Ce laboratoire a été financée par les Instituts canadiens de recherche en santé, en sciences naturelles et en génie du Canada et la Société canadienne de la sclérose plaques (SCSP). GSTS a été le récipiendaire du doctorat une bourse d&#39;études de la SCSP. Nous sommes reconnaissants envers le Dr Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) pour de nombreuses discussions utiles et des commentaires sur ce manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Biotium pour leur généreux don de 488 supplémentaires NucView caspase-3.

1. La décongélation et la culture de cellules <ol><li> Obtenir des stocks de produits congelés immortalisé N19-oligodendrogliales cellules de long terme stocke l&#39;azote liquide. </li><li> Plongez flacon contenant des cellules à 37 ° C l&#39;eau de bain jusqu&#39;à la suspension cellulaire est complètement dégelée. </li><li> Ajouter 7 ml de DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) avec du glucose à haute complété 10% de FBS (sérum de veau fœtal) et 1% de pénicilline / streptomycine à une plaque de 10 cm de la culture. </li><li> Ajouter la cellule en suspension goutte à goutte à la plaque, et agiter doucement et rock de la boîte de Pétri pour disperser les cellules uniformément. </li><li> Cellules en culture à 34 ° C / 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Après 4 heures, les médias aspirer à partir de plaques de supprimer tout reste du DMSO (diméthylsulfoxyde) qui avait été utilisé comme un cryoprotecteur, et remplacer par du milieu frais (7 ml de DMEM haute-glucose milieux supplémentés avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine) . </li></ol> 2. Cellules repiquage <ol><li> A 70-80%confluent (4-7 jours de croissance), aspirer les médias à partir des cellules. </li><li> Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25% à l&#39;assiette. Pipeter trypsine pour détacher les cellules (environ 5 minutes). </li><li> Faire des dilutions appropriées aux conditions expérimentales et le passage une plaque à 10 cm supplémentaires pour de futures expériences à une densité cellulaire pas moins que les 0,1 x 10 6 cellules / ml. </li></ol> Note: Vous devriez le passage de vos cellules au moins deux fois après la décongélation avant de les utiliser pour des expériences. 3. Comptage et Placage Cellules <ol><li> Pour cellules de la plaque d&#39;imagerie des cellules vivantes, trypsiniser comme décrit précédemment. </li><li> Retirez environ 30 ul de cellules et de compter en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Placer une lamelle de verre non couché dans une plaque à 6 puits. Ajouter des cellules à la même à une densité de 0,1 x 10 6 cellules / ml dans 2 ml de phénol DMEM sans grande glucose médias, supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine, à 34 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Autorisercellules à croître durant la nuit (16-20 h) à 34 ° C / 5% de CO 2 avant la transfection. </li></ol> 4. La transfection <ol><li> Combinez 100 uL du milieu sans sérum, de 0,5-4 mg ADN plasmidique purifié, et 4 pl FuGENE HD (Roche). Vortex doucement pour mélanger. </li><li> Vortex à nouveau brièvement et permettre à l&#39;ADN de complexes pendant 5 min à température ambiante, puis ajouter le mélange de l&#39;ADN FuGENE HD directement sur les cellules cultivées. Inclinez la plaque délicatement au mélange. </li><li> Culture des cellules pour une période supplémentaire de 48 heures à 34 ° C / 5% de CO 2 avant le traitement ou l&#39;expérimentation. </li></ol> 5. Cellules Préparation imagerie des cellules vivantes (LCI) <ol><li> Allumez le LCI Chamlide cellules vivantes boîte de contrôle d&#39;instruments au moins 1 h avant de vous voulez commencer votre expérience. La boîte de contrôle régule également la température et l&#39;humidité dans l&#39;Chamlide LCI, et régule le débit de la pré-mélangé à 5% de CO 2. </li></ol> Remarque: Il est conseillé deAllumez le boîtier de commande jusqu&#39;à 3 h avant les expériences commencent à s&#39;assurer que toute la scène atteint 34 ° C. Cette étape permettra de réduire la dérive focale, qui est causée par la dilatation thermique et de fluxulation de la scène métal comme il se réchauffe, lors de l&#39;imagerie. <ol start="2"><li> Travailler dans un flux hotte, vaporiser la chambre de culture Chamlide magnétiques de type, et une pince à épiler, avec 70% d&#39;éthanol et de les laisser sécher pendant 5 minutes. </li><li> Retirer les cellules de l&#39;incubateur et de confirmer qu&#39;ils sont sains. Ils devraient apparaître adhérente et bien réparties sur la lamelle de verre avec de nombreux procédés membranaires. Les cellules qui sont stressés par la transfection sont pas adaptés à l&#39;expérimentation, et aura un nombre réduit d&#39;extensions processus, et ont souvent un noyau de forme irrégulière. </li><li> Inclinez la plaque à 6 puits et enlever la lamelle avec des pincettes. Placer rapidement le côté pile lamelle jusqu&#39;à dans la plaque de fond de la chambre de culture. Ne pas laisser la lamelle de sécher. </li><li> Fixez le magnétique principalcorps de la chambre de culture et d&#39;ajouter 500 ul des médias de l&#39;original 6-même la plaque sur le dessus de la lamelle. Re-utilisation de ce média va diminuer la quantité de stress placé sur les cellules causés par les changements environnementaux, et peut également être utile pour évaluer les facteurs sécrétés extracellulaire. </li><li> Placez le couvercle de verre sur la chambre de culture. </li><li> Utilisez un Kimwipe pulvérisé avec de l&#39;éthanol à 70% pour enlever toute matière résiduelle à partir du bas de la lamelle, qui nuirait à la microscopie. </li><li> Placer la chambre de culture dans les 34 ° C / 5% de CO 2 incubateur pendant 30 min. Cette étape fera en sorte que la chambre se réchauffe à 34 ° C pour réduire le déplacement de la lamelle que le métal se réchauffe. </li></ol> 6. Réglages du microscope Les images ont été acquises ici en utilisant un microscope inversé Leica DMIRE2 avec une lentille de relais personnalisés et des logements de roue filtre d&#39;émission pour le chargement de la cartouche de roues multiples (Technologies Inc Quorum, Guelph, ON). <ol><li> Brightfield - Lampe fixé à 2,5 V et le temps d&#39;exposition à 240 ms. </li><li> Red Fluorescent Protein (RFP) - Gain fixé à 140 pour 200 ms. </li><li> Green Fluorescent Protein (GFP) - Gain fixé à 140 pour 500 ms. </li><li> Notre microscope est une lampe gradable plutôt que d&#39;un disque rotatif pour contrôler la quantité de lumière disponible pour les cellules. Nous courons nos expériences avec la lumière à 90% de l&#39;intensité maximale de la lampe. </li></ol> 7. Traitement des cellules avec inducteurs d&#39;apoptose et de NucView 488 Caspase-3 substrat <ol><li> Il est important de préparer d&#39;importants stocks d&#39;inducteurs d&#39;apoptose à l&#39;avance et les congeler dans des aliquotes, de sorte que les concentrations seront compatibles entre les expériences. </li><li> Le substrat est NucView 488 sensible à la lumière. Préparer des aliquotes de 15 uL de réduire les tubes de gel / dégel, et conserver à -20 ° C couvert de papier d&#39;aluminium. Travailler avec l&#39;éclairage ambiant de la pièce aussi bas que possible pour réduire l&#39;exposition de la NucVIEW 488 substrat à la lumière, avant son utilisation. </li><li> Récupérez la chambre de culture rapide de l&#39;incubateur afin que les cellules ne sont pas exposés à une réduction de la température. Placer la chambre de culture sur la chambre de l&#39;environnement du microscope, et utiliser des colliers pour maintenir la chambre de culture de se déplacer. A ce stade, vous devriez également tamiser les lumières ambiante. </li><li> Allumez le 5% prémélangé CO 2 en cuve avec régulateur double. </li><li> Utilisation de l&#39;objectif 10x, mise au point de trouver des cellules sur le moniteur de l&#39;ordinateur en utilisant la microscopie à champ lumineux. Remarque: vous voulez utiliser la plus grande ouverture numérique de l&#39;objectif avec le grossissement désiré de réduire le temps d&#39;exposition. </li><li> Livrer des inducteurs de l&#39;apoptose dans les cellules (dans notre cas, le potassium mM 80 ou 100 mM glutamate), l&#39;une des méthodes suivantes peuvent être utilisées. Nous allons utiliser la livraison de 80 mM de potassium comme un exemple, en utilisant du KCl dissous sous forme de concentré 10x dans nos milieux de culture typique. <ol><li> Media Exchange bperfusion lente et locales y: - Utiliser une pompe péristaltique pour échanger des médias dans la chambre de culture avec les nouveaux médias contenant 80 mM de potassium. - Une extrémité du tube se livrer 10 mL d&#39;un stock de 80 mM de potassium dissous dans du phénol DMEM sans, et l&#39;autre extrémité du tuyau va supprimer les médias de la chambre. - Tu veux au moins un échange de 10x des médias pour assurer que les médias restent dans la chambre a la bonne concentration de potassium. - Après les médias sont échangées, ajouter 3 488 ​​ul de substrat NucView aux médias dans la chambre. Pipette pour mélanger. </li><li> Outre directe de 80 mM de K + et 488 NucView substrat aux médias en chambre de culture: - Préparer une solution mère 10x de 80 mM de potassium dissous dans du phénol DMEM sans. - Ajouter 3 ul de substrat à 488 NucView 50 uL de 10x 80 de potassium mM. Pipette pour mélanger. Ajouter à 500 ul de phénol DMEM sans en chambre de culture. Remarque: cette méthode estpréférée si vous êtes intéressé à maintenir ou à évaluer la croissance ou d&#39;autres facteurs sécrétés qui peuvent être présents dans le support d&#39;origine. Nous avons constaté que les 488 NucView substrat est stable en culture de cellules pour des expériences durables aussi longtemps que 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Imagerie des cellules vivantes <ol><li> Cliquez sur le canal rouge pour afficher les cellules transfectées. </li><li> Sélectionnez et enregistrez autour d&#39;une douzaine de cadres où il ya plusieurs cellules transfectées, et sauver ces «points XY&quot;. Selon la quantité de mémoire d&#39;ordinateur, vous pouvez être limité au nombre de points d&#39;étape que vous pourrez acquérir. </li><li> Demandez aux capturer des images de microscope (en champ lumineux, le canal rouge, et le canal vert) lors de ces étapes enregistré des points de toutes les 6 minutes. </li><li> Toute coloration verte qui est visible durant les premiers stades de l&#39;expérimentation indique probablement les cellules qui sont déjà en cours de l&#39;apoptose, en raison souvent à la transfection et / ou un stress environnemental. ApoptTSO dues aux traitements expérimentaux seront détectés à une date jalon plus tard dans l&#39;expérience. </li></ol> 9. Analyse statistique <ol><li> Pour chaque expérience, nous programmons le microscope pour acquérir des points XY multiples de rassembler un vaste ensemble de données de manière efficace. Chaque expérience est réalisée en double ou en triple, et les données sont compilées à partir des expériences distinctes effectuées à des jours différents. A partir de chaque ensemble de données, nous analysons jusqu&#39;à 15 champs de vue et de comparer le ratio de la caspase-cellules négatives à la caspase-cellules positives (nombre total de cellules dans le champ de vue / nombre total de cellules positives pour la caspase-). </li><li> Les mesures enregistrées par chaque ensemble de données sont regroupées dans un ensemble plus large échantillon, et sont ensuite comparés les uns aux autres en utilisant un tableau ANOVA (p = 0,05). Nous montrons l&#39;erreur-type de la moyenne (SEM) de chaque expérience, puis de comparer la différence de moyens en effectuant un test de Tukey moyens de comparaison (p = 0,05) pour déterminer WHich traitements sont significativement différents les uns des autres. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs Nous avons décrit une expérience visant à illustrer comment le NucView 488 substrat peut indiquer une augmentation du taux d&#39;apoptose des N19-OLG cultures de cellules suivant un traitement avec une concentration en potassium extracellulaire élevé. Le N19-cellules ont été transfectées avec DP, et ont été soit traités avec 3 pi NucView 488 substrat (contrôle), ou 3 488 ​​uL NucView substrat et 80 mM de [K +] (le traitement). Les cellules ont été surveillés et les images ont été acquises sur un cours de 12 h de temps, ce qui est suffisant pour des études impliquant des insultes neurologiques (figure 1A). Dans des conditions de contrôle, nous n&#39;avons pas observé d&#39;importantes quantités de l&#39;apoptose par rapport au 80 mm [K +] cultures traitées (boîte hachés), qui a montré environ 45% de mort cellulaire après 12 h (figure 1B). Le signal de fond vert d&#39;observerD dans les conditions de contrôle indique les cellules qui sont en apoptose, sans l&#39;ajout de potassium extracellulaire. Pratiquement aucune des cellules de l&#39;apoptose présentent contrôle d&#39;expérience par le point 12 de temps h, bien que dans d&#39;autres situations les expériences peuvent être nécessaires pour fonctionner plus longtemps. Les images ont été acquises en utilisant un objectif 10x. Barre = 100 um. <img alt="Figure 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="Figure 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> Figure 1. (A) A 12 h expérimentation bien sûr le temps des cultures N19 OLG 48 h post-transfection exprimant RFP-MBP (canal rouge), avec 3 488 ​​ul de substrat NucView (canal vert). Les cultures ont été traitées soit avec une concentration finale de 80 mM de [K +] (panneaux de gauche), ou aucun traitement comme une commande (panneaux de droite). Les images ont été acquises à intervalles de 6 minutes, et l&#39;activation significative de clivage caspase-3 (signal vert) peuvent être d&#39;observerD dans les cultures traitées avec 80 mM de [K +] dans les noyaux des cellules (boîte hachés) par rapport à l&#39;expérience de contrôle. (B) Pourcentage de la caspase-3 clivée cellules (calculé en divisant le nombre total de cellules dans le champ de vision en le nombre total de cellules positives pour la caspase-). En comparaison avec le contrôle des conditions, nous avons observé autour de la mort cellulaire de 45% suivants K +-traitement par 12 h. SVidéo 1. Une expérience de 12 h cours du temps de N19-OLG cultures 48 h post-transfection exprimant RFP-MBP (canal rouge) avec 3 488 ​​ul de substrat NucView (canal vert), avec champ lumineux des images et un moyen de trois image fusionnée, après un traitement avec 80 mM de [K +]. SVidéo 2. Une expérience de 12 h cours du temps de N19-OLG cultures 48 h post-transfection exprimant RFP-MBP (canal rouge) avec 3 488 ​​ul de substrat NucView (canal vert), avec champ lumineux IMAGes et une image à trois voies ont fusionné. Aucun traitement n&#39;a été appliqué à des cultures et N19-OLGs peut être vu migrer à travers le champ de microscope en contraste avec les cultures de cellules traitées avec 80 mM de [K +] (à comparer avec SVidéo 1).

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Même si ce n&#39;est pas le seul produit disponible pour la détection fluorogénique apoptose, il ya plusieurs avantages significatifs à l&#39;utilisation du substrat NucView 488. Un des principaux avantages est la possibilité de suivre l&#39;apoptose dans les cellules vivantes en temps réel, alors que la plupart des produits de remplacement, soit exiger une lyse cellulaire ou la perméabilité des cellules pauvres. Les autres avantages comprennent une grande sensibilité pour la caspase-3 de reconnaissance, de la perméabilité cellulaire élevée, une faible cytotoxicité, et aucune interférence avec la progression de l&#39;apoptose. Le substrat a également fluorescence de fond doux jusqu&#39;à ce qu&#39;il est clivé et pénètre dans le noyau, ce qui élimine la fluorescence de fond. La séquence de reconnaissance de caspase-3 contient trois charges négatives et le colorant de liaison d&#39;ADN a une charge positive 2. Le DEVD-488 NucView molécule a donc une charge nette négative, ce qui empêche l&#39;activation et la fixation de la teinture à l&#39;ADN dans les cellules où la caspase n&#39;est pas actif. Mala cohérence entre les expériences intaining est nécessaire pour être en mesure d&#39;établir des comparaisons significatives entre les répétitions. Un des principaux paramètres de garder constant est la densité cellulaire, car il influe sur le taux de transfection. Obtenir des taux de transfection élevé dans immortalisé N19-OLG cultures cellulaires est plus difficile que d&#39;autres lignées cellulaires courantes telles que HeLa ou HEK 293, et est fortement dépendante de la densité, dans notre expérience de 12, 13. Nos meilleures efficacités de transfection de ces cellules ont été obtenus avec Fugene HD (Roche) et sont normalement d&#39;environ 15%, mais peut atteindre plus de 30%, selon le construire. Le comptage des cellules permet de suivre l&#39;aide à obtenir des taux de transfection cohérente. Il est également important d&#39;exposer les cellules à partir des traitements différents pour le même degré de stress de l&#39;environnement, en particulier lorsque l&#39;on mesure les taux d&#39;apoptose. Plus précisément, la longueur du temps pendant lequel les cellules sont exposées à des réactifs de transfection, ou le montant de l&#39;exposition lumineuse, sont importantes sur l&#39;environnement variablevariables à considérer, et devrait rester constante à travers des expériences. Pour nos applications, nous avons constaté que la collecte d&#39;un grand nombre de champs de vue offre un échantillon de taille suffisamment grande pour faire des comparaisons statistiquement significative [ibid].

Table des réactifs spécifiques et des équipements <table border="1"><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> NucView 488 Kit Caspase-3 Assay pour les cellules vivantes </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> Réactifs de transfection FuGENE HD </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Médium </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypsine à 0,25% </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5 à 25 mm en verre lamelle </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnétiques chambre de culture de 25 mm lamelle </td&gt; <td> Quorum Technologies </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Culture de tissus Cellstart boîtes de 10 cm </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon de 6 puits boîtes de culture tissulaire </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

Le système nerveux central peuvent éprouver un certain nombre de contraintes et les insultes neurologiques, qui peuvent avoir de nombreux effets indésirables qui aboutira à une réduction de la population neuronale et la fonction. Axones endommagés peuvent libérer des molécules excitatrices comme le potassium ou le glutamate dans la matrice extracellulaire, qui à son tour, peut produire d&#39;autres insultes et les blessures aux cellules gliales de soutien, y compris astrocytes et oligodendrocytes 8, 16. Si l&#39;insulte persiste, les cellules seront soumis à la mort cellulaire programmée (apoptose), qui est réglementée et activée par un certain nombre de bien établie cascades de transduction du signal 14. L&#39;apoptose et une nécrose tissulaire peut survenir après une lésion cérébrale traumatique, ischémie cérébrale, et des convulsions. Un exemple classique de la régulation apoptotique est la famille de cystéine dépendante aspartate-dirigé protéases ou caspases. Protéases activées incluant les caspases ont également été impliqués dans la mort cellulaire en réponse à la neuro chroniquesmaladies dégénératives, y compris la maladie d&#39;Alzheimer, de Huntington et la sclérose en plaques 4, 14, 3, 11, 7. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de la NucView 488 caspase-3 substrat pour mesurer le taux d&#39;apoptose caspase-3 dans la médiation immortalisé N19-oligodendrocytes cultures cellulaires (OLG) 15, 5, suite à une exposition à différents stress extracellulaires tels que des concentrations élevées de de potassium ou le glutamate. La lignée cellulaire immortalisée conditionnellement-N19-OLG (représentant l&#39;ancêtre O2A) a été obtenu auprès du Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, et a déjà été utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de l&#39;expression du gène de la myéline et transduction du signal conduisant OLG différenciation (par exemple, 6, 10). Nous avons trouvé cette lignée cellulaire pour être robuste à l&#39;égard de transfection avec exogènes basique de la myéline des protéines (MBP) construit fusionnée à la GFP soit DP ou (rouge ou vert fluorescent protein) 13,12. Ici, les cultures de cellules N19-OLG ont été traités soit avec du chlorure de potassium 80 mM ou 100 mM glutamate de sodium pour imiter les fuites axonale dans la matrice extracellulaire pour induire l&#39;apoptose 9. Nous avons utilisé un bi-fonctionnelle de la caspase-3 contenant un substrat DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 sous-unités de reconnaissance et d&#39;un colorant liaison à l&#39;ADN 2. Le substrat pénètre rapidement dans le cytoplasme où elle est clivée par la caspase-3 intracellulaires. Le colorant, NucView 488 est libéré et entre dans le noyau de la cellule où il se lie d&#39;ADN et une fluorescence verte à 488 nm, de signalisation apoptose. L&#39;utilisation du NucView 488 caspase-3 substrat permet imagerie des cellules vivantes en temps réel 1, 10. Dans cette vidéo, nous avons également décrire la culture et la transfection de cellules immortalisées N19-OLG, ainsi que des techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes.

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Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Imagerie des cellules vivantes de l&#39;apoptose médiée caspase-3 dans les cultures cellulaires immortalisée N19-oligodendrocyte utilisant le<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspase-3 du substrat. Cette technique est applicable pour les essais de la mort cellulaire programmée en temps réel dans une variété de types de cellules et de tissus.

Surveillance clivées activité caspase-3 et l&#39;apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K vues.  University of Guelph. Imagerie des cellules vivantes de l'apoptose médiée caspase-3 dans les cultures cellulaires immortalisée N19-oligodendrocyte utilisant le NucView 488 caspase-3 du substrat. Cette technique est applicable pour les essais de la mort cellulaire programmée en temps réel dans une variété de types de cellules et de tissus.

Vidéo: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Recherche

Neurosciences

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Activité caspase-3 dans l&#39;amygdale Rat mesurée par spectrofluorimétrie après infarctus du myocarde

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Cellules vivantes mesure d’odorants récepteur Activation en utilisant un essai en temps réel de cAMP

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Analyser l’activité neurale et la connectivité à l’aide des données EEG intracrânienne avec logiciel SPM

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Dépolarisation sélective des mitochondries axonales assistée par microfluidique

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Cellules humaines de type microglie : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et dosage in vitro de la phagocytose sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Dévoilement de l’ultrastructure mitochondriale dans les neurones à l’aide de la microscopie STED

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

Pleins feux sur l’auteur : Décoder le vieillissement mitochondrial 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Utilisation de l’imagerie STED de cellules vivantes pour visualiser l’ultrastructure de la membrane interne mitochondriale dans des modèles de cellules neuronales

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...