Nous remercions le Dr Shirin Bonni pour fournir la construction pSil-GFP, M. Alper Uzun pour l&#39;illustration de la figure 1, et l&#39;installation de bio-imagerie Leduc pour la microscopie confocale. EMM est pris en charge par la bourse de carrière pour les sciences médicales de l&#39;Burroughs Wellcome Fund, un NARSAD Prix des jeunes chercheurs, et les NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01. SBL est soutenu par le NIH NCRR P20 COBRE RR018728-01, et a reçu le soutien de PHS NRSA 5T32MH019118-20.

1. Préparation des solutions de la Culture et médias (pas dans la vidéo) <ol><li> Préparez 1 litre de solution complète saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant HBSS 1x, 2,5 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM de D-glucose, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4 et 4 mM NaHCO 3. Ajouter l&#39;eau bidistillée (FD 2 O). Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2 um et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer le milieu de culture tranche en utilisant 35 ml de milieu de Eagle basale des médias, 12,9 mL de HBSS complètes, 20 mM D-glucose (1,35 ml d&#39;une solution 1 M), 1 mM Glutamax (0,25 ml d&#39;une solution 200 mM), 0,5 ml de pénicilline stock de la streptomycine-100x. Stériliser par filtration avec un filtre de 0,2-um, puis ajouter inactivé par la chaleur du sérum de cheval à une concentration finale de 5%. </li><li> Préparer la solution de laminine de travail en faisant un 1 mg / ml de la solution stock de laminine avec de l&#39;eau stérile désionisée distillée. Préparer des aliquots de 100 ul de 0,5 mL tubes eppendorf et congeler à -80 ° C. </li><li> Préparer poly-L-lysine de travail afinlution par addition de 5 ml de H 2 O stérile à 5 mg de poly-L-lysine pour faire une à 1 mg / ml de solution concentrée. Préparer des aliquotes de 1 mL et congeler à -20 ° C. </li><li> Préparer la solution de revêtement en diluant 1 ml de poly-L-lysine et 100 ul de la laminine à un volume final de 12 ml avec de l&#39;eau stérile. Faire de cette solution fraîche à chaque fois. </li></ol> 2. Préparation Insère organotypique (pas dans la vidéo) <ol><li> Préparer deux plaques de six puits avec un insert de culture par puits en utilisant des pinces stériles. Ajouter 2 ml de solution stérile O ddH 2 sous les inserts de culture. </li><li> Ajouter 1 mL de la solution de revêtement au-dessus de la membrane en prenant soin de ne pas percer la membrane. Incuber une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Retirez le support de revêtement et les laver à membrane avec stériles H 2 0 trois fois. Laissez inserts sec avant utilisation. Ajouter 1,8 ml de milieu de culture tranche et le lieu à 37 ° C incubateur. Envelopper les plaques inutilisées avec du Parafilmet conserver à 4 ° C pour un maximum de 4 semaines. </li></ol> 3. Préparation pour l&#39;électroporation (pas dans la vidéo) <ol><li> Préparer des constructions RNAi pour l&#39;électroporation. Double inserts brin en épingle à cheveux d&#39;ARN ont été clonés dans un vecteur pSilencer. Les plasmide contient: 1) un promoteur qui entraîne U6 l&#39;ARN double brin génération, et 2) une cassette d&#39;expression de la GFP dirigée par le promoteur CMV 8,9. Ce plasmide a été précédemment décrit par Konishi et ses collègues 9 et d&#39;autres 7,8. Plasmides sont purifiés en utilisant une Qiagen maxi-kit de préparation, et utilisé à une concentration de 1 mg / ml. </li><li> Afin de visualiser l&#39;ADN tandis que l&#39;injection, préparer un 0,5% solution rapide colorant vert et de l&#39;utiliser à 1:20 avec l&#39;ADN doit être injecté (généralement de 20 uL d&#39;ADN avec 1 pl de vert rapide). Gauche sur l&#39;ADN-rapide mélange de colorant vert peuvent être stockés à -20 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Zone de dissection propre, dissectides outils et des navires ng vibratome avec de l&#39;éthanol 70%. Réfrigérer HBSS complètes, de sorte qu&#39;il est glacée. Refroidissement vibratome navire par l&#39;emballage de la glace autour de lui à l&#39;intérieur du vibratome avec un peu d&#39;eau pour le refroidissement rapide. Préparer 3% bas point de fusion d&#39;agarose en utilisant HBSS complètes. Micro-ondes pendant 1 min. Évitez de trop bouillante. Conserver dans un bain-marie à 42 ° C jusqu&#39;à son utilisation. </li><li> Paramètres d&#39;électroporation sont fixés comme suit. Pour une utilisation d&#39;embryons E15 35 V, 5 impulsions, longueur de 100 ms, 900 ms d&#39;intervalle entre les impulsions. Pour animaux plus, pour assurer l&#39;électroporation, utiliser une tension plus élevée jusqu&#39;à 50 V ou augmenter le nombre d&#39;impulsions jusqu&#39;à 8 impulsions. Pour éviter d&#39;endommager le tissu chez les jeunes animaux, utiliser des impulsions soit moins ou jusqu&#39;à 2 légumineuses et basse tension jusqu&#39;à 25 V. Ces paramètres peuvent être modifiés et déterminés de façon empirique en fonction de l&#39;âge de l&#39;animal. </li></ol> 4. Dissection et électroporation (en vidéo) <ol><li> Après l&#39;euthanasie d&#39;une femme enceinte, disséquer des embryons à en glacées HBSS complètes. Keep chaque embryon dans leurs sacs individuels placentaires. </li><li> Disséquer embryon sortir et couper la tête après la première vertèbre. Gardez à l&#39;glacées HBSS complètes. </li><li> Pour l&#39;injection, placez la tête sur un morceau de parafilm sur le dessus d&#39;une boîte de Pétri. Utilisation sur mesure Hamilton seringue (voir tableau I) injectent environ 6 à 8 pi de l&#39;ADN: rapide vert mix colorant à travers le troisième ventricule afin de combler dans les deux ventricules latéraux dans les vésicules corticales. Sinon, l&#39;injection peut être effectuée directement dans chacun des ventricules latéraux. </li><li> Pour l&#39;électroporation ex vivo, utiliser des électrodes de platine BTX-pincement. Placez l&#39;électrode positive vers le côté du cortex que vous voulez dire électroporer dessus de la tête pour le cortex dorsal. </li><li> Après électroporation, incuber les têtes sur la glace pendant au moins 5 minutes avant de dissection. </li><li> Disséquer les cerveaux dans HBSSby glacée faisant une petite incision sur le côté de la tête et le pelage de la peau sur les côtés de la tête. Ensuite, avecune pince fine délicatement éplucher les pia du cerveau. Retirez le cerveau intact du crâne, en prenant soin de ne pas endommager le cortex. </li></ol> 5. Inclusion et la coupe de cortex électroporées (en vidéo) <ol><li> Transfert de 3% d&#39;agarose à faible point de fusion dans un grand moule placé sur la glace. Le fond du moule va commencer à se solidifier plus rapidement ce qui permettra d&#39;éviter les cerveaux de sombrer vers le fond du moule. Doucement, le transfert des cerveaux avec des pinces fines, un par un après avoir enlevé l&#39;excès de tampon avec un Kimwipe ou papier filtre. Utiliser un embout de pipette 10 pL à faire tourbillonner le cerveau à l&#39;intérieur du moule pour assurer l&#39;interface entre le maximum de l&#39;agarose et le tissu cérébral. </li><li> Orienter les cerveaux pour assurer tous les cerveaux sont dans la même orientation et à peu près au même niveau dans l&#39;agarose. Laissez l&#39;agarose solidifier pendant environ 5 min. Utilisez adhésif de liaison (folle colle) pour fixer les blocs d&#39;agarose afin que les bulbes olfactifs sont debout. Une fois que les blocs sont attachés, immédiatement je ajoutersexies HBSS froid et les garnitures de l&#39;agarose pour s&#39;assurer que les tranches individuelles sont obtenus pour chaque cerveau. </li><li> Pour couper les blocs, mis la vitesse de la vibratome à une faible vitesse (environ la moitié du maximum) et définissez la fréquence de vibration de lame au réglage le plus élevé. Générer de 250 um d&#39;épaisseur coupes coronales. Récupérer tranches à l&#39;aide d&#39;une spatule coudée fine et les transférer à des puits de tissu avec un pinceau fin ou une pince. </li><li> Dans hotte culture de tissus, de transférer les tranches dans des inserts en revêtement. Ajouter 500 ul de milieu de culture à chaque tranche d&#39;insertion pour faciliter le transfert. Jusqu&#39;à 5 tranches peuvent être placés par insert. Retirez les supports en excès à partir du haut des tranches et incuber à 37 ° C en incubateur humidifié. </li></ol> 6. Culture et de l&#39;analyse de tranches organotypiques (en vidéo) <ol><li> Afin de maintenir en bonne santé tranches, les médias frais doit être ajouté au moins tous les deux jours sous la membrane en remplaçant la moitié des médias à chaque fois. </li><li> Afin d&#39;analyser les tranches après la djour esired dans la culture, fixer les tranches dans la membrane. Laver avec une solution saline tamponnée 1x phosphate (PBS) à 37 ° C à trois reprises pendant 10 min à chaque fois. Ensuite, fixer avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) nuit à 4 ° C ou pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Tranches peuvent être analysés avec différents marqueurs cellulaires ou colorés au Hoechst seul à visualiser les cellules électroporées et non électroporé. Perméabiliser et de bloquer les tranches de 2 h à température ambiante avec du sérum de chèvre 10%, Triton de 0,1% en PBS 1x en agitant doucement. </li><li> Colorer avec Hoechst pendant 1 h à température ambiante, se laver 3 fois avec du PBS 1x 10 min à chaque fois avec agitation douce. </li><li> Pour monter tranches couper la membrane avec un scalpel, et utiliser une pince fine pour transférer la membrane contenant des tranches d&#39;un verre dépoli coulissant dans une chambre d&#39;eau. Jusqu&#39;à 5 tranches peuvent être placés par lame de verre. Retirer l&#39;excès d&#39;eau, et ajouter une goutte de solution Flourmount à chaque tranche du cerveau. Placez délicatement une lamelle sur le dessus des tranches de cerveau et de supprimer uney bulles d&#39;air. Analyser tranches à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. </li></ol> 7. Inclusion dans la paraffine de tranches organotypiques Alternative (pas dans la vidéo) <ol><li> Tranches organotypiques peuvent également être intégrés à la paraffine pour une analyse plus fine morphologique, à cette fin la membrane contenant les tranches organotypiques peut être fixé à 4% PFA tel que décrit ci-dessus. </li><li> Les tranches fixes sont intégrés dans 1% (pré-chauffé à 37 ° C) d&#39;agarose, et solidifié dans la glace pendant 30 min. Les blocs d&#39;agarose peuvent ensuite être post-fixes dans 4% PFA à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Le bloc d&#39;agarose contenant la tranche organotypique seront ensuite inclus en paraffine et traitées pour immunofluorescence comme décrit précédemment 10. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Une représentation schématique de l&#39;électroporation du cortex murin et la culture de tranches organotypiques est illustré à la figure 1. Cette méthode est une stratégie utile pour rapiévaluation d de la fonction de gènes impliqués dans le développement neuronal 11. Selon la quantité d&#39;ADN électroporé et le stade embryonnaire à l&#39;électroporation, l&#39;efficacité de transfection peut varier. Tranches va commencer exprimant la GFP au moins 8 heures après l&#39;électroporation et les cellules-seront soumises à la séquence normale des événements neurologiques (prolifération, la migration, et au début de la différenciation neuronale) dans la culture. La figure 2 montre une tranche du cerveau électroporé qui est l&#39;expression d&#39;un contrôle pSilencer-GFP vecteur et on peut observer progéniteurs neuronaux, de neurones migrent et les neurones différenciés dans la tranche. Tranches organotypiques garderont leur morphologie aussi longtemps qu&#39;ils sont maintenus dans un bon media-interface air sur les membranes et peut être utilisé jusqu&#39;à au moins 5 jours de culture. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> Figure 1. Illustration de l&#39;électroporation ex vivo et organotypiquela culture d&#39;essai. E14.5 embryons sont disséqués, et individuellement injecté avec de l&#39;ADN mélangé avec le colorant vert rapide afin de visualiser le site d&#39;injection. L&#39;ADN peut être injecté dans les deux ventricules latéraux comme illustré dans l&#39;illustration ou dans le troisième ventricule, afin de remplir les ventricules latéraux. Après l&#39;injection, les cerveaux sont une électroporation avec un électroporateur onde carrée, en plaçant l&#39;électrode positive du côté désiré du cerveau. Brains sont intégrés dans 3% d&#39;agarose à faible point de fusion et sectionné l&#39;aide d&#39;un vibratome. 250 tranches de cerveau um sont placés sur 0,4 um inserts et cultivées jusqu&#39;à une semaine. GFP peut être observée après 8 après transfection heures. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse des tranches de cerveau électroporées. Tranches de cerveau électroporées ont été colorées pour Hoescht. Cortex dorsal montre électroporés progéniteurs neuronaux à la zone ventriculaire (vz). Les neurones dans le cortical plaque (cp) sont délimitées par la zone marginale (mz). Les flèches blanches indiquent les neurones migrent. Dans ce cas, les cerveaux ont été injectés à E15.5 et électroporation avec un vecteur de contrôle pSilencer GFP. Les sections représentent explants corticales 4 jours après l&#39;électroporation. Échelle barre de 100 um. Dépannage: <ol><li> Efficacité de la transfection faible: Ajuster la concentration de l&#39;ADN utilisé pour au moins 1 ug / uL. Toujours utiliser l&#39;ADN très propre à partir d&#39;une préparation maxi si nécessaire utiliser une endo-libre Quiagen kit pour purifier l&#39;ADN. </li><li> Les cellules transfectées dans une région du cerveau différente de la fréquence souhaitée: Veiller à ce que les électrodes sont positionnées correctement avec la position électrode positive vers le côté du cerveau à être une électroporation. </li><li> Tranches organotypiques perdre la morphologie: les médias changent chaque jour et de s&#39;assurer que les tranches ne sont pas flotter dans les médias </li><li> Tranches de se détacher de l&#39;agarose comme ils sont coupés dans la vibratome: Veiller à ce qu&#39;une bonne interface est faite lors de l&#39;incorporation des cerveaux dans le bas point de fusion d&#39;agarose. </li></ol>

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	<li>Angevine, J. B., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+cell+migration+during+histogenesis+of+cerebral+cortex+in+the+mouse.">Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse.</a> Nature. 192, 766-766 (1961).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).</li><li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons.">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).</li><li>Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+for+analysis+of+proliferation,+cell+death,+and+migration+in+the+embryonic+neocortex.">Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).</li><li>Guerrier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-BAR+domain+of+srGAP2+induces+membrane+protrusions+required+for+neuronal+migration+and+morphogenesis.">The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.</a> Cell. 138, 990-990 (2009).</li><li>Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-389 (2006).</li><li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi.">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li><li>Konishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain.">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain.</a> Science. 303, 1026-1026 (2004).</li><li>Vankelecom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+paraffin-embedding+of+mouse+tissues+for+GFP+visualization.">Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).</li><li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders:+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors.">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Ces procédés impliquant l&#39;électroporation ex vivo de plasmides codant pour l&#39;ARN double brin épingles à cheveux 8 et la culture de tranches organotypiques 4 fournissent plusieurs avantages distincts. Tout d&#39;abord, ces méthodes permettent une évaluation rapide de l&#39;ARNi dérivés phénotypes. L&#39;inclusion d&#39;une cassette d&#39;expression codant pour la GFP dans le vecteur pSilencer même qui contient le promoteur U6 qui entraîne le double brin d&#39;ARN en épi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Hamilton seringue </td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> De calibre 31, 0,5 cm de long, PT-4 (niveau de biseautage point), le volume 10 pi </td></tr><tr><td> Tweezertrodes Platinum </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> La taille de 5mm </td></tr><tr><td> ECM830 électroporateur </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Footswitch </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> Pour une utilisation avec ECM830 électroporateur </td></tr><tr><td> Microtome à lame vibrante </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - plat bien à utiliser avec des inserts </td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td> Contient encoches pour s&#39;adapter à inserts </td></tr><tr><td> Inserts de culture de tissus </td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0,4 micromètre </td&gt; </tr><tr><td> Fast Green </td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> Faible fusion Agarose </td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> L&#39;ADN de qualité </td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de base d&#39;Eagle </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS 10x sans Ca et Mg </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES sans acide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methods for study of neuronal morphogenesis: ex vivo rnai electroporation in embryonic murine cerebral cortex

Le cortex cérébral dirige les fonctions cognitives supérieures. Cette structure à six couches est généré dans un intérieur et unième, hors-dernière de manière, dans lequel les premiers neurones nés restent plus proches de l&#39;ventricule tandis que les neurones derniers nés migrer au-delà des premiers neurones nés vers la surface du cerveau 1. En plus de la migration neuronale 2, un processus clé pour la fonction corticale normale est la régulation de la morphogenèse neuronale 3. Alors que la morphogenèse neuronale peut être étudiée in vitro dans des cultures primaires, il ya beaucoup à apprendre de la façon dont ces processus sont régis dans les environnements de tissus. Nous décrivons les techniques pour analyser la migration neuronale et / ou la morphogenèse en tranches organotypiques du cortex cérébral 4,6. Un vecteur pSilencer modifié est utilisé, qui contient à la fois un promoteur U6 qui entraîne les ARN à double brin en épingle à cheveux et une cassette d&#39;expression qui code pour la protéine distincte GFP entraînée bya promoteur CMV 7-9. Notre approche permet de l&#39;évaluation rapide des défauts dans la croissance des neurites sur knockdown spécifique de gènes candidats et a été utilisé avec succès dans un écran pour les régulateurs de croissance des neurites 8. Parce que seul un sous-ensemble de cellules expriment les constructions RNAi, les tranches organotypiques de permettre une analyse de la mosaïque des phénotypes potentiels. En outre, parce que cette analyse se fait dans une approximation proche de l&#39;environnement in vivo, il offre un faible coût et alternative rapide à la génération d&#39;animaux transgéniques ou knock-out pour les gènes de la fonction corticale inconnue. Enfin, en comparaison avec la technologie d&#39;électroporation in vivo, le succès des anciens expériences d&#39;électroporation in vivo ne dépend pas de la chirurgie de développement des compétences et de maîtrise peut être réalisée avec un temps de formation plus courte et la compétence.

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Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Pour procéder à une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral, nous décrivons des procédés impliquant l&#39;<em&gt; Ex vivo</emÉlectroporation&gt; de plasmides co-exprimant inhibitrice ARN (ARNi) et de la GFP dans le cortex embryonnaire murin. Ce protocole est susceptible d&#39;être l&#39;étude des divers aspects de développement neurologique tels que la neurogenèse, la migration neuronale et de la morphogenèse neuronale, y compris la croissance axonale et dendritique.

Méthodes pour l&#39;étude de la morphogenèse neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Électroporation ARNi dans embryonnaire cortex cérébral murin

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

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Neuroscience

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

11.7K vues.  Brown University. Pour procéder à une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral, nous décrivons des procédés impliquant l' Ex vivo de plasmides co-exprimant inhibitrice ARN (ARNi) et de la GFP dans le cortex embryonnaire murin. Ce protocole est susceptible d'être l'étude des divers aspects de développement neurologique tels que la neurogenèse, la migration neuronale et de la morphogenèse neu...

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...