans les deux sens entre deux béchers de 200 ml, à chaque fois le passage des zygotes à travers un filtre de maille de 200 um. Verser les zygotes à travers le filtre autour 5-10x plus sur une fenêtre de temps de 2 min. </li><li> Retirer SW acide en versant les zygotes sur un filtre de maille de 100 um. Rincer les zygotes dans une petite boîte de culture en verre avec SW. Zygotes de-gelée peuvent s&#39;en tenir à des plats en plastique. embryons de rang immédiatement; ils commencent à produire plus jmanteau elly qui conduit à une mauvaise adhérence à des plats en plastique dans le temps. </li><li> Utilisez une bouche pipette (figure 3C-C &#39;) pour ramasser les zygotes de la boîte de culture de verre et les placer dans les lignes droites sur les plats d&#39;injection. Faire fondre le centre du côté mince d&#39;une pipette Pasteur à la flamme jusqu&#39;à ce que le verre est mou. Rapidement tirer les extrémités du verre en dehors de produire une très fine bande de verre. Une fois le verre est cool, rompre le petit bout de la pipette Pasteur (pour plus d&#39;informations sur la préparation d&#39;une pipette de bouche voir Wessel et al., 2004 17 ou Sweet et al., 2004 18). <ol><li> Faire une pipette à rames tel que le diamètre est juste plus grand que le diamètre des embryons de sorte que seulement un seul zygote va entrer et sortir de la pipette à la fois. Cela permettra à une seule ligne à la forme. Pipettes de plus petit diamètre peuvent dépouiller l&#39;enveloppe de fertilisation et de perturber les zygotes que P. zygotes miniata n&#39;ont pas de membrane hyaline une sont assez doux. </li><li> Si les zygotes ne collent pas à la boîte de plastique, gardez-les pour plus de temps dans le sud ouest de l&#39;acide (jusqu&#39;à plusieurs minutes). Alternativement, une pipette de plus petit diamètre peut aider à enlever couche de gelée pour permettre les zygotes de coller plus efficacement. </li><li> Les zygotes sont légèrement flottabilité positive et ont tendance à flotter ou planer juste au-dessus du fond du plat. Dans ce cas, la position de la pipette de telle sorte que les rames zygotes sont pressées en douceur sur la surface du plat à leur sortie de la pipette (figure 3D). REMARQUE:. C&#39;est permis de monter le nombre de lignes sur ces plats P. membranes embryonnaires miniata ne deviennent pas plus difficile à pénétrer au fil du temps et par conséquent on peut injecter des centaines de zygotes sur un plat unique. </li></ol></li></ol> 4. injection de zygotes <ol><li> Préparer des solutions d&#39;injection avec des concentrations appropriées d&#39;oligonucléotides antisens morpholino (MASO), ARNm, ou ADN dans une concentration finalentration de KCl 200 mM. 400-800 uM MASO et 2,5 ng / pl d&#39;ADN ont tendance à produire des phénotypes morphant tout en minimisant la toxicité. La concentration finale dans l&#39;oeuf 1/125 ème sera la concentration de départ 14. Pour les solutions injectables contenant Masos, de la chaleur à 65 ° C pendant 5 min immédiatement avant d&#39;utiliser et de stocker à la température ambiante. <ol><li> Pour la facilité de tri embryons injectés, ajouter rhodamine dextrane traceur à la solution d&#39;injection pour obtenir une concentration de 0,1%. </li></ol></li><li> Préparer des aiguilles d&#39;injection en tirant un tube capillaire en verre (1,0 mm de diamètre extérieur x 0,75 mm ID, longueur de 100 mm) à une aiguille de traction instrument selon les instructions du fabricant. Aiguilles convenant à l&#39;injection dans les oursins travaillent aussi bien pour les étoiles de mer, afin d&#39;utiliser les mêmes paramètres 19. </li><li> Veuillez environ 2 ul de solution d&#39;injection dans une aiguille d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette microloader. </li><li> Insérez le bout de l&#39;aiguille dans la manipulator. Réglez Picospritzer à 100 ms impulsion et une pression d&#39;air de 40 psi. </li><li> Placer un plat d&#39;embryons ramé sur la platine du microscope et ont tous les embryons dans le champ de vue. Orienter l&#39;antenne de telle sorte que la ligne de prédécoupe se trouve du côté le plus proche de l&#39;aiguille. Positionner l&#39;aiguille à un angle d&#39;environ 60 ° de sorte que la pointe se trouve à proximité du centre de la ligne et juste au-dessus de la surface de l&#39;eau. </li><li> Concentrez-vous sur la ligne pointillée et abaisser l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce que la pointe est au point. Abaissez la pointe un peu plus et de le briser ouvert en exécutant doucement dans les crêtes de la ligne pointillée. Soulever le nez hors de la surface du plat et le placer au sommet de la première rangée de zygotes et se concentrer sur les zygotes. </li><li> Abaissez la pointe de telle sorte qu&#39;il empaler le centre de zygote provenant de partout dans un angle de 60 °. L&#39;aiguille pénètre facilement P. zygotes miniata. Appuyez sur la pédale au pied (ou d&#39;autres moyens de forçage de la matière de l&#39;aiguille d&#39;injection) pour introduire un bolus d&#39;injesolution ction dans l&#39;embryon. </li><li> Objectif pour un bolus qui est de 20 à 30% du diamètre de l&#39;embryon, ou entre 25 et 80 pl. Si le bolus est plus grande ou plus petite que cela, ajuster la durée de l&#39;injection sur la Picospritzer et injecter la prochaine embryon. Continuer à ajuster la durée pour obtenir la taille souhaitée de bolus. Commencez à 100 msec. Re-casser l&#39;aiguille si elle est supérieure à 200 ms est nécessaire d&#39;introduire le bol approprié. Jetez l&#39;aiguille et de préparer un nouveau si moins de 15-20 ms est nécessaire pour obtenir cette taille de bolus que la taille de l&#39;aiguille est trop grande et peut perturber le développement normal. </li><li> Passez à injecter les zygotes restants sur le plat d&#39;injection. Les embryons peuvent être facilement injecté jusqu&#39;à ce clivage commence et en blastomères simples après la première division. Soulever périodiquement l&#39;aiguille au-dessus de la surface de l&#39;eau pour éliminer les zygotes qui se collent sur l&#39;aiguille. Si nécessaire ré-briser la pointe de l&#39;aiguille ou de charger une nouvelle aiguille si un blocage se produit. </li></ol><ol><li> Autoriser les embryons de se développer à 15 ° C dans le sud ouest. Maintenir une surface spécifique élevée de volume dans les cultures de permettre l&#39;échange d&#39;oxygène. Assurez embryons ne sont pas bondé; garder cultures égal ou inférieur à 200 embryons / ml. Selon le stade souhaité de l&#39;embryon, prévoir de recueillir les embryons injectés aux alentours de 20-24 heures après la fécondation. NOTE: C&#39;est souvent le moment idéal pour trier et collecter et parce que les embryons se développent normalement se distinguent facilement morphologiquement, mais ne sont pas encore nager. </li><li> Si les embryons sont éclos, saler légèrement choc pour empêcher la natation. Ajouter 200 ul de 5 M de NaCl à 10 ml de SW dans le plat d&#39;injection tout en remuant doucement la SW. Après quelques minutes, les embryons tomberont au fond de la boîte. Ces informations et de les déplacer à la salinité SW normale. </li><li> Recueillir embryons injectés sous une source de lumière fluorescente approprié compatible avec le traceur utilisé dans le INJECTIsur la solution. Si aucun traceur a été utilisé, sorte d&#39;embryons de sélectionner pour une morphologie normale. </li><li> Avec une pipette bouche, tirer fluorescent embryons avec une quantité minimale de SW et de faire sauter les dans une petite boîte de culture rempli de SW. Pipettes de bouche idéales ont une ouverture suffisamment grande pour les embryons d&#39;être tiré et sortir sans les endommager, mais pas si grand que les embryons non désirés et SW étrangère sont également tirés vers le haut. </li><li> Une fois que tous les embryons désirés ont été recueillies dans le nouveau plat, observer les embryons sous la lumière fluorescente et supprimer tous les embryons de l&#39;ONU à injection ou des embryons peu développés. </li><li> Culture triée embryons à étapes désirées dans un incubateur et procéder à l&#39;imagerie ou d&#39;autres protocoles souhaités. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré par les auteurs.

Il ya deux étapes essentielles qui sont difficiles pour les utilisateurs novices de cette technique mais qui sont essentielles pour réussir à créer des embryons morphant. Le premier est la sélection des ovocytes sains qui viendront à échéance et fertiliser correctement. Le pourcentage d&#39;évolution normale dans une culture dépend de la saison, de la santé de l&#39;animal, et le nombre de fois que les ovocytes ont été récoltées à partir d&#39;un seul individu. Les ovocytes ont tendance à être de meill...

L&#39;étoile de mer, Patiria miniata, (communément appelé l&#39;étoile de chauve-souris) est en train de devenir un système de modèle intéressant et polyvalent pour une variété de cellules 1 à 3, de développement de 4,5, l&#39;évolution de 6 à 8, et des études écologiques 9- 11. Adulte P. miniata sont répartis le long de la côte pacifique de Sitka, en Alaska à Baja, en Californie et 12 sont facilement maintenu dans les aquariums marins. Les ovocytes sont ronds obtenus l&#39;année et chaque femelle peut perdre des dizaines de milliers d&#39;œufs. Les ovocytes sont facilement maturation et fécondés à l&#39;extérieur 13. Les embryons obtenus sont transparents permettant une observation facile; ils se développent de façon synchrone, et n&#39;ont besoin que d&#39;eau de mer pour le développement. Assemblage du génome entier et plusieurs transcriptomes sont également disponibles pour P. miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Ces avantages font la solution idéale pour un éventail de rechercheset à des fins d&#39;enseignement. Au cours des dernières années, P. miniata est devenu un système de modèle pour le réseau de régulation de gènes du développement des analyses du 14 au 16. Le but de ces études est d&#39;identifier l&#39;ensemble compliment de gènes régulateurs et de déterminer le réseau de leurs interactions. Une grande partie de ce travail implique l&#39;expression des gènes perturbation par l&#39;introduction d&#39;oligonucléotides antisens ou en ARNm synthétisé in vitro. En outre, les analyses réglementaires cis sont utilisés pour caractériser la fonction de l&#39;ADN réglementaire 15. Ces analyses nécessitent l&#39;introduction de réactifs de perturbation et / ou de l&#39;ADN reporter construit dans des embryons. En outre, afin de caractériser les effets en aval de ces perturbations, il faut doser de nombreux embryons pour les changements dans l&#39;expression du gène de cibles potentielles. Les techniques de micro-injection de plusieurs centaines de zygotes sont au centre de ce travail. Échinodermes, y compris P. miniata </em&gt;, nécessitent plusieurs mois pour atteindre la maturité sexuelle. De ce fait, il n&#39;est généralement pas pratique pour développer et maintenir des lignées transgéniques de ces animaux d&#39;expérimentation. Par conséquent, la reproduction des adultes transgéniques ne peut pas efficacement créer des embryons modifiés. Au lieu de cela, la perturbation doit se produire de novo à travers la micro-injection. Microinjection offre la possibilité de modifier les embryons avec des réactifs qui ne sont pas des cellules perméables. Le protocole suivant décrit un procédé pour introduire de l&#39;ADN, de l&#39;ARNm, des traceurs de cellules, et des oligonucleotides morpholino antisens dans des centaines d&#39;oeufs fécondés dans une séance 2-3 h à travers la micro-injection. Ce produit suffisamment de matériau pour une série d&#39;expériences en aval, y compris, mais sans s&#39;y limiter, qPCR, hybridation in situ, l&#39;ARN-Seq, et un transfert de Western en.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Échinodermes ont longtemps été un système de modèle de prédilection pour les études de reproduction et le développement, et plus récemment pour l&#39;étude de la régulation des gènes et de l&#39;évolution des processus de développement. L&#39;étoile de mer, Patiria miniata, gagne prévalence comme un système modèle pour ces types d&#39;études qui ont déjà été effectuées presque exclusivement dans les oursins, Strongylocentrotus purpuratus et Lytechinus variegatus. Un avantage de ces systèmes de modèles est la facilité de produire des embryons modifiés dans laquelle un gène donné est vers le haut ou régulée à la baisse, le marquage d&#39;un groupe de cellules, ou l&#39;introduction d&#39;un gène rapporteur. Procédé de micro-injection unique est capable de créer une grande variété de ces embryons modifiés. Ici, nous présentons une méthode pour obtenir des gamètes à partir de P. miniata, la production de zygotes, et l&#39;introduction de réactifs perturbateurs par micro-injection. Embryons sains morphant sont ensuite isolés pour des études quantitatives et qualitatives de gefonction ne. La disponibilité de données sur le génome et du transcriptome pour cet organisme a augmenté les types d&#39;études qui sont effectuées et la facilité de leur exécution.

L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;introduire les réactifs dans des embryons. Nous démontrons l&#39;efficacité du protocole en injectant un journaliste construction d&#39;ADN qui entraîne l&#39;expression de la protéine fluorescente verte (GFP). Embryons injectés expriment la GFP dans des parcelles de clones (figure 4A-B) que l&#39;ADN incorpore lors du clivage précoce. Beaucoup de réactifs qui sont souhaitable d&#39;introduire dans les embryons sont toxiques en grande quantité et à des ...

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A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Méthodes qui produisent des embryons morphant sont indispensables pour étudier les mécanismes de développement et les réseaux de régulation génétique. L&#39;étoile de mer Patiria miniata est un système de modèle émergent de ces études. Nous présentons ici un protocole pour obtenir des gamètes, la production de cultures d&#39;embryons, et la micro-injection rapide de zygotes de cette espèce.

Une méthode pour micro-injection de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K vues.  Carnegie Mellon University.  Méthodes qui produisent des embryons morphant sont indispensables pour étudier les mécanismes de développement et les réseaux de régulation génétique. L'étoile de mer Patiria miniata est un système de modèle émergent de ces études. Nous présentons ici un protocole pour obtenir des gamètes, la production de cultures d'embryons, et la micro-injection rapide de zygotes de cette espèce. 

Vidéo: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Recherche

Biologie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Cytométrie en flux à base de purification de<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microinjection unique cellule pour l&#39;analyse cellulaire de communication

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Methods Article

Une méthode pour micro-injection de