Cette recherche a été financée par la subvention R01NS062842 de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et les accidents cérébrovasculaires, National Institutes of Health (VVD) et par des subventions R21 NS064403 de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et les accidents cérébrovasculaires, National Institutes of Health à l&#39;ARRA (VVD) et R21 EB006301 Institut national d&#39;imagerie biomédicale et bio-ingénierie, National Institutes of Health (VVD).

Les sections de la machine moléculaire basé sur la détection devrait être préparée d&#39;abord parce que leur préparation prend plus de temps que le montage du dispositif moléculaire. La construction fonctionne bien avec le 5-6 microns d&#39;épaisseur pans coupés du paraformaldéhyde-fixes, des blocs de tissus inclus en paraffine. Utiliser les marques diapositives qui conservent des sections bien, comme ProbeOn plus diapositives chargées et préalablement nettoyées (Fisher Scientific) ou similaire. Nous recommandons d&#39;abord en utilisant un tissu avec un motif bien connu de dommages à l&#39;ADN, qui contient à la fois la DNase I et II DNase de type casse, comme la dexaméthasone-rat traité apoptotiques thymus 13,14. 1. Préparation des sections <ol><li> Placer les coupes dans un rack de diapositives et déparaffinage au xylène pendant 15 min, le transfert à un bain de xylène frais pour 5 minutes supplémentaires. </li><li> Réhydrater en passant par la concentration d&#39;éthanol à 96% d&#39;éthanol-2x5min; 80% d&#39;éthanol - 5min; eau - 2x5 min. </li><li> Recueil section avec Proteinase K. Utiliser 100 pi d&#39;une solution 50μg/mL par section. Incuber 15 &#39;à température ambiante (23 ° C) dans une chambre humidifiée. Le temps peut nécessiter un ajustement en fonction du type de tissu. Tissus durs pourrait exiger plus de digestion. Les temps de 15-25 minutes sont généralement utilisés. La digestion insuffisant peut entraîner l&#39;affaiblissement du signal. Overdigestion sur les résultats d&#39;autre part dans la disparition du signal et des perturbations article. </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée pour min 2x10. </li><li> Appliquer 100 ul par la section de BSA 2% pour preblocking. Incuber pendant 15 min à température ambiante (23 ° C). Pendant ce temps assemblage de la machine moléculaire. </li></ol> 2. Moléculaire de montage des machines Tous les réactifs sont mis à l&#39;échelle de 25 uL volume total, ce qui est suffisant pour une détection unique dans une coupe de tissu de taille moyenne (10x10mm). Le volume peut être adapté selon les besoins. <ol><li> Mélanger dans une petit tube en plastique dans cet ordre: </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;tr&gt; <td><ol><li> Eau bidistillée; </li><li> Glycol, le polyéthylène-8000 15%; </li><li> Solution de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 5 mM, 0,1 mM dithioérythritol, ATP 1 mM, (c&#39;est à dire régulièrement tampon T4 DNA ligase); </li><li> 70 pmoles de l&#39;oligonucléotide 1, </li><li> 215 pmoles (1,76 à 7,1 mg) VACC TOPO </li><li> 10 unités de T4 ADN ligase (500 U / ml) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Mélanger doucement par pipetage. Le moléculaires de construire presque instantanément s&#39;auto-assemble dans cette solution et peut être utilisé immédiatement à la température ambiante (23 ° C). Augmenter la température à 37 ° C bloque la T4 ADN ligase composante fondée sur l&#39;étiquetage. </li></ol> 3. L&#39;utilisation de machines moléculaires dans des coupes de tissus au 5&#39;OH étiquette double et 5&#39;PO4 cassures de l&#39;ADN <ol><li> Aspirer la solution preblocking et appliquer 25 pi du mélange de réaction complète contenant 70 pmoles de l&#39;oligonucléotide 1, 53 à 215 pmoles (1,76 à 7,1 mg) VACCTOPO et 10 unités de T4 ADN ligase (500 U / ml) dans une solution de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 0,1 mM dithioérythritol, ATP 1 mM, et de polyéthylène glycol de 15%-8000. L&#39;oligonucléotide même séquence portant un label unique FITC, oligonucléotide 2, peut être utilisé à la place pour la détection d&#39;un seul type de cassures de l&#39;ADN. Dans ce cas omettre ligase de la réaction de marquage. Aussi, dans cette situation une solution de 50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% de PEG-8000 peut être utilisé à la place de tampon ADN ligase T4. </li><li> Incuber pendant 1 heure à température ambiante (23 ° C) dans une chambre humidifiée avec une lamelle de plastique. Protéger de la lumière. Abaissement de la température à 16 ° C réduit le signal de ligase-fondée; l&#39;augmentation de la température à 37 ° C élimine complètement le signal ligase basé. Une inhibition partielle de la ligase survient parfois dans le mélange réactionnel, possiblement en raison de contaminants introduits avec des préparations topoisomérase. Par conséquent, incubation plus longue (2-4 heures) pourrait être nécessaire en particulier lorsque sRINCIPALES numéros de ligase marqué des pauses sont présents. Bien que les deux signaux ligase et topo peut être observée à ce stade, dans de nombreux cas le signal ligase peut être renforcée par une nouvelle application du mélange réactionnel sans VACC TOPO et double-oligonucléotide marqué, mais contenant un oligonucléotide en épingle à cheveux en forme (oligonucléotide 3) (35 mg / mL) et l&#39;ADN ligase T4 (250 U / ml). Pour améliorer le signal passer à l&#39;étape 3, pour voir la réaction sans amélioration passez à l&#39;étape 5. </li><li> Retirez délicatement par des lamelles immergeant la coulisse verticalement dans une jarre de Coplin contenant de l&#39;eau à température ambiante. Aspirer l&#39;excès d&#39;eau. </li><li> Améliorer le signal ligase en appliquant 25 uL du mélange réactionnel sans VACC TOPO et l&#39;oligonucléotide 1, mais contenant l&#39;oligonucléotide 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, MgCl2 5 mM, 0,1 mM dithioérythritol, ATP 1 mM, et de polyéthylène glycol de 15% 8000, 5 unités de T4 ADN ligase, 35 mg / ml Oligonucleotide 3 (en épingle à cheveux à bouts francs). Le volume total de la solution d&#39;étiquetage can être élargi pour accueillir les sections plus grandes. Incuber pendant 18 heures (une nuit) à la température ambiante (23 ° C) dans une chambre humidifiée avec une lamelle de plastique. </li><li> Retirez délicatement par des lamelles immergeant la coulisse verticalement dans un bocal contenant de l&#39;eau Coplin à température ambiante. Puis, lavez la section 3x10 min dans de l&#39;eau distillée. </li><li> Rincer avec un tampon de bicarbonate de sodium. Solution alcaline rincez améliore fluorescence FITC, qui est sensible au pH et est considérablement réduite en dessous de pH 7. </li><li> Couvrir la section avec une solution antidécoloration (Vectashield avec DAPI), la lamelle et d&#39;analyser le signal en utilisant un microscope à fluorescence. Cassures de l&#39;ADN double-brin avec une fluorescence verte 5&#39;OH, 5&#39;PO 4 pauses - une fluorescence rouge (figure 2). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> Figure 1. Semi-artificielle machine moléculaire détecte deux types deDommages à l&#39;ADN in situ. La machine fluorescente s&#39;auto-assemble en VACC TOPO se lie à l&#39;épingle double-32-Mer. La machine commence à fonctionner en se divisant en deux unités de détection par la topo-isomérase fait coupé à l&#39;extrémité 3 &#39;de la séquence de reconnaissance. Il en résulte un processus cyclique où l&#39;unité marquée au FITC sépare en continu et religates revenir à la marqué à la rhodamine unité. Cette persiste jusqu&#39;à une cassure de l&#39;ADN détectable est rencontré. Quand un tel accepteurs alternatifs (5&#39;OH pause émoussé l&#39;ADN de fin) est présent dans la section de tissu, la partie sera FITC ligaturer à elle. La partie restante sera la rhodamine attacher à 5 &#39;PO 4 cassures de l&#39;ADN extrémité émoussée avec l&#39;aide de l&#39;ADN ligase T4. En conséquence, deux types de cassures de l&#39;ADN sont détectés simultanément. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> Figure 2. Étiquettes machine moléculaire double de deux types de cassures de l&#39;ADNdans une section de tissu de dexaméthasone-traitée thymus. Cassures de l&#39;ADN à extrémité franche de DNase I et de type DNase II sont détectés dans les zones corticales thymiques en apoptose. Vert fluorescence cytoplasmique (5&#39;OH cassures de l&#39;ADN) des marques macrophages corticale digérer des matières nucléaires de thymocytes apoptotiques. Ce signal est produit par VACC TOPO, et se localise dans phagolysosomes avec de l&#39;ADN contenant 5&#39;OH cassures double brin 11,12. Fluorescence rouge (5&#39;PO 4 pauses) des noyaux de thymocytes apoptotiques étiquettes n&#39;est pas englouti par les macrophages. Un très grand nombre de thymocytes simultanément apoptose accompagné génération de 5&#39;PO 4 cassures double brin, visualisés par ligase étiquetage basé. Ces pauses sont situés à la périphérie du noyau, formant motifs en forme d&#39;anneau. Tous les noyaux cellulaires sont visualisés par une contre-coloration au DAPI (fluorescence bleue).

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Dans cette vidéo, nous démontrons comment assembler et à utiliser un capteur à double marquage de l&#39;ADN des dommages. Le capteur est une machine moléculaire tirée par la bio-moléculaires moteur, un virus protéine codée VACC TOPO liés à des composants artificiels. Le développement a présenté illustre une approche bio-permis qui prône l&#39;adaptation des structures biologiques, des architectures et des pièces réelles et des composants de cellules à la conception des dispositifs de non-toxique à l&#...

<ol><li> Xylène </li><li> 80 et 96% d&#39;éthanol. </li><li> Solution à 2% d&#39;albumine sérique bovine (BSA) dans l&#39;eau distillée. </li><li> Oligonucleotide 1: une épingle double, double marqués à la fluorescéine et tétraméthylrhodamine: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R AT GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT, R - tétraméthylrhodamine-dT. Autres décalée vers le rouge des fluorophores tels que BODIPY TR, la rhodamine ou TAMRA peut être utilisé au lieu de tétraméthylrhodamine que R. Sinon, vous pouvez utiliser deux oligonucléotides. - Un simple double-épingle marqués à la fluorescéine (pour la détection d&#39;un seul type de cassures de l&#39;ADN (DNase II de type seulement) La sonde unique fluorophore comptable est nettement moins cher et c&#39;est très pratique quand une seule type de cassure de l&#39;ADN doit être étiqueté: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucléotide 3. Blunt-clos marqué à la rhodamine en épingle à cheveux pour l&#39;amélioration du signal de la ligature en place avec l&#39;ADN ligase T4: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;; R - tétraméthylrhodamine-dT </li><li> Vaccinia ADN topoisomérase l (VACC TOPO) - 3000 U / uL (Technologies Vivid). Dans les expériences initiales, nous avons utilisé 215 pmoles (7,1 ug) de l&#39;TOPO VACC par tous les uL 25 du mélange de réaction. Toutefois, la concentration topoisomérase peuvent être considérablement réduits sans perte de sensibilité. Nous avons ensuite utilisé une quantité quatre fois moindre de VACC TOPO par section (1,76 g dans 25 uL du mélange réactionnel par section) avec des résultats similaires. Réduire le montant de l&#39;enzyme à 880 ng (dans 25 uL du mélange de réaction) ont abouti à un signal plus faible et de 8,8 ng d&#39;VACC TOPO produit aucun signal détectable. </li><li> T4 ADN ligase 5 U / uL (Roche). Cette préparation très concentrée ligase donne le meilleur signal dans nos conditions expérimentales. </li&gt; <li> 10 x tampon de réaction de l&#39;ADN ligase T4: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 dithioérythritol mM, 10 mM d&#39;ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP dans un tampon de réaction est facilement détruite dans des cycles répétitifs de dégel-gel. Aliquoter le tampon dans de petites portions de 15 à 20 uL et stocker à - 20 ° C. Utiliser une seule fois. </li><li> 30% (p / v) de PEG-8000 (Sigma) dans l&#39;eau bidistillée. 15% de PEG-8000 dans le mélange réactionnel stimule fortement la détection, l&#39;augmentation des concentrations efficaces de ses constituants par l&#39;exclusion du volume. </li><li> Protéinase K (Roche) 20 solution stock mg / mL dans de l&#39;eau distillée. Entreposer à - 20 ° C. Dans la solution d&#39;utilisation de réaction 50mg/ml dans du PBS, préparé à partir du stock. Ne pas réutiliser. </li><li> Vectashield au DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Tampon bicarbonate de sodium: 50 M de NaHCO 3, 15m M de NaCl, pH 8,2. </li><li> De verre 22x22mm ou 22x40mm ou de lamelles de plastique. Lamelles en plastique sont préférables lors de la réaction, comme ils unere plus facile à enlever de la section. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Naturelle bio-moléculaire des machines de travail dans chaque cellule vivante et d&#39;afficher une variété de modèles 1-6. Pourtant, le développement de centres de machines moléculaires artificielles sur des appareils capables de mouvement directionnel, c&#39;est à dire les moteurs moléculaires, et sur ​​leur échelle réduite des pièces mécaniques (roues, essieux, etc pendentifs) 7-9. Cette imite les machines macro-, même si les propriétés physiques essentielles pour ces appareils, tels que l&#39;inertie et la conservation du moment, ne sont pas utilisables dans les environnements nanomonde 10. Conceptions alternatives, qui ne suivent pas les schémas mécaniques macromachines et utiliser des mécanismes développés dans l&#39;évolution des molécules biologiques, peuvent profiter des conditions spécifiques du nanomonde. Par ailleurs, l&#39;adaptation réelle des molécules biologiques aux fins de la nano-conception permet de réduire les dangers potentiels des produits des nanotechnologies peuvent présenter. Ici nous démontrons l&#39;assemblage et l&#39;application d&#39;une telle bio-permis de construire, commeemi-artificiel appareil moléculaire, qui associe une machine naturelle moléculaire avec des composants artificiels. Du point de vue de l&#39;enzymologie, notre construction est un concepteur fluorescents complexes enzyme-substrat mis ensemble pour remplir une fonction spécifique utile. Cet ensemble est par définition une machine moléculaire, car il contient un 12. Pourtant, son intégration avec la partie ingénierie - fluorescentes épingle double - le re-dirige vers une nouvelle tâche d&#39;étiquetage 12 dommages à l&#39;ADN. Notre construire assemble d&#39;un ADN de 32-mer et d&#39;une enzyme topoisomérase I vaccine (VACC TOPO). La machine utilise alors son propre matériel pour fabriquer deux unités de détection marqués par fluorescence (figure 1). L&#39;une des unités (fluorescence verte) effectue VACC TOPO covalente à son extrémité 3 &#39;et une autre unité (fluorescence rouge) est une épingle à cheveux libres avec un 3&#39;OH terminal. Les unités sont de courte durée et rapidement montés de nouveau dans la construction d&#39;origine, qui recleaves ultérieurement.En l&#39;absence d&#39;ADN pauses ces deux unités séparées en continu et religate de façon cyclique. Dans des coupes de tissus avec des dommages à l&#39;ADN, l&#39;unité de détecteur de topoisomérase porteurs attache sélective aux cassures de l&#39;ADN à bouts francs avec 5&#39;OH (DNase II de type casse) 11,12, fluorescence leur étiquetage. La seconde, sans enzyme épingle formé après clivage oligonucléotidique, sera ligaturer à un 5&#39;PO 4 à extrémité franche rupture (DNase I type pauses) 11,12, si l&#39;ADN ligase T4 est présent dans la solution 13,14. Lorsque l&#39;ADN ligase T4 est ajouté à une coupe de tissu ou d&#39;une solution contenant de l&#39;ADN avec des 5&#39;PO 4 bouts francs pauses, la ligase réagit avec 5&#39;PO 4 extrémités d&#39;ADN, formant semi-stable enzyme-ADN. Les épingles à bouts francs vont interagir avec ces complexes libérant épingles ligase et lier de façon covalente à l&#39;ADN, ce qui étiquetage 5&#39;PO 4 cassures de l&#39;ADN à bouts francs. Ce développement illustre une nouvelle approche pratique pour ela conception électronique de machines moléculaires et offre un capteur utile pour la détection de l&#39;apoptose et endommagent l&#39;ADN dans les cellules et les tissus fixes.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Nous démontrons l&#39;assemblage et l&#39;application d&#39;un dispositif à l&#39;échelle moléculaire alimenté par une protéine topoisomérase. La construction est un capteur bio-moléculaires dont les étiquettes deux grands types de cassures de l&#39;ADN dans les coupes de tissus en attachant deux fluorophores différents à leurs extrémités.

Assemblage in vitro de la semi-artificielle machine moléculaire et son utilisation pour la détection de lésions de l&#39;ADN

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K vues.  Baylor College of Medicine. Nous démontrons l'assemblage et l'application d'un dispositif à l'échelle moléculaire alimenté par une protéine topoisomérase. La construction est un capteur bio-moléculaires dont les étiquettes deux grands types de cassures de l'ADN dans les coupes de tissus en attachant deux fluorophores différents à leurs extrémités.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Recherche

Bio-ingénierie

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisé de robotique Liquid Handling assemblage de dispositifs modulaires ADN

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthèse de cationisé Magnetoferritin pour magnétisation ultra-rapide des cellules

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

Construction et utilisation d’une chambre de Stimulation électrique pour renforcer la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymateuses/stromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Microarrays de bioparticules pour l’analyse chimiotaxique et moléculaire de l’ésaimage humaine de neutrophile in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.