Ce travail a été financé par des bourses personnelles par le Wellcome Trust à Beate Kampmann (056608, GRO77273).

1. Préparation de stock BCG journaliste Lux mycobactéries <ol><li> Cultivez le BCG lux (M. bovis BCG Montréal souche transformée avec le plasmide navette pSMT1) avec agitation à 200rpm à la mi-logarithmique de phase dans le bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2% de glycérol, 0,05% tween 80 et 10% d&#39;enrichissement ADC. </li><li> Préparer 1 ml d&#39;une dilution 1:10 de BCG Lux culture dans du PBS stérile dans un tube à luminomètre (900μl de PBS + 100 ul BCG Lux culture), en double exemplaire. </li><li> Chargez le tube contenant du N-décyle aldéhyde (substrat de l&#39;enzyme luciférase) sur le dos de la machine et s&#39;assurer que le couvercle est sécurisé et les tubes en place. </li><li> Premier luminomètre injecteur avec substrat par l&#39;intermédiaire du programme Prime, mis à injecter 100 UCL x 3 dans chacun des trois tubes vides d&#39;amorçage placés dans le luminomètre. </li><li> Chargez les 2 tubes dans le luminomètre et prendre des lectures à travers un programme fixé à l&#39;injection de 100 UCL de substrat dans chaque tube et lire pendant 20 sec dans des intervalles de 1 sec. </li><li> Lorsque le stock a atteint 1x10 8 RLU / ml à 2x10 8 RLU / ml (cela prend environ 3-4 jours de croissance), ajouter un volume égal de glycérol 30% stérile à la culture dans un tube 50ml Falcon et mélanger délicatement. </li><li> Aliquoter 1.5ml volumes dans 2ml étiquetés à bouchon à vis microtube et stocker à -80 ° C. </li></ol> 2. Déterminer des stocks RLU / UFC de corrélation et le contenu des aliquotes <ol><li> Ajouter 15 ml de milieu Middlebrook 7H9 la culture avec supplément ADC 10% à un erlenmeyer 200ml avec un bouchon à évent. </li><li> Ajouter 15μl d&#39;hygromycine et 30μl de Tween 20%. </li><li> Retirer un flacon de BCG Lux du congélateur et décongeler à température ambiante (TA) dans l&#39;armoire de sécurité. Ajouter le contenu du flacon sur le support et serrer le bouchon. </li><li> Incuber sous agitation à 200rpm à 37 ° C pendant 4 jours. </li><li> Chaque jour, maquillage série 10 dilutions (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 et 1:100.000) pour la détermination UFC. </li><li> Mettre en place les mêmes dilutions en parallèle et en double pour déterminer la luminescence (voir partie 1.2 à 1.6). </li><li> Préparer deux plaques à 3 compartiments de Middlebrook 7H11 agar (1 l de milieu liquide contenant du glycérol 0,5%, 10% de supplément OADC, 1 ml de Tween 20% et 1 ml d&#39;hygromycine). </li><li> Plaque à 100 ul de chaque dilution sur un segment de chaque plaque à l&#39;aide épandeurs séparée, en distribuant le liquide de manière égale entre la chambre individuelle. </li><li> Sceau de chaque plaque avec du parafilm, placer dans un sac en plastique stérile, sceller avec du ruban autoclave, et incuber à 37 ° C pendant 2 semaines avec des couvercles vers le bas. </li><li> Inspectez régulièrement jusqu&#39;à UFC apparaissent (2-3 semaines). </li><li> Pour compter les colonies, enlever les plaques de l&#39;incubateur et le placer sur un compteur de colonies. Calculer la moyenne pour chaque dilution des plaques en double. </li><li> Calculer le rapport RLU / UFC aide équivalente RLU et UFC pour chaque dilution. Le ratio devrait se situer entre 3 et 5 RLU / UFC. </li></ol> 3. Préparation du BCG Lux culture pour l&#39;inoculation dans le sang total <ol><li> Ajouter 15 ml de milieu Middlebrook 7H9 la culture avec supplément ADC 10% à un erlenmeyer 200ml avec un bouchon à évent. </li><li> Ajouter 15μl d&#39;hygromycine et 30μl de Tween 20%. </li><li> Retirer un flacon de BCG Lux du congélateur et décongeler à température ambiante dans l&#39;enceinte de sécurité. Ajouter le contenu du flacon sur le support et serrer le bouchon. </li><li> Incuber sous agitation à 200rpm à 37 ° C pendant 2 à 4 jours. </li><li> Préparer 1 ml d&#39;une dilution 1:10 de BCG Lux culture dans du PBS stérile dans un tube à luminomètre (900μl de PBS + 100 ul BCG Lux culture), en double exemplaire. </li><li> Luminomètre premier avec le substrat (comme décrit ci-dessus), agiter doucement au vortex les 2 tubes et charger dans le luminomètre et prendre des lectures (comme décrit ci-dessus). </li><li> Utilisez cette lecture afin de diluer le bas de la culture dans du PBS pour donner un équivalent de 7x10 6 RLU (cela donne un inoculum d&#39;environ 2x10 5 UFC / ml de sang et un ratio de BCG pour les monocytes d&#39;environ 1:1, en ​​supposant un nombre de monocytes du A propos de 2x10 5 à 4x10 5 monocytes par ml de sang). </li></ol> 4. Préparation de sang total <ol><li> Prendre 3 à 5 ml de sang veineux dans un tube contenant de l&#39;héparine sans conservateur. </li><li> Transfert du sang dans un tube de 50ml Falcon et diluer avec un volume égal de milieu RPMI 1640 contenant HEPES glutamine et 25 mm (sans stylet / STREP). </li><li> 900μl aliquote de sang diluée dans des tubes en triple Bijou stérile pour chaque point dans le temps (6 tubes au total: 3. 0hrs pour et 3 pour 96h Mettre en place des tubes supplémentaires pour timepoints supplémentaires, si nécessaire. </li><li> 900μl de milieu Aliquoter Middlebrooks la culture 7H9 avec 10% ADC complément hygromycine + 50μg/ml (le même milieu que celui utilisé pour la culture du BCG lux) en double pour les contrôles de croissance. </li><li> Ajouter 100 pi de l&#39;diluée BCG lux à chaque tube de sang, et à la lutte contre une croissance de 2tubes. </li><li> Mélangez bien et placez les 3 bijous pour le 96h de temps-point et les deux contrôles de la croissance de leur côté dans l&#39;incubateur à bascule à 37 ° C, 20 tr / min (CO 2 n&#39;est pas nécessaire). </li></ol> 5. Luminescence de mesure (à 0 HEURES et 96h) <ol><li> Centrifuger les trois bijous à 2000g pendant 10 min. </li><li> Retirez délicatement 300μl de surnageant sans perturber le culot et le placer dans 2ml bouchon à vis Microtubes à geler à -80 ° C pour l&#39;analyse des cytokines suivantes. </li><li> Ajouter 300μl de PBS dans chaque bijou pour remplacer le volume de surnageant retiré. </li><li> Aspirer le contenu de chaque bijou dans le tube 50ml Falcon correspondante et ajouter 8ml eau distillée à chaque tube. Commencez une minuterie de 10 min. NB: Ceci est une étape sensible au temps, et cette incubation ne doit pas être une de plus de 10 min, à partir de quand les cellules entrent les premiers en contact avec l&#39;eau. </li><li> Rincer chaque bijou avec 2 ml d&#39;eau distillée et vortex pendant 5 secondes avant de basculer dans le tube correspondant faucon. </li><li> A la fin de l&#39;incubation de 10 minutes, centrifuger les tubes Falcon à 2000g pendant 10 minutes. </li><li> Décanter le surnageant en désinfectant Surfanios. </li><li> Ajouter quelques perles de verre à chaque boulette et le vortex. </li><li> Ajouter 1ml de PBS stérile dans chaque tube et le vortex. </li><li> Dans les tubes luminomètre, faire des dilutions de 1:10 pour chaque échantillon en double avec du PBS (PBS 900μl échantillon + 100 ul) et au temps de 96h-point. Faire les dilutions de même pour chacun des contrôles de croissance. </li><li> Vortexer doucement les tubes et les charger dans le luminomètre et prendre des lectures (comme décrit ci-dessus) Nb: Lectures entre les triplets de l&#39;échantillon devrait être la même dans les 15% d&#39;une autre. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Il est important d&#39;utiliser des bactéries en phase logarithmique de croissance pour l&#39;ensemble des dosages sanguins lux, soit augmenté au cours 48-72 heures avant l&#39;inoculation des échantillons, que l&#39;activité métabolique n&#39;est pas optimale si l&#39;une des droites du congélateur ou dans la phase stationnaire. La croissance préalable devrait être standardisé pour une série d&#39;expériences soit à 48 ou 72 heures pour éviter la variabilité. La figure 1 montre la courbe de croissance d&#39;une culture de représentant du BCG lux. Le temps de doublement est d&#39;environ 24 heures jusqu&#39;à la phase stationnaire est atteint. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" /> Figure 1. Courbe de croissance représentant du BCG lux pendant 96 heures dans un milieu 7H9 et la corrélation des RLU et UFC. Bien que les valeurs RLU toujours en corrélation avec UFC, le nombre de RLU correspond à une seule UFC peut varier en fonction du stock, ce qui explique pourquoi il est recommandé d&#39;utiliser le même stock congelé à travers une série d&#39;expériences afin de garantir une multiplicité cohérente de l&#39;infection ( MOI). Le tableau 1 montre un exemple de date brute au moment de l&#39;inoculation (T 0) et à 96 heures. Les ratios de croissance sont calculés selon la formule T 96 / T 0, mais d&#39;autres intervalles de temps peuvent bien sûr également être mesurée. Il est toutefois conseillé de ne pas utiliser les cultures au-delà de 96 heures, comme la mort cellulaire significative survient. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" /> Tableau 1. Exemple de données brutes au moment de l&#39;inoculation (T0) et à 96 heures (T96) et des ratios de croissance calculé à partir de 3 donneurs adultes. Selon les réponses spécifiques de l&#39;antigène de la mémoire disponible et compter peut-être aussi des neutrophiles, des ratios de croissance varient selon les individus, comme montré ici dans la figure 2 dans le sang des enfants avec et sans infection par le VIH. En moyenne, les jeunes enfants ont des ratios de croissance plus élevés que les adultes, le test cutané à la tuberculine (TCT) + les individus ont des ratios avez de croissance inférieur à TST-ve individus, et les patients infectés ont des ratios de croissance élevé en raison de la carence de la population de lymphocytes T CD4, l&#39;un des médiateurs clés de la réponse immunitaire cellulaire aux mycobactéries. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" /> Figure 2 Inter-bailleurs variabilité:. Ratios de croissance de T 0 versus 96 heures pour un ensemble de patients, selon le statut VIH sous-jacente. La reproductibilité des ratios de croissance sur une période de temps est montré dans la figure 3, qui résume les résultats de 64 donateurs saigné deux fois sur une période de 12 mois et d&#39;un seul donneur saigné à plusieurs reprises pour des expériences de contrôle. Les causes potentielles de la variabilité pourrait être des changements dans la sensibilisation à mycobactéries ou de la variabilité dans les niveaux de cytokines hôte, comme observé dans les essais biologiques de nombreuses. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" /> Figure 3. (A) seul donateur à 12 reprises en 12 mois. (B) plusieurs (64) les bailleurs de fonds à 2 reprises sur 12 mois.

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	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. 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H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont bien implantés dans des modèles animaux, où ils sont appliqués à l&#39;écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l&#39;immunogénicité. La première génération de tests bactéricides humains ont été conçus en utilisant les macrophages seul, infectés par M. tubercu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Aucun chat </td></tr><tr><td> BCG Lux </td><td> Divers </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11 Agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Le bouillon Middlebrook 7H9 </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC enrichissement </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC complément </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-décyle aldéhyde </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> PBS stérile </td><td> Dans Maison </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 avec L-Glutamine, HEPES 25mM </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée stérile </td><td> Dans Maison </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Équipement </td></tr><tr><td> Luminomètre Tube (port injectable obligatoire) </td><td> Berthold LB953 AutoLumat ou mono-tube de luminomètre Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminomètre tubes, 12 x 75mm, pyrex sans monture </td><td> Corning de VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer avec bouchon ventilé, stérile en polycarbonate 250ml </td><td> Corning via Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer tubes de prélèvement sanguin (sans conservateur héparine) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ml tubes Falcon, conique </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin spécimen de polypropylène Bijou tubes </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin universelle des conteneurs (30 ml) </td><td> Laboratoire d&#39;analyse LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Les perles de verre de 2mm de diamètre </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml pipettes et garçon pipette </td><td> toute </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl et 200 pl Pipettes et pointes à filtre </td><td> toute </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Général du matériel de laboratoire: </td></tr><tr><td> Classe II de sécurité du cabinet du cabinet </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Réfrigérateur (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rocking agitateur plateforme (180 0) à mélanger des tubes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitateur incubateur réglé à 37 ° C pour grandir cultures bactériennes </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

Tests fonctionnels ont longtemps joué un rôle clé dans la mesure de l&#39;immunogénicité d&#39;un vaccin donné. Ceci est classiquement exprimée que le sérum des titres bactéricides. Etudes de sérum titres bactéricides en réponse aux vaccins infantiles ont permis de développer et valider de coupure niveaux pour des réponses immunitaires protectrices et de tels seuils sont utilisés en routine. Pas de tels dosages ont été prises vers l&#39;avant dans l&#39;évaluation de routine des vaccins qui induisent surtout immunité à médiation cellulaire sous la forme de réponses des lymphocytes T effecteurs, tels que les vaccins contre la tuberculose. Dans le modèle animal, la performance d&#39;un candidat vaccin donné est systématiquement évaluée dans des essais standardisés bactéricides, et tous les courants roman TB-vaccins candidats ont été soumis à cette étape dans leur évaluation préalable à la phase 1 des essais humains. L&#39;évaluation de l&#39;immunogénicité et donc la probabilité de l&#39;efficacité protectrice du roman de vaccins anti-tuberculeux devraient idéalement subir une similaires par étapes d&#39;évaluation dans les modèles humains aujourd&#39;hui, y compris des mesures dans les essais bactéricides. Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont déjà bien établies dans les modèles animaux, où ils sont appliqués à l&#39;écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l&#39;immunogénicité. Cependant, aucune de tels dosages ont été incorporées dans les essais cliniques pour de nouveaux vaccins anti-tuberculeux à ce jour. Bien qu&#39;il reste encore une incertitude sur les mécanismes exacts qui conduisent à la mort de mycobactéries dans les macrophages humains, l&#39;interaction des macrophages et des cellules T avec des mycobactéries est clairement nécessaire. L&#39;essai décrit dans ce document représente une nouvelle génération de dosages bactéricides qui permet des études sur ces principaux composants cellulaires avec tous les autres facteurs cellulaires et humorales présents dans le sang total, sans faire des hypothèses sur leur contribution individuelle relative. Le dosage décrit par notre groupe utilise de faibles volumes de sang total et a déjà été employée dans les études sur les adultes et les enfants dans les paramètres de la tuberculose est endémique. Nous avons montré l&#39;immunogénicité du vaccin BCG, l&#39;augmentation de la croissance des mycobactéries dans les patients séropositifs, ainsi que l&#39;effet de la thérapie anti-rétrovirale et la vitamine D sur la survie des mycobactéries in vitro. Nous résumons ici la méthodologie, et de présenter nos données de reproductibilité en utilisant ce modèle relativement simple, peu coûteuse et conviviale sur le terrain. Remarque: Définitions / Abréviations BCG lux = M. bovis BCG, la souche de Montréal, transformé avec pSMT1 plasmide navette transportant les gènes luxAB de Vibrio harveyi, sous le contrôle de l&#39;origine mycobactérienne GroEL (hsp60) promoteur. Unité UFC = Colony Forming (une mesure de la viabilité à mycobactéries).

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Nous décrivons une approche alternative à l&#39;énumération des mycobactéries<em&gt; In vitro</em&gt;, Qui utilise reporter-gènes marqués mycobactéries au lieu d&#39;unités formant colonie (UFC). «Survie» des organismes ainsi que réponse de l&#39;hôte-marqueurs sont mesurés simultanément, offrant un faible coût, un système polyvalent et fonctionnel pour les études de l&#39;hôte / pathogène interactions dans le contexte de la tuberculose.

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

a-functional-whole-blood-assay-to-measure-viability-mycobacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

13.8K vues.  Imperial College London. Nous décrivons une approche alternative à l'énumération des mycobactéries In vitro, Qui utilise reporter-gènes marqués mycobactéries au lieu d'unités formant colonie (UFC). «Survie» des organismes ainsi que réponse de l'hôte-marqueurs sont mesurés simultanément, offrant un faible coût, un système polyvalent et fonctionnel pour les études de l'hôte / pathogène interactions dans le contexte de la tuberculose.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

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Immunologie et infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

Énumération des principales populations de leucocytes périphériques sanguins pour essais cliniques multicentriques en utilisant un test de sang total Phénotypage

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Protégé antigènes fonctionnels globules rouges par la membrane greffage de compacts Polyglycérols hyperbranchés

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilisation de l&#39;Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Une cytométrie en flux simple méthode pour mesurer l&#39;absorption du glucose et de glucose Expression Transporter pour monocytes dans les sous-populations de sang total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Test ELISpot interféron-gamma optimisé à mesure les réponses des cellules T dans le modèle cobaye après Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...