Este laboratorio ha sido financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá, y la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá (MSSC). GST fue el beneficiario de una beca de Doctorado de la MSSC. Estamos muy agradecidos con el Dr. Joan Boggs (Hospital para Niños Enfermos de Toronto) para muchas discusiones útiles y comentarios sobre este manuscrito. Estamos muy agradecidos a Biotium por su generosa donación adicional de 488 NucView caspasa-3.

1. La descongelación y el cultivo de células <ol><li> Obtener un balance de congelados inmortalizado N19-oligodendroglial células de largo plazo, las tiendas de nitrógeno líquido. </li><li> Sumerja vial que contiene las células a 37 ° C baño de agua hasta que la suspensión de células esté completamente descongelado. </li><li> 7 ml de DMEM (Dulbecco Modificado Medio de Eagle) con alta glucosa suplementado con 10% de SFB (suero fetal bovino) y 1% de penicilina / estreptomicina a una placa de 10 cm de la cultura. </li><li> Añadir la célula de suspensión, gota a gota a la placa, y agitar suavemente y el rock de la placa de Petri para dispersar las células de manera uniforme. </li><li> Las células de cultivo a 34 ° C / 5% CO 2 incubadora. </li><li> Después de 4 horas, los medios de comunicación aspirado de las placas para eliminar cualquier resto de DMSO (dimetilsulfóxido), que había sido utilizado como un crioprotector, y reemplazar con medio fresco (7 ml DMEM alto de glucosa en medios suplementados con 10% de SFB y 1% de penicilina / estreptomicina) . </li></ol> 2. Las células pases <ol><li> En un 70-80%confluencia (4-7 días de crecimiento), aspirar los medios de comunicación de las células. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% a la placa. Pipeta la tripsina para separar las células (aproximadamente 5 minutos). </li><li> Realizar las diluciones adecuadas para las condiciones experimentales y el paso de un adicional de 10 cm de la placa para futuros experimentos a una densidad celular no menos de 0,1 x 10 6 células / ml. </li></ol> Nota: Es necesario el paso a las células por lo menos dos veces después de la descongelación antes de usarlos para experimentos. 3. Contar y Revestimiento células <ol><li> A las células de la placa de células vivas, imágenes, trypsinize como se describió anteriormente. </li><li> Quite aproximadamente 30 l de las células y el recuento con un hemocitómetro. </li><li> Coloque un cubreobjetos de vidrio sin recubrimiento en una placa de 6 pocillos. Agregar celdas a la pocillos a una densidad de 0,1 x 10 6 células / ml en 2 ml de fenol libre de DMEM alto de glucosa en los medios de comunicación, suplementado con FBS al 10% y el 1% de penicilina / estreptomicina, a los 34 ° C / 5% CO 2. </li><li> Permitirlas células a crecer durante la noche (16-20 h) a 34 ° C / 5% de CO 2 antes de la transfección. </li></ol> 4. Transfección <ol><li> Combine 100 l medio libre de suero, 0.5-4 mg purificada ADN plásmido, y 4 l HD FuGENE (Roche). Vortex suavemente para mezclar. </li><li> Vortex de nuevo brevemente y permitir que el ADN al complejo por 5 min a temperatura ambiente, y luego añadir FuGENE mezcla de ADN de alta definición directamente en las células cultivadas. Incline la placa suavemente para mezclar. </li><li> Cultivar las células durante 48 horas a 34 ° C / 5% de CO 2 antes del tratamiento o la experimentación. </li></ol> 5. Las células para la preparación de imágenes de células vivas (LCI) <ol><li> Encienda el LCI Chamlide células vivas, caja de control de instrumentos por lo menos 1 hora antes de que desea iniciar el experimento. La caja de control regula la temperatura y la humedad dentro de la Chamlide LCI, y regula el flujo de la premezcla 5% de CO 2. </li></ol> Nota: Es aconsejablea su vez en la caja de control de hasta 3 horas antes del comienzo experimentos para asegurarse de que toda la etapa alcanza 34 ° C. Este paso será reducir la deriva de coordinación, que es causada por fluxulation y la expansión térmica de la fase de metal que se calienta, durante la exploración. <ol start="2"><li> Trabajar en una campana de flujo, rocíe el Chamlide de tipo magnético cámara de cultivo, y las pinzas, con el 70% de etanol y dejar que se sequen durante 5 minutos. </li><li> Eliminar las células de la incubadora y confirmar que están sanos. Deben aparecer adherente y bien extendidas sobre el portaobjetos de vidrio con numerosos procesos de membrana. Las células que se destacó de la transfección no son adecuados para la experimentación, y tendrán una reducción del número de extensiones de proceso, y con frecuencia tienen un núcleo de forma irregular. </li><li> La inclinación de la placa de 6 pocillos y retirar el cubreobjetos con unas pinzas. Rápidamente coloque el lado de células cubreobjetos hasta en la placa inferior de la cámara de cultivo. No permita que el cubreobjetos se sequen. </li><li> Conecte el magnético principalcuerpo de la cámara de cultivo y añadir 500 l de los medios de comunicación a partir de los 6 originales y placa en la parte superior del cubreobjetos. Re-utilizando este medio para disminuir la cantidad de tensión puesta en las células causados ​​por cambios ambientales, y también puede ser útil para la evaluación de factores secretados extracelular. </li><li> Coloque la tapa de cristal en la cámara de cultivo. </li><li> Use un KIMWIPE rociado con etanol al 70% para eliminar cualquier material residual de la parte inferior del cubreobjetos, que podría interferir con el microscopio. </li><li> Coloque la cámara de cultivo en los 34 ° C / 5% incubadora de CO 2 durante 30 minutos. Este paso se asegurará de que la propia cámara se calienta a 34 ° C para reducir el desplazamiento del cubreobjetos ya que el metal se calienta. </li></ol> 6. Configuración del microscopio Las imágenes fueron adquiridas aquí usando un microscopio Leica DMIRE2 invertida con una lente de relé de la costumbre y de emisión de la vivienda rueda de filtros de cartucho de carga de ruedas múltiples (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON). <ol><li> Campo claro - de luz en 2,5 V y el tiempo de exposición a 240 ms. </li><li> Proteína fluorescente roja (RFP) - Ganancia fijado en 140 por 200 ms. </li><li> La proteína verde fluorescente (GFP) - Ganancia fijado en 140 por 500 ms. </li><li> Nuestro microscopio tiene una lámpara regulable en lugar de un disco giratorio para controlar la cantidad de luz disponible para las células. Realizamos nuestros experimentos con la luz en un 90% de la intensidad máxima de la lámpara. </li></ol> 7. El tratamiento de células con inductores de apoptosis y NucView 488 sustrato de la caspasa-3 <ol><li> Es importante preparar grandes cantidades de inductores de la apoptosis antes de tiempo y congelar en alícuotas, de modo que las concentraciones serán consistentes entre los experimentos. </li><li> El NucView 488 sustrato es sensible a la luz. Preparar alícuotas de 15 l para reducir los tubos de congelación / descongelación, y guardar a -20 ° C cubierto con papel de aluminio. Trabajo con la iluminación ambiental de la sala lo más bajo posible para reducir la exposición de la NucVea 488 de sustrato a la luz, antes de su uso. </li><li> Recuperar la cámara de cultivo rápido de la incubadora para que las células no están expuestos a una reducción de la temperatura. Coloque la cámara de cultivo en la cámara ambiental del microscopio, y el uso de pinzas para mantener la cámara de cultivo que se mueva. En este punto también debe atenuar las luces de la habitación. </li><li> Encienda el 5% premezcla cilindro de CO 2 con regulador dual. </li><li> Usando el objetivo de 10x, enfoque para encontrar células en el monitor de la computadora usando el microscopio de campo brillante. Nota: usted desea utilizar la mayor apertura numérica del objetivo con la ampliación deseada para reducir el tiempo de exposición. </li><li> Ofrecer inductores de la apoptosis de las células (en nuestro caso, potasio 80 mM o 100 mM de glutamato), uno de los siguientes métodos se pueden utilizar. Vamos a recurrir a la entrega de potasio 80 mM como un ejemplo, utilizando KCl disuelto como un concentrado de 10 veces en nuestros medios de comunicación la cultura típica. <ol><li> Medios de intercambio by lenta y locales de perfusión: - Use una bomba peristáltica a los medios de cambio en la cámara de cultivo con nuevos medios de comunicación que contiene 80 mM de potasio. - Uno de los extremos de la tubería ofrecerá 10 ml de un stock de 80 mM de potasio disuelto en fenol libre de DMEM, y el otro extremo de la tubería se extraiga material de la cámara. - Usted quiere que por lo menos un cambio 10 veces de los medios de comunicación para asegurar que los medios de comunicación quedan en la cámara tiene la concentración correcta de potasio. - Después de los medios de comunicación se intercambia, añadir 3 l de 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara. Pipeta para mezclar. </li><li> Adición directa de 80 mM de K + y 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara de la cultura: - Preparar una solución madre 10 veces más de potasio 80 mM disuelto en fenol libre de DMEM. - Añadir 3 l de 488 NucView sustrato a 50 l de potasio 10x 80 mm. Pipeta para mezclar. Añadir a 500 l de fenol-DMEM libre en cámara de cultivo. Nota: este método espreferible si usted está interesado en el mantenimiento o la evaluación del crecimiento u otros factores secretados que pueden estar presentes en los medios de comunicación original. Hemos encontrado que el 488 NucView sustrato es estable en el cultivo de células para los experimentos que dura hasta 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Imágenes de células vivas <ol><li> Haga clic en el canal rojo para mostrar las células transfectadas. </li><li> Seleccionar y guardar alrededor de una docena de cuadros donde hay varias células transfectadas, y guardar estos &quot;puntos XY etapa&quot;. Dependiendo de la cantidad de memoria del ordenador, es posible que se limita al número de puntos de la etapa que va a ser capaz de adquirir. </li><li> Tienen las imágenes de la captura de microscopio (en campo claro, canal rojo y canal verde) en estas etapas guardan puntos cada 6 minutos. </li><li> Alguna mancha verde que es visible durante las primeras etapas de los experimentos de probabilidades indica que las células que ya están sometidas a la apoptosis, por lo general para la transfección y / o el estrés ambiental. Apoptosis, debido a los tratamientos experimentales se detectó en un punto de tiempo después del experimento. </li></ol> 9. Análisis estadístico <ol><li> Para cada experimento, se programa el microscopio para adquirir varios puntos de XY para reunir un gran conjunto de datos de manera eficiente. Cada experimento se realiza por duplicado o triplicado, y compilar los datos de distintos experimentos realizados en días diferentes. Cada conjunto de datos, se analizan hasta 15 campos de ver y comparar la relación de la caspasa-negativos células de la caspasa-células positivas (número total de células en el campo de visión / número total de la caspasa-células positivas). </li><li> Las medidas registradas por cada conjunto de datos se agrupan en un conjunto de muestras más grandes, y se comparan entre sí mediante una tabla de ANOVA (p = 0,05). Se muestran los errores estándar de la media (SEM) de cada experimento, y luego comparar la diferencia de medias mediante la realización de una prueba de comparación de los medios de Tukey (p = 0,05) para determinar quICH tratamientos son muy diferentes unos de otros. </li></ol> 10. Resultados representante Hemos descrito un experimento para ilustrar cómo el NucView 488 sustrato puede indicar una mayor tasa de apoptosis de N19-OLG cultivos celulares siguiendo un tratamiento con una concentración alta de potasio extracelular. El N19-células fueron transfectadas con PP, y fueron tratados con 3 l NucView 488 substrato (control), o 3 l de sustrato NucView 488 y 80 mm [K +] (tratamiento). Las células fueron controlados y las imágenes fueron adquiridas en un curso de 12 h, lo cual es adecuado para los estudios con insultos neurológicos (Figura 1A). En las condiciones de control, no observamos una cantidad significativa de apoptosis en comparación con el 80 mM [K +] cultivos tratados (cuadro hash), que mostró aproximadamente 45% la muerte celular después de 12 h (fig. 1B). La luz verde de fondo observard en las condiciones de control indica que las células que se someten a la apoptosis, sin la adición de potasio extracelular. Prácticamente ninguna de las células de la apoptosis de control de exhibición experimento por el punto de tiempo de 12 h, aunque en otras situaciones, los experimentos pueden ser obligados a largo plazo. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 10x. Bar = 100 micras. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> Figura 1. (A) Un tiempo de 12 h experimento curso de N19 culturas OLG 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo) junto con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde). Los cultivos fueron tratados con una concentración final de 80 mM [K +] (paneles de la izquierda), o ningún tratamiento en el control (paneles de la derecha). Las imágenes fueron adquiridas en intervalos de 6 minutos, y la activación significativa de exfoliados caspasa-3 (señal verde) se puede observard en los cultivos tratados con 80 mM [K +] dentro de los núcleos celulares (cuadro de hash) en comparación con el experimento de control. (b) Porcentaje de la caspasa-3 cortado las células (que se calcula dividiendo el número total de células en el campo de visión el número total de la caspasa-células positivas). En comparación con el control de las condiciones, se observó un 45% la muerte celular después de K +-tratamiento por 12 h. S-Video 1. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con brillantes imágenes de campo y una de tres vías imagen fusionada, tras el tratamiento con 80 mM [K +]. S-Video 2. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con el campo brillante images y una imagen de tres vías combinadas. No hay un tratamiento se aplicó a las culturas y N19-OLGs se puede ver a través de la migración campo del microscopio, en contraste con los cultivos celulares tratados con 80 mM [K +] (comparar con el S-Video 1).

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Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Aunque este no es el único producto disponible para fluorogénico detección de la apoptosis, hay varias ventajas de utilizar el sustrato NucView 488. Una de las principales ventajas es la capacidad de seguir la apoptosis en células vivas en tiempo real, mientras que la mayoría de los productos alternativos o bien requieren la lisis celular o la permeabilidad celular pobres. Otros beneficios incluyen una alta sensibilidad para el reconocimiento de la caspasa-3, la permeabilidad celular de alta, baja citotoxicidad, y no hay interferencia con la progresión de la apoptosis. El sustrato también tiene antecedentes de fluorescencia bajo hasta que se rompe y entra en el núcleo, lo que elimina la fluorescencia de fondo. La secuencia de reconocimiento de la caspasa-3 contiene tres cargas negativas y el tinte de unión al ADN tiene una carga positiva 2. El DEVD-NucView 488 molécula por lo tanto tiene una carga neta negativa, lo que impide la activación y la unión del colorante en el ADN en las células donde no está activa la caspasa. Maintaining consistencia entre los experimentos se requiere para poder hacer comparaciones significativas entre repeticiones. Uno de los principales parámetros para mantener constante es la densidad celular, ya que afecta a la tasa de transfección. La obtención de altas tasas de transfección en inmortalizado N19-OLG cultivos celulares es más difícil que con otras líneas celulares comunes, tales como HeLa o HEK293, y es altamente dependiente de la densidad, en nuestra experiencia, 12, 13. Nuestra mejor eficiencia de transfección de estas células se han obtenido con Fugene HD (Roche) y normalmente son alrededor del 15%, pero puede llegar a más del 30%, dependiendo de la construcción. Recuento de células cuidado ayudará en la obtención de tasas consistentes de transfección. También es importante para exponer las células a partir de diferentes tratamientos en el mismo grado de estrés ambiental, especialmente en la medición de los índices de apoptosis. En concreto, la longitud de tiempo durante el cual las células son expuestas a reactivos de transfección, o la cantidad de exposición a la luz, son importantes variables ambientalesvariables a considerar, y debe seguir siendo constante a través de experimentos. Para nuestras aplicaciones, hemos encontrado que la recopilación de un gran número de campos de visión proporciona un tamaño de muestra suficientemente grande como para hacer comparaciones estadísticamente significativa [ibid].

Tabla de reactivos y equipos específicos <table border="1"><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> NucView 488 Kit de caspasa-3 ensayo de células en vivo </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD reactivo de transfección </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modificado Medio Eagle </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5-25 mm de vidrio cubreobjetos </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnética cultura de la cámara de 25 mm cubreobjetos </td&gt; <td> Tecnologías de quórum </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart cultivo de tejidos platos de 10 cm </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-y platos de cultivo de tejidos </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

El sistema nervioso central pueden experimentar una serie de tensiones e insultos neurológicos, que pueden tener numerosos efectos adversos que en última instancia conducir a una reducción de la población neuronal y la función. Axones dañados pueden liberar moléculas excitatorios como el potasio o el glutamato en la matriz extracelular, que a su vez, pueden producir más insultos y daños a las células gliales de apoyo incluyendo los astrocitos y oligodendrocitos 8, 16. Si la lesión persiste, las células se someten a la muerte celular programada (apoptosis), que está regulada y activada por una serie de bien establecida cascadas de transducción de señales 14. Apoptosis y necrosis de los tejidos puede ocurrir después de una lesión cerebral traumática, la isquemia cerebral y convulsiones. Un ejemplo clásico de regulación de la apoptosis es dependiente de la familia de cisteína-aspartato dirigida proteasas o caspasas. Proteasas activadas incluyendo las caspasas también han sido implicados en la muerte celular en respuesta a la neuro crónicaenfermedades degenerativas como el Alzheimer, Huntington, esclerosis múltiple y 4, 14, 3, 11, 7. En este protocolo se describe el uso de la NucView 488 caspasa-3 sustrato para medir la velocidad de la caspasa-3 en la apoptosis mediada por inmortalizado N19-cultivos de células de oligodendrocitos (OLG) 15, 5, tras la exposición a diferentes tensiones extracelulares, tales como altas concentraciones de potasio o el glutamato. El condicionalmente inmortalizada N19-OLG línea celular (lo que representa el progenitor O2A) se obtuvo del Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Instituto de Neurociencias) 15, 5, y ha sido utilizado previamente para estudiar los mecanismos moleculares de la expresión génica de mielina y la transducción de la señal principal OLG a la diferenciación (por ejemplo, 6, 10). Hemos encontrado que esta línea celular para ser robusto con respecto a la transfección con exógenos proteína básica de mielina (MBP) construye fusionado a GFP o RFP o (rojo o proteína verde fluorescente) 13,12. En este caso, los cultivos celulares N19-OLG fueron tratados con 80 mM de cloruro de potasio o de sodio 100 mM de glutamato para imitar las fugas axonal en la matriz extracelular para inducir la apoptosis 9. Se utilizó un bi-funcional de la caspasa-3 que contiene un sustrato DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspasa-3 subunidad de reconocimiento y un tinte de unión al ADN 2. El sustrato rápidamente entra en el citoplasma, donde es degradado por la caspasa-3 intracelular. El medio de contraste, NucView 488 se libera y entra en el núcleo celular donde se une el ADN y el verde fluorescente a 488 nm, lo que indica la apoptosis. El uso de la NucView 488 caspasa-3 sustrato permite células vivas imágenes en tiempo real 1, 10. En este video, también se describe el cultivo y la transfección de células inmortalizadas N19-OLG, así como células vivas, las técnicas de imagen.

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Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Células vivas imágenes de la apoptosis mediada por la caspasa-3 en cultivos de células inmortalizadas N19-oligodendrocitos con el<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspasa-3 sustrato. Esta técnica es aplicable para los ensayos de la muerte celular programada en tiempo real en una variedad de tipos de células y tejidos.

Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K vistas.  University of Guelph. Células vivas imágenes de la apoptosis mediada por la caspasa-3 en cultivos de células inmortalizadas N19-oligodendrocitos con el NucView 488 caspasa-3 sustrato. Esta técnica es aplicable para los ensayos de la muerte celular programada en tiempo real en una variedad de tipos de células y tejidos.

Video: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Investigación

Neurociencias

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Análisis de actividad de los nervios y conectividad mediante datos EEG intracraneal con Software SPM

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

Despolarización selectiva asistida por microfluídica de mitocondrias axonales

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Desvelando la ultraestructura mitocondrial de las neuronas mediante microscopía STED

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

Autor destacado: Decodificando el envejecimiento mitocondrial 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana interna mitocondrial en modelos de células neuronales

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...