Les auteurs tiennent à remercier le Dr Kathleen Mathers, le Dr Jean-Philippe Mocho et le Dr Yolanda Torres Saavedra pour leur aide pour effectuer électroporation in utero dans les procédures aseptiques, et Wood Hayley pour son aide pour préparer les plans. EP a été soutenue par une fédération à long terme des sociétés européennes de biochimie (FEBS) et une bourse du Medical Research Council (MRC) de bourses de développement de carrière, titulaire de l&#39;AMM par une subvention du Wellcome Trust à Elizabeth Fisher et Victor Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW par un EMBO long terme de bourses et RA par une bourse d&#39;études de la MRC. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet de la Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) et par un FG Grant-in-Aid de la Medical Research Council (U117570528) à

Au Royaume-Uni, les souris sont logés, élevés, et traité selon les lignes directrices approuvées par le Home Office en vertu de l&#39;animal (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Préparation: ADN Solution et Aiguilles <ol><li> Purifier l&#39;ADN plasmidique avec une endotoxine libre Maxi-prep kit. Préparer la solution d&#39;ADN plasmidique pour l&#39;injection à des concentrations désirées dans l&#39;eau et ajouter Fast Green (concentration finale de 0,05%) pour visualiser les injections. L&#39;efficacité de l&#39;électroporation est très dépendante de la concentration d&#39;ADN. Une concentration de 1 ug / ul est généralement utilisé. Cette concentration est suffisante pour visualiser les neurones électroporées sans affecter leur développement. Toutefois, selon le promoteur utilisé dans le vecteur plasmidique (niveau d&#39;expression faible promoteur du cytomégalovirus / enhancer, le niveau d&#39;expression forte avec le cytomégalovirus immédiate activateur précoce et de la fusion de poulet promoteur β-actine (ACG) promoteur) ainsi que la taille et la<html> la stabilité de la protéine exprimée, cette concentration peut être ajustée (0,25 pg / pl à 5 ​​ug / ul). </li><li> Tirez aiguilles de verre en utilisant un extracteur micropipette. </li></ol> 2. Préparation de la chirurgie <ol><li> Autoclave des instruments chirurgicaux et une solution saline de tampon phosphate (PBS). </li><li> Préparer la solution analgésique dans du PBS (buprénorphine, Vetergesic, concentration finale de 30 pg / ml). Peser la souris enceintes et injecter sous-cutanée de 0,1 mg / kg de Vetergesic au moins 30 minutes avant la chirurgie. Pendant ce temps, préparer la zone chirurgicale. Tourner sur les coussins chauffants et la chambre de récupération. Placez PBS stérile dans un bain d&#39;eau chaude et tous les instruments stériles et de matériaux sur des draps stériles. Placer les électrodes de platine dans un bécher rempli de PBS et de se connecter à l&#39;électroporateur. Remplir l&#39;aiguille avec la solution d&#39;ADN en utilisant une pointe microloader, connectez l&#39;aiguille au titulaire capillaire et pincez l&#39;extrémité de l&#39;aiguille avec une pince. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Chirurgie Avant l&#39;injection d&#39;ADN et l&#39;électroporation <ol><li> Anesthésiez une souris enceinte (E14.5 E15.5-) avec de l&#39;isoflurane en transporteur d&#39;oxygène (l&#39;oxygène 2 l / min) en utilisant une chambre d&#39;induction de l&#39;anesthésie. Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;animal perd réflexe de redressement. </li><li> Transfert de l&#39;animal à une &quot;pré-opératoire&quot; masque. Déposer une goutte de gel pour les yeux sur chaque œil afin de prévenir une ulcération cornéenne des yeux tandis que la mère est sous anesthésie générale. Utiliser un rasoir électrique pour se raser les cheveux de l&#39;abdomen. Nettoyez la zone rasée une fois avec clorhexidine pour recueillir les cheveux volant. </li><li> Transfert de l&#39;animal à un second masque dans le domaine chirurgical. Placez la souris avec son dos sur le coussin chauffant. Début de la chirurgie lorsque le réflexe de pédale a été perdu. </li><li> Mettez un masque et des gants stériles. Couvrir l&#39;animal d&#39;un drap stérile (avec un petit trou sur l&#39;abdomen) pour empêcher les tissus et les instruments d&#39;être contaminés par les zones de peau qui n&#39;ont pas été rasés et désinfectés. Nettoyez la zone rasée uneau moins 3 fois avec t clorhexidine. Utilisez un coton-tige stérile à chaque fois différente. Utiliser un scalpel pour faire une incision verticale le long de la ligne médiane (~ 1 pouce de long) à travers la peau. L&#39;aide de ciseaux, faire une incision similaire du muscle de l&#39;abdomen le long de la ligne blanche (ligne blanche composée principalement de tissu conjonctif collagène). </li><li> Choisissez les embryons les plus accessibles et placez la pince à anneaux entre deux embryons et tirez délicatement sur la chaîne embryonnaire hors de la cavité abdominale. A partir de ce moment-là, garder les embryons hydraté avec stérile préchauffée PBS. </li></ol> Pas de microscope est nécessaire pour la visualisation. 4. L&#39;injection de l&#39;ADN et l&#39;électroporation <ol><li> Commencez avec l&#39;un des embryons les plus latérales, ce qui rend plus facile à garder une trace des embryons ont été soumis à une électroporation. Ne tirez pas trop sur les embryons, car cela augmente le risque d&#39;hémorragie. Manipuler la position de l&#39;embryon dans la cavité amniotique utilisant les pinces annulaires etstabiliser la tête des embryons entre les anneaux. Serrez doucement à pousser jusqu&#39;à l&#39;embryon plus proche de la paroi utérine. </li><li> Avec l&#39;autre main, prendre le support de tube capillaire et insérer l&#39;aiguille avec précaution dans le milieu de l&#39;hémisphère pour cibler le ventricule latéral. Appuyez sur la pédale d&#39;injecter environ 1 ul de solution d&#39;ADN mélangé avec Fast Green (moins de 1 pl pour étudier dendrites). Vous devez observer le colorant vert de remplissage du ventricule latéral. Les étapes critiques: - La netteté de l&#39;aiguille est essentiel pour percer correctement la paroi utérine. Il est important pour réduire au minimum le mouvement de l&#39;aiguille à la surface de la paroi utérine et après l&#39;insertion dans le ventricule parce un élargissement du trou se traduira par la fuite de fluide amniotique, et la mort embryon. Évitez les vaisseaux sanguins perçants dans la paroi utérine, comme cela se traduira par des saignements et mort de l&#39;embryon. - Il est important de ne pas injecter un volume trop important de l&#39;ADN dans le ventricule latéral, car il va induirehydrocéphalie (ne pas dépasser 2 pi à E14.5). Le volume de l&#39;ADN est ajustée en fonction de l&#39;objectif de l&#39;expérience. Si 1 microlitre est généralement utilisé pour la plupart des expériences, un plus petit volume de l&#39;ADN (environ 0,5 pi) est nécessaire pour dendrite et l&#39;analyse du rachis. En effet quelques cellules isolées doivent être ciblées afin de visualiser et de mesurer la tonnelle dendritique des neurones électroporées. </li><li> Placer les électrodes sur les côtés de la tête d&#39;embryon avec le pôle positif (+) à aubes sur le même côté que le ventricule injecté pour l&#39;électroporation cortex ou sur le côté opposé du ventricule injecté pour l&#39;électroporation hippocampe (figure 2). Ensuite, appliquez cinq 30V impulsions électriques (50 msec) à des intervalles de 1 sec. Une étape cruciale: Évitez d&#39;appliquer de courant à travers le placenta, car cela entraînerait la mort des embryons. Tous les embryons chez une souris enceinte peut être une électroporation, le plus souvent avec le même ADN de construire afin d&#39;éviter toute confusion. Toutefois, une diminution de la chirurgie à long<html> est le taux de survie des embryons. La cavité abdominale ne doit pas être ouvert plus longtemps que 30 minutes. </li></ol> 5. Chirurgie post-électroporation <ol><li> Après électroporation des embryons, ajouter du PBS dans la cavité abdominale et d&#39;utiliser les pinces à anneaux et à remplacer la corne utérine dans son emplacement d&#39;origine. Suturer la paroi abdominale et la peau avec des sutures résorbables Vicryl. </li><li> Placez l&#39;animal dans une chambre de récupération jusqu&#39;à ce qu&#39;il se réveille (min habituellement 5-10), puis transférer dans une cage placée sur un coussin chauffant. </li></ol> 6. Post-chirurgie Vérifier le comportement des souris pour évaluer la douleur, la souffrance ou de détresse et de peser les animaux 24 h et 48 h après la chirurgie. Si nécessaire, des analgésiques peuvent être administrés afin de minimiser la douleur et l&#39;inconfort. 7. Traitement des tissus Recueillir les embryons électroporées ou chiots à des stades embryonnaires ou postnatale nécessaires pour l&#39;expérience. ove_content &quot;&gt; - Pour l&#39;analyse à des stades embryonnaires (par exemple pour étudier la prolifération cellulaire ou la migration): Euthanasier mère via dislocation cervicale et de recueillir les embryons. Après la décapitation, sélectionnez les cerveaux qui ont été correctement électroporés, comme indiqué par la quantité et l&#39;emplacement du signal fluorescent, visualisé à travers le crâne à l&#39;aide de jumelles fluorescente. Disséquer le cerveau du crâne et de fixer une nuit dans 4% PFA et les placer dans du saccharose à 20% / PBS pendant une nuit. Intégrer dans le composé OCT, gel à -80 ° C et de l&#39;article à l&#39;aide d&#39;un cryostat. - Pour l&#39;analyse à des stades post-natal (par exemple pour étudier les dendrites et les épines): Anesthésier chiots ou des souris adultes avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital (40-60 mg / kg) et d&#39;effectuer la perfusion transcardial avec du PBS, puis de 4% dans du PBS PFA. Disséquer la cervelle du crâne et de post-fix dans 4% PFA nuit. Après lavages en PBS, la section des cerveaux en utilisant un vibratome (100 sections um pour dendrite analyse). Montez les sections dans Aqua Poly / montage en utilisant des lamelles 0,16-0,19 mm d&#39;épaisseur pour les dendrites et les épines d&#39;image. 8. Les résultats représentatifs La figure 3 montre des exemples de cellules électroporées dans le cortex cérébral (figures 3a, b), dans le CA1 (figures 3C, D) et dans le gyrus denté de l&#39;hippocampe (figures 3E, F). Souris de type sauvage ont été électroporation à E14.5 avec une construction GFP (PCA-b-EGFPm5 silencieux 3) et les cerveaux ont été récoltés à jour postnatal (P) 14. En injectant un petit volume de solution d&#39;ADN (0,5 pi ou moins d&#39;une solution à 1 ug / ul), quelques cellules sont étiquetés, ce qui permet la visualisation de l&#39;arborisation dendritique des isolés cellules GFP + (figure 3) ainsi que leurs épines au plus fort grossissement (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; Figure 1. Représentation schématique des protocoles d&#39;électroporation qui peuvent être utilisées pour étudier les dendrites et les épines. (A) électroporation d&#39;une GFP de comparer les dendrites et les épines chez les souris de type sauvage et mutant. (B) électroporation de la GFP-shRNA (GFP est exprimée à partir de la même construction) pour comparer les dendrites et des épines chez la souris avec un électroporés shRNA spécifique pour construire un gène d&#39;intérêt (X) ou un shRNA commande. (C) IUE peut être utilisé conjointement avec un système Cre inductible afin de limiter l&#39;expression de l&#39;shRNA à la période de temps souhaitable. Dans cette expérience, un vecteur exprimant une forme de la recombinase Cre, qui peut être activé par le 4-hydroxytamoxifène (CAG-ER T2 CREER T2; 1 pg / pi) 10, une électroporation est ensemble avec un vecteur exprimant une shRNA spécifique dans une charge Cre de manière (1 pg / pi, et avec un indicateur de recombinaison (CALNL-GFP construction, inductible par expression de la GFP Cre;. 1 pg / pi) 10 Le efficy de l&#39;effet de choc peut être améliorée en augmentant la concentration de l&#39;shRNA ainsi que l&#39;augmentation CAG-ER T2 CREER T2 concentration. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Figure 2. Le contrôle du territoire de l&#39;électroporation. Cette figure montre l&#39;endroit où positionner les électrodes à aubes selon le site d&#39;injection d&#39;ADN afin de cibler le cortex cérébral ou l&#39;hippocampe. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Figure 3. Visualisation de l&#39;arbre dendritique des cellules par électroporation in utero dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe. (A, B) coupes coronales montrant GFP + cellules pyramidales dans le cortex cérébral, (CD) dans les cellules pyramidales CA1 de l&#39;hippocampe et (E, F), les cellules granulaires du gyrus denté à P14. Une construction GFP (PCA-b-EGFPm5 silencieux 3) a été une électroporation à E14.5. Images de grossissement supérieur (B, D, F) montrent que l&#39;IUE est une méthode efficace pour visualiser les dendrites. Barres d&#39;échelle représentent 50 um (B, D et F), 150 um (A, C, E). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Figure 4. Visualisation des épines dendritiques dans les neurones P14 qui ont été électroporés in utero à E14.5 avec une GFP exprimant la construction. (A, B) des images à fort grossissement d&#39;épines de dendrites basales de l&#39;hippocampe neurones pyramidaux. Barres d&#39;échelle représentent 5 um (A) et 2 uM (B).

<ol>
	<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li><li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets.">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li><li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling.">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li><li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon.">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li><li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Methods in Neuroanatomy. , (1970).</li><li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse.">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX.">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

IUE est un outil puissant pour manipuler l&#39;expression des gènes, non seulement dans l&#39;espace mais aussi dans le temps. Nous montrons ici que cette technique peut être utilisée pour visualiser et manipuler génétiquement des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris. Outre les avantages précédemment cités, il est intéressant de noter que l&#39;IUE, contrairement à la méthode de Golgi, peut être combiné avec l&#39;immunohistochimie ou hybridation in situ, qui permet par exemple de phénotype des cellules électroporées. Il est également important de mentionner que cette procédure ne provoque pas de malformations cérébrales évidentes en dépit de son caractère invasif relative. En outre, au niveau cellulaire, IUE ne modifie pas les propriétés électrophysiologiques de l&#39;électroporation neurones 13. Alors que notre démonstration se concentre sur la visualisation des morphologies dendritiques et la colonne vertébrale, IUE de neurones corticaux ou l&#39;hippocampe à E14.5 pourrait également être utilisée pour étudier d&#39;autres événements de développement tels que la formation et l&#39;orientation des axones. En ajouterition, le même genre de protocole pourrait être mis en œuvre à d&#39;autres stades du développement embryonnaire de cibler des populations différentes. Par exemple, un paradigme développemental électroporation très tard corticale à E18.5 peut être effectuée pour diriger l&#39;expression dans les progéniteurs astrocytaires 1. De même, alors une électroporation de l&#39;hippocampe à E14.5 permet de cibler CA1-CA3 progéniteurs neuronaux pyramidales et denté progénitrices de cellules granulaires dans le même temps, une électroporation fin hippocampique (E18.5 ou postnatale précoce) permettrait de cibler les différents granules denté progéniteurs 14. Dans ce cas, le volume injecté de l&#39;ADN peut être augmenté, ainsi que l&#39;intensité du courant. Transgènes introduits par IUE semblent rester épisomique et sont donc perdus à partir de cellules suivantes des divisions cellulaires successives. Dans les cellules post-mitotiques comme les neurones, cependant, les transgènes épisomiques restent actifs pendant des mois après l&#39;électroporation permettant études à long terme 13, 15. Dans notre étude, nous avons observé la GFP lumineux + cellules jusqu&#39;à 7 semaines après la naissance (le dernier point de temps, nous avons analysé) indiquant que l&#39;embryon ciblage des corticales ou hippocampiques précurseurs neuronaux en utilisant les résultats IUE dans l&#39;expression persistante du transgène à partir du début points dans le temps de développement en place à l&#39;âge adulte. Une limitation du courant de la technique, c&#39;est qu&#39;il est difficile d&#39;exercer un contrôle précis sur le nombre total de cellules électroporées. Toutefois, en diminuant le volume injecté de la solution d&#39;ADN, nous avons montré qu&#39;il est possible d&#39;étiqueter quelques cellules et de visualiser l&#39;arborisation dendritique des cellules GFP + isolés ainsi que leurs épines. La dimension de la zone transfectée peut également être réglée en modifiant les paramètres de l&#39;électroporation tels que l&#39;intensité du courant et le nombre d&#39;impulsions ou le diamètre des pales d&#39;électroporation. Au total IUE est une méthode qui est facile à mettre en œuvre, rapide etefficace pour étudier les dendrites et les épines in vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Préparation d&#39;aiguilles et de solution d&#39;ADN pour l&#39;injection </td></tr><tr><td> Kit Endofree Plasmid Maxi </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Le verre borosilicate capillaires 1,0 mm de diamètre extérieur x 0,58 mm de diamètre </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader conseils </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Pour Eppendorf pipettes 0,5 pi-10 pi / 2-20 ul </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> Matériau pour la chirurgie </td></tr><tr><td> Extra plats Ciseaux Iris </td><td> Outils belle science </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pince courbes </td><td> Outils belle science </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Pince à anneaux </td><td> Outils belle science </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-aiguille </td><td> Outils belle science </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Graefe Forceps </td><td> Outils belle science </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Fil résorbable Vicryl </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Draps stériles 30cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Écouvillons stériles </td><td> Shermond </td><td> HUBY-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Cotons-tiges </td><td> Clean Croix Co., Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> La buprénorphine (Vetergesic) </td><td> De la santé animale Alstoe </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Viscotears gel pour les yeux </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, de pentobarbital sodique 20% </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> L&#39;électroporation </td></tr><tr><td> Electroporateur </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Tweezertrod Platinume 5mm </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet microinjecteur </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Pédale de commande pour FemtoJet microinjecteur </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Support de capillaire </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Le traitement des tissus </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> ThermoScientific (Menzel-Gläser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Aqua Poly / montage </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

En électroporation in utero (IUE) est devenue une technique puissante pour étudier le développement de différentes régions du système nerveux embryonnaire 1-5. À ce jour, cet outil a été largement utilisée pour étudier la régulation de la prolifération cellulaire, la différenciation et la migration neuronale en particulier dans les pays en développement du cortex cérébral 6-8. Ici, nous détaillons notre protocole d&#39;électroporation in utero du cortex cérébral et l&#39;hippocampe et fournir la preuve que cette approche peut être utilisée pour étudier les dendrites et les épines dans ces deux régions cérébrales. Visualisation et la manipulation des neurones en cultures primaires ont contribué à une meilleure compréhension des processus impliqués dans la dendrite, la colonne vertébrale et le développement des synapses. Cependant les neurones en développement in vitro ne sont pas exposés à tous les signaux physiologiques qui peuvent affecter dendrite et / ou la formation la colonne vertébrale et de l&#39;entretien au cours du développement normal. Notre connaissance des structures dendritiques et la colonne vertébrale <em&gt; in vivo chez la souris de type sauvage ou mutant vient surtout à partir d&#39;observations en utilisant la méthode de Golgi-Cox 9. Toutefois, la coloration de Golgi est considéré comme imprévisible. En effet, des groupes de cellules nerveuses et des faisceaux de fibres sont étiquetés de manière aléatoire, avec des zones particulières apparaissant souvent complètement taché alors que les zones adjacentes sont dépourvue de coloration. Des études récentes ont montré que l&#39;IUE de constructions fluorescentes représente une méthode intéressante alternative à étudier dendrites, des épines, ainsi que des synapses chez les souris mutantes / type sauvage 10-11 (figure 1A). Ailleurs par rapport à la génération de souris knock-out, IUE représente une approche rapide pour effectuer le gain et la perte de fonction des études de la population spécifique de cellules pendant une fenêtre temporelle spécifique. En outre, l&#39;IUE a été utilisé avec succès dans l&#39;expression des gènes inductibles ou inductible ARNi se rapproche d&#39;affiner le contrôle temporel sur l&#39;expression d&#39;un gène ou shRNA 12. Ces avantages de l&#39;IUE ont ainsi opened de nouvelles dimensions à étudier l&#39;effet de l&#39;expression des gènes / suppression sur les dendrites et les épines non seulement dans certaines structures cérébrales (figure 1B), mais aussi à un moment spécifique du développement (figure 1C). Enfin, IUE fournit un outil utile pour identifier les interactions fonctionnelles entre les gènes impliqués dans la dendrite, la colonne vertébrale et / ou le développement des synapses. En effet, contrairement à d&#39;autres méthodes de transfert de gènes tels que le virus, il est facile de combiner plusieurs ARNi ou des transgènes dans la même population de cellules. En résumé, l&#39;IUE est une méthode puissante qui a déjà contribué à la caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le fonctionnement du cerveau et de la maladie et il devrait également être utile dans l&#39;étude des dendrites et des épines.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation at JoVE.com

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Cet article décrit en détail un protocole d&#39;électroporation in utero du cortex cérébral et l&#39;hippocampe à E14.5 chez la souris. Nous montrons aussi que cette méthode est précieuse pour étudier les dendrites et les épines dans ces deux régions cérébrales.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.8K vues.  MRC National Institute for Medical Research. Cet article décrit en détail un protocole d'électroporation in utero du cortex cérébral et l'hippocampe à E14.5 chez la souris. Nous montrons aussi que cette méthode est précieuse pour étudier les dendrites et les épines dans ces deux régions cérébrales.

Vidéo: Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Recherche

Neurosciences

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Enregistrement colorant sensible à la tension d&#39;axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.