Les auteurs tiennent à remercier Laurence Cooper, Harjeet Singh, et Lenka Hurton pour leur travail dans la création des premières K562 AAPC et mIL21 vecteurs de fusion. Le financement de ce travail a été fourni par le Programme UT MD Anderson Physician scientifique, la Fondation Saint-Baldrick, et les légendes de Friendswood.

1. Isolation des PBMC de Buffy Coat Cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont obtenues par centrifugation sur la densité de flottaison Ficoll-Paque d&#39;échantillons de donneurs sains couche leuco-dérivé par cytaphérèse. <ol><li> La centrifugation Ficoll-Paque est faite selon le protocole du fabricant avec des modifications mineures. </li><li> Ajouter PBS pour un donneur normal-banque de sang buffy coat à un volume final de 140 ml (typique du volume buffy coat est de 40-70 ml). </li><li> Couche 35 ml d&#39;échantillon sur la couche leuco-15 ml de Ficoll-Paque (4 tubes). </li><li> Centrifuger à 400g pendant 20 minutes sans frein. </li><li> Récupérer les PBMC du Ficoll-Paque: interface plasma, ne jetez pas les globules rouges au bas de l&#39;Ficoll-Paque. </li><li> Lavez PBMC trois fois avec PBS, centrifugation à chaque fois à 400g pendant 10 minutes. </li><li> PBMC peuvent être utilisés directement pour l&#39;expansion des cellules NK à ce stade ou les cellules NK peuvent être isolées par RosetteSep (section 4) </li><li> PBMC restantes peuvent être congelés dans FBS contenant 10% de DMSO dans l&#39;azote liquide. </li><li> Aspirer le Ficoll et de recueillir les globules rouges de l&#39;étape 5 en deux 50 ml tube de centrifugeuse, laver trois fois avec du PBS (ajouté à 50 ml marque), chaque fois aspirer le surnageant écrémage au sommet de la couche de RBC pour enlever les granulocytes. </li><li> Les globules rouges peuvent être utilisées immédiatement pour RosetteSep  purification des cellules NK (se référer à la section 4) ou stockées dans un volume égal de solution d&#39;Alsever à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (Les globules rouges peuvent être enregistrer pour un maximum de 4 semaines). </li></ol> 2. L&#39;expansion des cellules NK L&#39;expansion des cellules NK peuvent être initiées en utilisant PBMC ou cellules NK purifiées. Le montant des PBMC utilisé pour l&#39;expansion peut être modifiée en fonction de la quantité de cellules NK souhaité à la fin d&#39;une expansion de trois semaines, se référer à des résultats représentatifs pour les détails. (Voir Note 1) STIMULATION 1 Jour 0 <ol><li> Pour chaque 6 5x10 PBMC d&#39;être élargi, de comptage et d&#39;irradier 10x10 6 K562 CL9 mIL21 l&#39;aide d&#39;un irradiateur gamma à 100 Gy. </li><li> Post-irradiation, laver les cellules avec du PBS et remettre en suspension dans l&#39;expansion des cellules NK médias (Nkem). </li><li> Graine 5x10 6 PBMC par 10x10 6 irradiés K562 CL9 mIL21 (1:2) dans 40 ml de Nkem dans un flacon T75 et le placer en position verticale dans une étuve à 37 ° C et CO 2 5%. </li></ol> Jours 3 et 5 <ol start="4"><li> Récupérer les cellules par centrifugation à 400g pendant 5 minutes et remplacer la moitié des médias avec Nkem frais (ajouter IL2 frais pour l&#39;ensemble du volume des médias) et continuer la culture. </li></ol> STIMULATION 2 Jour 7 <ol><li> Comptez le nombre de cellules en culture, à la fin d&#39;une semaine. </li><li> Mettez de côté 5x10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2) </li><li> Pour chaque 6 5x10 cellules pour être restimulées, compter et irradient 5x10 6 K562 CL9 mIL21 l&#39;aide d&#39;un irradiateur gamma à 100 Gy. </li><li> Ajouter un nombre égal de irradié K562 CL9 mIL21 (1:1) et remettre en suspension dans Nkem au 2.5x10 5 cellules totales / ml (voir note 3). </li><li> Semences dans les cellules flacons T75 (maximum 50 ml par flacon). </li></ol> Jours 10 et 12 <ol start="6"><li> Comptez le nombre de cellules. </li><li> Changer ensemble des médias avec les Nkem frais basé sur le nombre de cellules (voir note 3). </li></ol> Jour 14 <ol start="8"><li> A la fin de deux semaines de l&#39;expansion de compter le nombre de cellules en culture. </li><li> Mettez de côté 5x10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2) </li><li> Si l&#39;expansion a commencé à partir de PBMC les cellules NK peuvent être purifiées à ce stade de l&#39;expansion en utilisant le protocole de purification RosetteSep (se référer à la section IV). Si l&#39;expansion a commencé à partir de cellules NK purifiées procéder à une stimulation 3. </li><li> Après purification mis de côté 5x10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux pour vérifier la pureté des cellules NK (comme dans l&#39;étape 8). </li><li> Procéder à la stimulation 3 en utilisant l&#39;ensemble des cellules NK purifiées (voir note 4). </li></ol> STIMULATION 3 <ol><li> Resuspendre les cellules NK avec irradiés K562 CL9 mIL21 (1:1) dans Nkem basée sur le nombre de cellules (voir note 3). </li></ol> Jours 17 et 19 <ol start="2"><li> Comptez le nombre de cellules. </li><li> Changer médias avec Nkem frais se basant sur le nombre de cellules (voir note 3). </li></ol> Jour 21 <ol start="4"><li> Au bout de trois semaines de l&#39;expansion de compter le nombre de cellules en culture. </li><li> Récupérer 1x10 6 cellules pour une analyse de cytométrie en flux pour le panneau de cellules NK pleine d&#39;anticorps phénotypage (voir tableau 1). </li><li> Gel dans les cellules SVF contenant du DMSO 10% à une densité maximum de 5x10 7 cellules par flacon pour une utilisation future. </li></ol> 3. Assay NK cytotoxicité cellulaire <ol><li> Décongelez un flacon de cellules NK et les semences dans Nkem, un jour avant performing test de cytotoxicité pour permettre la récupération. </li><li> Pour chaque test de cytotoxicité des cellules NK en utilisant une ligne seule cible cellulaire, 6x10 5 cellules NK et 3x10 5 cellules cibles sont nécessaires (voir note 5). </li><li> Préparer CAM-Media en diluant calcéine-AM (stock 1 mg / ml dans le DMSO) dans Nkem (voir note 6). </li><li> Resuspendre 10 6 cellules cibles dans 1 ml de CAM-médias (voir note 7). </li><li> Incuber pendant 1 h à 37 ° C, avec agitation occasionnelle. </li><li> Resuspendre les cellules NK au 1x10 6 cellules / ml et ajouter 200uL de suspension de cellules NK à chacun des 3 puits d&#39;un U-96 puits à fond plat à 10 correspondants: 1 rapport E: T de la figure 1. (Voir note 8) </li><li> Ajouter 100 ul de milieu complet à tous les puits restants à l&#39;exception des &quot;maximum&quot;. </li><li> Ajouter 100 ul de 2% de Triton X-100 à &quot;maximum&quot;. </li><li> Effectuer des dilutions en série des cellules NK pour le E 5 ultérieurs: les ratios T en transférant 100 ul de cellules à chaque fois, bien mélanger. Jeter 100ul du dernier puits (rapport E: T de 0.3125:1). </li><li> Après 1 heure de chargement calcéine, laver les cellules cibles dans Nkem deux fois, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. (Voir note 9) </li><li> Re-compter les cellules cibles et remettre à 1x10 5 cellules / ml. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules cibles dans chaque puits (1x10 4 / puits). Centrifuger 1 min à 100g à initier un contact cellulaire. </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 4 heures. </li><li> Mélanger délicatement la culture par pipetage avec un pipetteur 100 pL afin d&#39;uniforme suspendre la calcéine libérée, ralentit plaque à 100g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules et transférer 100 ul du surnageant d&#39;une nouvelle plaque en prenant soin d&#39;éviter les bulles. Pop les bulles qui peuvent se former en utilisant une aiguille fine. </li><li> Lire la plaque à l&#39;aide d&#39;un lecteur de plaque fluorescente (filtre d&#39;excitation 485 nm, filtre d&#39;émission 530 nm). Lire Bas est recommandée. </li><li> Calculer pourcentage de lyse spécifique en fonction de la formule [(version version-test de spontanée) / (libération maximale - libération spontanée)] x 100. </li></ol> 4. Purification des cellules NK par RosetteSep <ol><li> Prenez 100 fois plus de globules rouges à celui des PBMC ou des cellules élargi, dans un tube de 50 ml (100:1 RBC: PBMC). </li><li> Si vous utilisez les globules rouges fraîches procéder directement à l&#39;étape suivante ou si les globules rouges ont été entreposés dans une solution d&#39;Alsever s, compter le nombre de globules rouges et de lavage approprié (100 excès de pli) quantité de globules rouges avec du PBS supplémenté avec 2% de FBS à trois reprises, la centrifugation à 1200 rpm pendant 10 minutes chaque fois. </li><li> Combinez les globules rouges avec des PBMC de l&#39;étape 1.7 ou cellules élargi de l&#39;étape 2.10 en PBS + 2% de FBS à un volume final de 1 mL par 5x10 7 cellules de PBMC ou élargi. </li><li> Ajouter 1 microlitre d&#39;RosetteSep  Cocktail homme NK enrichissement cellulaire par 1x10 6 cellules de PBMC ou élargi. </li><li> Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 20 minutes avec mélange en douceur toutes les 5 minutes. </li><li> Ajouter un volume égal de PBS + 2% SVF mélangez délicatement et la couche sur le dessus du Ficoll-Paque. </li><li> Répétez les étapes de centrifugation sur Ficoll-Paque décrit pour l&#39;isolement des PBMC (Section I). </li><li> Compter les cellules NK récupéré après purification et mis de côté 5x105 cellules pour phenotpying par cytométrie en flux pour la pureté des cellules NK (étape 8). </li></ol> 5. Remarques NOTE 1. Cellules NK peut être étendu directement à partir de PBMC, ou à partir de cellules RosetteSep  NK purifiées. Nous avons noté l&#39;efficacité expansion similaire, mais certains donateurs peuvent avoir très faible nombre de cellules NK dans la purification résultant difficulté par RosetteSep avant l&#39;expansion. NOTE 2. Nous utilisons régulièrement CD56-FITC, CD16-PE, et CD3-PE-Cy5 pour le phénotypage pendant l&#39;expansion, énumérant les cellules NK comme ceux qui sont CD3-CD16-négatives et ou CD56-positives. NOTE 3. A chaque changement de support ou de stimulation, remettre les cellules à 2,5 x 10 5 / ml pour maintenir le nombre de cellules PBMC / NK à ou moins de 2 millions par ml à des stades de pointe de l&#39;expansion. Cela permettra d&#39;éviter l&#39;épuisement des nutriments et aider à réaliser l&#39;expansion maximale et de survie. NOTE 4. Le taux d&#39;expansion NK est dépendante des donateurs et à la fin des stimulations 1 ou 2 une partie des cellules peuvent être congelées et une partie encore élargi en fonction de la nécessité d&#39;expérimentation. Nous avons eu un bon succès dans l&#39;utilisation des cellules congelées pour des extensions à une date ultérieure. NOTE 5. Afin de permettre à l&#39;erreur, nous vous recommandons d&#39;utiliser un minimum de 7x10 5 cellules NK remis en suspension dans 700 ULS du Nkem et 4x10 5 calcéine-AM cellules cibles teinté remis en suspension dans 4 ml de Nkem de mise en place du test de cytotoxicité. Si vous utilisez pipette multicanaux pour l&#39;ensemencement des cellules cibles des volumes plus élevés de cellules (jusqu&#39;à 6x10 5 à 6 ml) peuvent être nécessaires en fonction de la taille du bassin de média utilisé. Aussi le nombre des cellules NK sont recommandées spécifiquement pour le E: T ratios montrent dans le protocole, pour l&#39;utilisation de plus E: T ratios augmententle nombre des cellules NK par mL en conséquence (par exemple pour un e 40:1: 4x10 T utilisent ratio de 6 cellules / ml) NOTE 6. Nous vous recommandons d&#39;effectuer au préalable calcéine-AM de chargement de titrage pour la lignée cellulaire cible de choix, en utilisant les dilutions suivantes de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 et 1:100 pour obtenir la différence entre la libération optimale maximale et spontanée. NOTE 7. Lorsque vous utilisez une ligne de cellules adhérentes comme cible, d&#39;abord préparer la suspension cellulaire unique à l&#39;aide non-enzymatique des cellules tampon de dissociation. Si vous effectuez l&#39;ADCC, de préparer un tube double de cellules cibles dans CAM-médias. NOTE 8 Si vous effectuez l&#39;ADCC, ajouter mêmes cellules NK à 3 puits correspondant à 10h01 E:. T pour l&#39;ADCC. Répétez l&#39;opération pour les bailleurs de fonds supplémentaires. Répétez l&#39;opération pour les cellules cibles supplémentaires. NOTE 9. Si vous effectuez une expérience ADCC, après 45 minutes de chargement calcéine, ajouter 10ug d&#39;anticorps spécifiques pour induire l&#39;ADCC contre les cellules cibles. Après 15 minutes de plus, se laver les cellules cibles dans un milieu complet à deux reprises, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. Resuspendre les cellules à 1x10 5 cellules / ml et procéder à l&#39;étape suivante dans le protocole. 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Lorsque l&#39;expansion est réalisée selon le schéma décrit ci-dessus, en utilisant 5x106 PBMC comme matériau de départ, typiques des cellules NK large rendements de 1x10 9 au 10 oct cellules (variabilité dépendante des donateurs). La figure montre l&#39;expansion des cellules NK fois (n = 19) par rapport aux cellules NK présentes dans le produit original (médiane + / - quartile). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Les cellules NK expriment élargi différents récepteurs des cellules NK qui sont comparables à la non expansées primaires des cellules NK à quelques exceptions près (CD11b, CD160 et CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Récupération PBMC de Buffy manteau est dépendante des donateurs et peut aller de 6 à 300x10 800x10 6. Les cellules NK peuvent comporter de 2% - 18% des PBMC. Pour la purification des cellules RosetteSep élargi, la récupération des cellules NK pures au jour 14 varie de 40-70%. En suivant le protocole recommandé d&#39;expansion et de la purification, la pureté des cellules NK de 99% peut être attendue. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Élargi les cellules NK ont démontré une cytotoxicité contre une gamme de lignées cellulaires tumorales, y compris le neuroblastome, le LAM, l&#39;ostéosarcome et le mélanome (représentant AML tuant montré que la lyse pour cent spécifiques).

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L&#39;expansion des cellules NK et des médias d&#39;activation (Nkem) <ul><li> 90% du RPMI 1640 (Cellgro) </li><li> 10% sérum de veau fœtal (Gibco) </li><li> 1x pénicilline / streptomycine (Cellgro) </li><li> 1x L-glutamine (Gibco) <ul><li> Stériliser par filtration des médias avant l&#39;utilisation. </li></ul></li><li> 50 U / ml d&#39;IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) <ul><li> - Dilué à partir d&#39;un 200 UI / ul stock. Ajouter IL2 à la quantité désirée de médias juste avant l&#39;utilisation à chaque fois. </li></ul></li></ul> Isolement cellulaire PBMC et NK <ul><li> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li> Alsever solution (Sigma) </li><li> RosetteSep homme NK Cocktail enrichissement cellulaire (StemCell Technologies) </li></ul> Assay NK cytotoxicité cellulaire <ul><li> Calcéine-AM (Invitrogen) <ul><li> Solution stock est à 1 mg / ml, magasin de surgelés en 50 aliquotes. Dissoudre dans les médias pour atteindre Nkem dilution voulue pour la coloration des cellules. </li></ul></li></ul> Anticorps La liste des anticorps utilisés pour le phénotypage de cellules NK sont énumérés dans le tableau ci-dessous; <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Anticorps </td><td> Volume par test </td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Tube 1 </td><td valign="top"> Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tube 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tube 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D Systems Miltenyi Biotec R &amp; D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tube 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tube 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tube 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC Tampon FACS Volume total </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

Natural killer (NK) jouent un rôle important dans la surveillance immunitaire contre une variété de microorganismes infectieux et les tumeurs. La disponibilité limitée des cellules NK et capacité à développer in vitro, a restreint le développement de l&#39;immunothérapie des cellules NK. Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement de grandes quantités de cellules in vivo NK fonctionnelles ex K562 en utilisant des cellules exprimant membranaires IL21, comme une artificielle cellule présentatrice d&#39;antigène (VAMP). Thérapies des cellules NK adoptive à ce jour ont utilisé un produit cellulaire obtenu par l&#39;état stationnaire leucophérèse du donateur suivie par la déplétion des cellules T ou de la sélection positive des cellules NK. Le produit est généralement activé dans IL-2 pendant la nuit et ensuite administré le lendemain 1. En raison de la faible fréquence de cellules NK dans le sang périphérique, un nombre relativement restreint de cellules NK ont été livrés dans les essais cliniques. L&#39;incapacité à se propager dans les cellules NK in vitro a été le facteur limitant pour générer des nombres de cellules suffisant pour les résultats cliniques optimaux. Certains d&#39;expansion des cellules NK (5-10 fois plus 1-2 semaines) a être atteint par de fortes doses d&#39;IL-2 seul 2. L&#39;activation des cellules T autologues peuvent arbitrer l&#39;expansion des cellules NK, probablement aussi par la libération de cytokine local 3. Soutien à stroma mésenchymateux ou des cellules antigènes artificiels présentant (VAMP) peut soutenir l&#39;expansion des cellules NK à la fois du sang périphérique et le sang du cordon 4. Combiné NKp46 et l&#39;activation par des anticorps CD2 billes recouvertes soit actuellement commercialisé pour l&#39;expansion des cellules NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), entraînant une dilatation environ 100 fois en 21 jours. Des essais cliniques utilisant VAMP-expansé ou activées par les cellules NK sont en cours, l&#39;un utilisant la lignée cellulaire leucémique CTV-1 aux cellules NK et d&#39;activer le Premier 5 sans expansion significative. Un deuxième essai utilise EBV LCL pour l&#39;expansion des cellules NK, la réalisation d&#39;une expansion dire 490 fois en 21 jours 6. La troisième utilise une VAMP K562 basé transduites avec 4-1BBL (CD137L) et membranaires de l&#39;IL-15 (mIL-15) 7, qui a réalisé une expansion signifie NK 277 fois en 21 jours. Bien que, les cellules NK étendu en utilisant K562-41BBL-mIL15 VAMP sont hautement cytotoxique in vitro et in vivo par rapport aux non expansées cellules NK, et de participer à l&#39;ADCC, leur prolifération est limitée par la sénescence attribués à 8 raccourcissement des télomères. Plus récemment une expansion de 350 fois des cellules NK a été rapportée en utilisant K562 exprimant MICA, 4-1BBL et IL15 9. Notre méthode de l&#39;expansion des cellules NK décrits aux présentes produit prolifération rapide de cellules NK, sans atteindre la sénescence une expansion médiane 21 000 fois en 21 jours.

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d&#39;évaluer leur fonction.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

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Immunology and Infection

47.9K vues.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d'évaluer leur fonction.

Vidéo: Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Recherche

Immunologie et infection

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

Protégé antigènes fonctionnels globules rouges par la membrane greffage de compacts Polyglycérols hyperbranchés

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l&#39;acide périodique Schiff coloration

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Évaluation de l’Interface synaptique des cellules primaires humaines T du sang périphérique et le tissu lymphoïde

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

Isolement, activation et expansion des lymphocytes T par flottation à partir d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique humain à l’aide de microbulles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Différenciation des ostéoclastes fonctionnels des monocytes CD14+ du sang périphérique humain

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...