We give special thanks to Lino Kim, Steve Guzman and Ujit Satyarthi for technical assistance during the development of this method. Myron Hawthorne, Richard Spengel, and Roberto Rojas machined the chambers used here and provided much-needed technical assistance. Notably, Roberto Rojas produced Figure 4. We are also thankful for Scott Fraser&#x2019;s invaluable advice prior to the development of the above chemotaxis assay. This work was partly supported by an NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 to MEdB and by an award from the CSU, Northridge Graduate Thesis Support Program to CW.

1. Jour 1: Isolement des tubes du tronc de neurones pour une nuit de culture sur des lamelles <ol><li> Oeufs chiches Incuber 56 h à 38 ° C. Retirer les oeufs de l&#39;incubation, les pulvériser légèrement à l&#39;éthanol 70%, puis laissez-les sécher. Casser les oeufs s&#39;ouvrent sur un plateau en verre stérilisée aux UV. </li><li> Extrait chaque embryon de son jaune d&#39;oeuf et le placer dans chiches Ringer. Pour ce faire, la première coupe autour de ses îles de sang avec des ciseaux courbes, puis, avec une pince émoussée, choisissez l&#39;embryon par sa membrane extra-embryonnaires et le placer dans une boîte de Pétri stérile en plastique contenant une solution de Ringer chiches. </li><li> Isoler le tronc de chaque embryon par le parage des membranes extra-embryonnaires l&#39;excédent ainsi que crânienne, vagal, et sacrée niveaux axiaux à l&#39;aide d&#39;une aiguille de tungstène (Fig. 1). D&#39;abord, sélectionnez environ 9 embryons qui sont entre les stades HH15-17 11. Pour les stades HH15 et plus, les axes cerveau et du cerveau postérieur forment un angle aigu et donc la tête semble incliner caudalement. Astade de HH17, le bourgeon caudal est présent et s&#39;incline face ventrale, mais ne contient pas encore somites. Avec une aiguille de tungstène, coupez les membranes extra-embryonnaires à environ 2 mm de l&#39;embryon et de couper toute les tissus embryonnaires antérieure à somite 10. Également supprimer tous les tissus embryonnaires à partir de caudale autour de la cinquième plus somite nouvellement formé. </li><li> Placez les troncs isolés embryonnaire dans dispase (0,24 U / ml de DMEM) et les incuber pendant 1 h 15 min à 37 ° C et 5% de CO 2. Une fois les troncs d&#39;incubation commence, commencer à préparer six lamelles (CS) pour des explants NT culture (01/05 au 01/08 étapes). </li><li> Rincez 6 CS d&#39;éthanol à 70% (dilué dans de l&#39;eau stérile ultrapure), puis laissez-les sécher. L&#39;utilisation d&#39;un marqueur de laboratoire, dessiner un cercle au centre de chaque CS qui est d&#39;environ 1 cm de diamètre (ce cercle va vous aider à identifier plus tard, où une couche de fibronectine a été appliqué). Sur la même face de chaque CS, écrire le mot «être» (ou tout autre mot ou asymétrique de forme) en dehors du cercle tracé (ce qui aidera à yous déterminer si le côté marqué du CS est orientée vers le haut ou vers le bas). </li><li> Placez chaque CS dans un 40 x 10 séparés plat mm stérile avec la surface marquée vers le bas et permettre le plat de s&#39;asseoir ouverte sous un lampe UV germicide pendant 10 min. </li><li> Appliquer 60 fibronectine ul (FN, 10 pg / ml DMEM) à la surface banalisée de la CS, tout en veillant toute la zone au sein du cercle de 1 cm est recouvert. Placez les plats à incuber à 37 ° C pendant 30 min puis aspirer délicatement la fibronectine de chaque CS. </li><li> Ajouter 250 ul &quot;culture&quot; moyen [DMEM avec L-glutamine (2 mM), pénicilline (100U/ml), streptomycine (100 mcg / ml), et 8% de sérum bovin fœtal (FBS)] pour la zone FN-enduite le CS. Placez les boîtes contenant chacune CS à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu&#39;à ce que le SNRC ont été isolés. </li><li> Transfert de tous les troncs d&#39;embryons incubés à un plat de 5 cm en verre de Pétri contenant du milieu L15 et commencer à disséquer chaque NT à l&#39;aide de pinces fines et une aiguille de tungstène (Fig. 1). Carefully tranche le long de la frontière de la NT et les somites avec une aiguille de tungstène forte tout en étant prudents de ne pas endommager le NT. Il est souvent plus facile de commencer à isoler chaque NT à partir de l&#39;extrémité caudale-la plupart du tronc. </li><li> Sélectionnez 6 de la plus longue et la plus droite NTs à la culture durant la nuit (SNRC entre environ 8 et 15 somites longues sont recommandées). En utilisant une pointe de micropipette apprêtée avec un milieu de culture, le transfert de chacune des 6 nuits à ses propres préalablement préparé CS (de 1,5 à 1,8 étapes). Soyez sûr que le NT ne reste flottant à la surface. Si le NT est flottant, au goutte à goutte milieu sur lui jusqu&#39;à ce qu&#39;il coule à l&#39;aide d&#39;une micropipette. </li><li> Placez chaque plat à 37 ° C et CO 2 5% durant la nuit. Soyez prudent de s&#39;assurer que chaque NT est dans la zone FN enduits de ses respectives CS immédiatement avant de placer le plat dans l&#39;incubateur (en utilisant le cercle tracé à l&#39;étape 1.5 comme référence). Une micropipette peut être utilisé afin de mieux ajuster la position de chaque NT si nécessaire. </li><li> Place àau moins 2 ml de milieu de culture (sans sérum) dans un tube à centrifuger stériles de 15 ml et incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. Laissez le bouchon légèrement dévissé pour permettre le pH du milieu pour ajuster la nuit. Pré-incuber le milieu est importante pour aider à prévenir la formation de bulles dans votre chambre, ce qui peut perturber l&#39;établissement d&#39;un gradient moléculaire. Ces «pré-incubées&quot; milieu doit être utilisé dans toutes les étapes futures. Lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé, ce milieu doit être en incubation à 37 ° C. </li></ol> 2. Jour 2: Chargement de la chambre modifiés Zigmond et time-lapse d&#39;analyse de la migration cellulaire <ol><li> Sur les 6 nuits en culture, sélectionnez les 3 cultures mieux adaptées à l&#39;analyse. Généralement, les cultures de la CCN qui ont au moins un long bord droit doit être sélectionné (figure 2A). Les 3 meilleures cultures seront utilisés pour charger et film 3 chambres modifiés Zigmond toute la journée, chacun avec un traitement différent. Sur les trois cultures, choisissez l&#39;une des loading la première chambre et remet les autres dans l&#39;incubateur pour une utilisation ultérieure. </li><li> En utilisant un coton-tige, appliquez une fine couche de gelée de pétrole entourant les réservoirs et le pont d&#39;une seule chambre modifiés Zigmond. </li><li> Avec une aiguille de tungstène, retirez délicatement le NT à partir de la CS, tout en laissant le CNC entourant attaché à la surface de la CS. Marquer le plat avec un stylo à retenir l&#39;orientation des droites bord de la culture de la CCN. </li><li> Placez quelques gouttes de milieu préincubées sur le pont. Ramassez la CS avec une pince fine, tamponnez le bord de la CS contre un Kimwipe pour enlever la plupart du milieu de culture ancienne, puis placez immédiatement le CS sur la chambre modifiés Zigmond sorte que le bord droit de la culture d&#39;être filmé est centré sur la longueur du pont et à peu près perpendiculaire à la frontière du pont-réservoir (Fig. 2A, B). </li><li> En utilisant un microscope inversé, déplacer la frontière droite de la CCN pour être sur le côté du pont le plus proche de ee réservoir qui contiendra les chemotactant suspectée (figure 2B; pour les contrôles de cela correspondra à réservoir est chargé selon seconde). En outre, plus finement aligner le bord droit de la culture à être perpendiculaire à la frontière du pont-réservoir. </li><li> Soigneusement, mais solidement appuyer sur le CS en la gelée de pétrole présents sur la chambre Zigmond, en s&#39;assurant qu&#39;il est complètement étanche à la chambre, puis placez pétroliers supplémentaires de gelée le long du bord de la CS pour mieux garantir qu&#39;il sera hermétique. Beaux-ajuster l&#39;angle de la frontière de la CCN à nouveau pour corriger tout mouvement pendant le processus d&#39;étanchéité. </li><li> Charger le réservoir qui ne contient pas le chemotactant soupçonnés première (figure 2B). Le faire par le chargement d&#39;une seringue de 1 ml (25 G x 1,5 po aiguille attachée) avec environ 300 moyennes préincubées ul et injecter le support dans le réservoir jusqu&#39;à complet (tout en faisant attention de ne pas générer de bulles dans le réservoir). Branchez le réservoir sur les deux côtés avec un suffmontant icient de gelée de pétrole avant de charger le réservoir suivant. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.7, sauf que cette fois en utilisant un milieu contenant du préincubées chemotactant candidat. Il est essentiel lors de la génération d&#39;un gradient moléculaire à travers la culture de toujours charger le réservoir contenant la molécule à tester après le chargement du réservoir manque la molécule testée. </li><li> Placez la chambre chargée Zigmond à 37 ° C à incuber pendant 1 h avant le tournage. Image les plus droites frontières de la culture de la CCN pour 3 h à 90 s intervalles tout en incubation à environ 37 ° C (Fig. 2A, B). Avant de créer n&#39;importe quel film, assurez-vous d&#39;aligner la caméra de sorte que le bord des images d&#39;être obtenus sont alignés avec et toucher le bord du pont qui borde le dernier réservoir chargé (Fig. 2B, panneau supérieur; zone en pointillés représente idéale position pour l&#39;imagerie). Cela facilitera plus tard, un logiciel d&#39;analyse par la standardisation de la directionnalité du gradient moléculaire appliquée et thélectronique à distance à partir du réservoir filmé dans chaque film produit. </li><li> Pour les contrôles, répétez les étapes 2.2 à 2.9 pour chacune des deux cultures de la CCN d&#39;autres sélectionnés (à l&#39;étape 2.1), mais remplir chaque réservoir avec un milieu approprié. Pour un type de contrôle de remplir les deux réservoirs de moyenne préincubées ne contenant pas la molécule à tester. Pour un traitement de contrôle de second, le premier le pont avec quelques gouttes de milieu préincubées contenant le chemotactant suspectée avant de monter le CS. Ensuite, chargez les deux réservoirs avec le même milieu contenant le chemotactant suspectée. </li><li> Utilisez ImageJ (NIH) suivi manuel <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / ij / plugins / piste / track.html)</a> et le chimiotactisme et la Migration Tool v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(www.ibidi.de / applications / ap_chemo.html)</a> plugins pour suivre la migration des CNC périphérique le long de la frontière droite de la culture jUST imagé et d&#39;analyser les différents paramètres des trajectoires migratoires obtenus (Fig. 2B-C). </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Un échantillon de trajectoires de cellules à partir d&#39;un film où le tronc de nombreux CNC ont été sensibles à un facteur chimiotactique candidat en utilisant la technique ci-dessus est montré (Fig. 2D). La plupart des cellules dans cet exemple d&#39;une réponse positive affiché un net mouvement jusqu&#39;à le gradient chimiotactique (comme indiqué en rouge). Données de trajectoire peut être utilisé pour analyser d&#39;autres propriétés de la migration des cellules aussi bien. Afin d&#39;évaluer visuellement un gradient appliqué dans une chambre modifiés Zigmond, une Alexa Fluor 488 IgM conjugué (MW ~ 900 kDa) a été chargé dans le second réservoir d&#39;une chambre modifiés Zigmond (à environ 40 pg / ml H 2 O). Un gradient a été établi par 1 h et encore un peu présent après 26 h, mais fortement diminuée par 50 h (fig. 3). Si la molécule à tester est plus petit, alors le gradient appliquée wiLL se dégradent plus vite que ce qui est montré. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" /> Figure 1. Explantation du tronc au niveau du SNRC pour la culture de la nuit sur ​​la fibronectine revêtement des lamelles. Parce que le tronc CNC se décoller de la dorsale NT situé à côté de somites 8-28, ce segment de la NT est isolée par microdissection et cultivées pendant une nuit sur un CS fibronectine revêtement pour permettre l&#39;émigration des CNC à partir de l&#39;explant NT. NTs isolés qui sont entre 8-15 somites long et relativement droites sont les mieux adaptées pour la culture du jour au lendemain comme ils ont tendance à donner plus aux cultures CCN frontières droites. Régions du tube neural qui donnent lieu à d&#39;autres neurones niveaux de crête axiale sont présentés dans une police plus petite. s, somites. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" /> Figure 2. Méthode d&#39;évaluation de la migration des CNC tronc explantésen utilisant une chambre modifiés Zigmond. (A) Allongée tronc cultures CCN sont préparés par mise en culture de nuit de NTS et résultante des cultures de la CCN avec au moins une longue frontière droite sont sélectionnés pour l&#39;expérimentation. La plus longue frontière droite d&#39;une culture choisie est alors positionné perpendiculairement à la frontière du pont-réservoir, et donc parallèle au vecteur du gradient de l&#39;avenir appliqué. (B) Après le beau-ajustement de la position de la culture de la CCN sur la chambre Zigmond et d&#39;étanchéité la lamelle de la chambre, la chambre est chargée. Lors du test de chimiotactisme, le réservoir qui ne contient pas le chemotactant suspectée (-) est chargé en premier et scellé. Ensuite, l&#39;autre réservoir est chargé avec la chemotactant suspectée (+) et scellé. CNC périphérique long de la frontière préalablement sélectionnés peuvent ensuite être visualisés et suivis en utilisant le plugin Manuel de suivi pour ImageJ (panneau inférieur). (C) de nombreuses caractéristiques migratoires en réponsele gradient appliqué peut être évaluée à partir des données de suivi. Par exemple, un indice de chimiotactisme peut être calculée en divisant le déplacement d&#39;une cellule le long de l&#39;axe x par la distance totale qu&#39;il a migré. (D) Un exemple d&#39;une réponse intéressante est représentée par une parcelle de trajectoire cellule initialement générées par le chimiotactisme et la migration Outil pour le plugin ImageJ. Le point de départ de chaque trajectoire est fixé à l&#39;origine (0,0). Notez combien de cellules migrent vers le centre source.The chimiotactique de la masse de toutes les cellules à leur position finale (croix bleue; toutes les cellules pondération égale) est aussi proche de la source chimiotactique. CNC, les cellules de la crête neurale, pistes rouges, les cellules qui ont migré vers le réservoir chargé avec un chimioattractive soupçonné; pistes noires, les cellules qui ont migré loin; (+), une concentration plus élevée chemotactant; (-), concentration inférieure chemotactant. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" /> <strong&gt; Figure 3. profils d&#39;intensité à travers le pont d&#39;une chambre modifiés Zigmond à différents moments après l&#39;ajout d&#39;un Alexa Fluor 488 conjugué IgM. La chambre a été chargé d&#39;une manière semblable à celle décrite dans le protocole avec les principales exceptions que l&#39;eau préincubé (au lieu de moyennes préincubées) a été utilisé pour diluer l&#39;anticorps à 40 pg / ml, et de petites poches d&#39;air ont été présentes aux extrémités du pont (loin de la tranche où les profils d&#39;intensité prises ci-dessus où). Au départ, aucun gradient était présent dans la plupart des ponts. Par une pente ha a été créé et est resté présent à travers à 26 h. En 50 h la présence de la pente était incompatible à différents domaines de la passerelle, et lorsqu&#39;il est présent, la raideur de la pente a été grandement diminuée. Tous les profils ont été générés à partir d&#39;un morceau identique sur le pont (d&#39;un pont-réservoir frontière à l&#39;autre) en utilisant le logiciel AxioVision 4.6. Notez que même lorsque l&#39;airpoches étaient présents, le gradient n&#39;a pas été perturbé. Haute, de haute intensité; faible, de faible intensité; axe des x, distance à travers toute la largeur du pont (2 mm); (+), d&#39;un réservoir chargé de l&#39;Alexa Fluor 488 conjugué IgM; (-), le réservoir n&#39;est pas chargé avec le conjugué. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" /> Figure 4. Zigmond modification des spécifications de chambre. Montré est un diagramme de la chambre modifiés Zigmond utilisé ici avec son cahier des dimensions (± 0,2 mm). Les mesures peuvent être modérément ajustées afin de correspondre à des préférences individuelles. Protocole complémentaire: Fabrication d&#39;une Chambre de modification Zigmond S&#39;il vous plaît se référer à la figure 4 comme une référence pour le protocole ci-dessous: <ol><li> Achat d&#39;une feuille de 3 / 16 &quot;polies acryliques épais (4,45 mm d&#39;épaisseur réelle). </li><li> En utilisant une scie circulaire, couper les blancs de chambre surdimensionné pour l&#39;dimensions approximatives de 33,25 mm x 64,57 mm. Cela permet à 3,175 mm matériels supplémentaires pour l&#39;usinage. </li><li> Réglez la vierge de chambre sur un étau. Avec une fraiseuse et un 6,35 mm (1 / 4 &quot;) bit fraise en bout, la finition d&#39;usinage sur les côtés de la chambre de leurs dimensions exactes: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Position de la chambre de vide sur la machine de fraisage et de localiser le centre de la vierge le long des axes x et y avec un palpeur, puis à zéro l&#39;emplacement du centre. </li><li> Acquérir la hauteur de chambre (axe z) en touchant le petit moulin à terme à la surface supérieure et zéro de la hauteur. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un mm 3,91 (0,154 &quot;) bit fraise en bout, de compenser les bits 3,03 mm le long de l&#39;axe des x (sens positif) pour le premier réservoir. Commencez d&#39;usinage dans la chambre à une profondeur de 2,84 mm tout en se déplaçant le long de l&#39;axe y (sens positif) à 7,62 mm (0,300 &quot;), puis traverser à 7,62 mm (0,300&quot;) dans le sens opposé (négatif) en direction d&#39;un réservoir complet longueur de 15,24 mm (0,600 &quot;). Offsetle bit à 3,03 mm (0,119 &quot;) le long de l&#39;axe x (sens négatif) et répétez le même processus pour le deuxième réservoir. </li><li> Position de la chambre sur son bord et percer un trou avec un 1,09 mm (0,043 po) foret sur la fin de chaque réservoir (4 au total) qui relie l&#39;extrémité du réservoir sur le côté de la chambre pour le chargement de support lors de l&#39;expérimentation. </li><li> Faire tremper la chambre bien dans l&#39;eau chaude savonneuse pour aider à éliminer tous les contaminants chimiques. </li><li> Trempez et rincez la chambre bien à l&#39;eau bidistillée pour enlever tout le savon. Les chambres sont maintenant prêts à utiliser comme décrit ci-dessus. </li></ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Conducting chemotaxis research on trunk NCCs has proven challenging for a series of reasons. Trunk NCCs constitute a heterogeneous stem cell population that will differentiate if cultured long-term; therefore, trunk NCCs must be obtained from primary explantation of the trunk-level NT. Conventional methods to study the chemotactic response of homogenously distributed cell populations in vitro are difficult to test on trunk NCCs since they first require that cells are isolated and homogenously replated in ...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>DM-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>PS-20</td>
			<td>100X Stock Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>GS-60</td>
			<td>100X Stock Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>Lot# 105247 (or another that is comparable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Zigmond chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Reservoir volume: ~ 160 &mu;l ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Denville</td>
			<td>T6040</td>
			<td>40 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td>10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td>Precleaned; 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30525.02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Comforts</td>
			<td>011110794642</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>10-9152</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>4Z0-850</td>
			<td>10X Stock Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309602</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td>25 G x 1.5 in.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-IgM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21042</td>
			<td>Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>Misc.</td>
			<td>Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Home made; placed in a pin holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt Forceps</td>
			<td>Tiemann</td>
			<td>160-18</td>
			<td>Used for transferring embryos to Ringer's from egg yolk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
<ol>
	<li>Purchase a sheet of 3/16" thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).</li>
	<li>Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.</li>
	<li>Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4") end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.</li>
	<li>Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.</li>
	<li>Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.</li>
	<li>Using a 3.91 mm (0.154") end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300") and then traverse to 7.62 mm (0.300") in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600"). Offset the bit to 3.03 mm (0.119") along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.</li>
	<li>Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.</li>
	<li>Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.</li>
	<li>Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.</li>
</ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Cellules de la crête neurale (CCN) sont une population de passage de cellules présentes dans le développement des vertébrés qui émigrent à partir du tube neural dorsal (NT) après avoir subi une 1,2 transition épithélio-mésenchymateuses. Après EMT, CNC migrer de grandes distances le long des voies stéréotypés jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent leurs objectifs. CNC se différencier en un vaste éventail de types de cellules, y compris les neurones, cellules gliales, les mélanocytes et les cellules chromaffines 1-3. La capacité du CNC à atteindre et à reconnaître leurs emplacements cible appropriée est fondamentale pour la formation appropriée de toutes les structures contenant le tronc de la CCN composants dérivés 3. Élucider les mécanismes d&#39;orientation pour le tronc de la CCN de migration a donc été un sujet de grande importance. Plusieurs molécules ont été démontrés pour guider la CCN migrations 4. Par exemple, les CNC du tronc sont connus pour être repoussés par des signaux de guidage négatifs tels que Semaphorin, Ephrine et les ligands fente 5-8. Cependant, ne pasjusqu&#39;à récemment toute chimiotactiques du CNC du tronc été identifiés 9. Conventionnel dans les approches in vitro pour étudier le comportement chimiotactique de cellules adhérentes mieux travailler avec immortalisé, de façon homogène les cellules distribuées, mais sont plus difficiles à appliquer à certaines cultures primaires de cellules souches qui n&#39;ont pas d&#39;abord une distribution homogène et rapide de différencier (comme CNC). Une approche pour homogénéiser la répartition de la CNE du tronc pour les études de chimiotactisme est d&#39;isoler les CNC du tronc de l&#39;enseignement primaire des cultures d&#39;explants NT, puis soulevez et replate qu&#39;ils soient près de 100% de confluence. Cependant, cette approche nécessite plaquage des quantités substantielles de temps et d&#39;effort pour explant suffisamment de cellules, est rude, et distribue des CCN du tronc d&#39;une manière différente à celle trouvée dans des conditions in vivo. Nous rapportons ici une approche in vitro, qui est en mesure d&#39;évaluer la chimiotaxie et d&#39;autres réponses migratoires des CNC tronc sans requirindistribution de ga cellulaire homogène. Cette technique utilise imagerie time-lapse du primaire, imperturbable CNC tronc intérieur d&#39;une chambre modifiés Zigmond (une chambre standard de Zigmond est décrit ailleurs 10). En exposant CNC tronc à la périphérie de la culture à un gradient de chemotactant qui est perpendiculaire à leur directivité naturelle prédit, des altérations de la polarité migratoires induits par le gradient chemotactant appliquée peut être détecté. Cette technique est peu coûteuse, nécessite la mise en culture d&#39;explants NT seulement deux pour le traitement de reproduire, de levage évite de cellules dures (telles que la trypsine), laisse les CNC malle dans une distribution plus semblable à des conditions in vivo, réduit la quantité de temps entre l&#39;explantation et l&#39;expérimentation (ce qui réduit probablement le risque de différenciation), et permet time-lapse d&#39;évaluation des caractéristiques de nombreux migrateurs.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

Analyse de la migration cellulaire Tronc Crête neurale en utilisant une modification Zigmond Chambre Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

analysis-trunk-neural-crest-cell-migration-using-modified-zigmond

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K vues.  California State University, Northridge. An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

Vidéo: Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Recherche

Neurosciences

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Établir embryonnaires de la souris culture de cellules souches neurales utilisant le test Neurosphère

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Formant Colonie dosage cellulaire: Un test pour distinguer Bona Fide Cellules souches neuronales à partir de cellules progénitrices neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Analyse de la migration des crêtes neurales et la différenciation par la Croix-espèces transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l&#39;enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-analyse de la structure du cerveau et son fonctionnement en utilisant l&#39;IRMf et imagerie de diffusion

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Un test galvanotaxie pour l&#39;analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l&#39;extérieur électrique à courant continu

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...