Ce travail a été soutenu, en partie, par les National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS et RRM). Imagerie des cellules vivantes a été réalisée en Ressources Microscopie, Imagerie et cytométrie le Core pris en charge, en partie, par le NIH Centre de subvention P30 CA22453 à l&#39;Karmanos Cancer Institute, l&#39;Université Wayne State et par la Direction de la recherche périnatalogie de l&#39;Institut national de la santé infantile et le développement , Wayne State University.

1. Préparer DQ-substrats <ol><li> Laisser lyophilisé DQ-substrats se réchauffer à température ambiante avant ouverture des flacons, préparer la solution stock de 1 mg / ml de DQ-substrat dans de l&#39;eau déminéralisée, divisez en 50 aliquotes et conserver à 4 ° C. </li></ol> Il peut être nécessaire pour agiter DQ-substrat dans un bain d&#39;eau à ultrasons pour ~ 5 min et de la chaleur à 50 ° C pour faciliter la dispersion. <ol start="2"><li> FrP dégel sur la glace durant la nuit à 4 ° C; FrP doivent être manipulés sur la glace en tout temps. </li><li> Pour faire phosphate 10X solution saline tamponnée (PBS), dissoudre 80 g de NaCl (1,37 M), 2 g de KCl (0,027 M), 14,4 g de Na 2 HPO 4 (1 M), et 2,4 g de KH 2 PO 4 (0,02 M) dans 800 ml d&#39;eau ultra-pure. Ajuster le pH de la solution tampon PBS à 7,4 avec 1,0 M de HCl. Amener le volume à 1 litre, stériliser par filtration. </li><li> Préparer collagène de type I solution sur la glace: 8 pièces de collagène I réfrigérés pour 1 partie d&#39;eau glacée PBS 10X. Ajuster le pHde mélange à l&#39;aide 7.2 à 7.6 stérile 0,1 M de NaOH. Vérifier le pH avec des bandes de pH et ajuster le volume final à 10 parties avec de l&#39;eau stérile. </li><li> Préparer DQ-collagène I: matrice collagène de type I par dilution DQ-collagène I dans collagène I solution dans un tube refroidies à une concentration finale de 25 pg / ml et 2,4 mg / ml, respectivement. </li><li> Préparer DQ-collagène IV: membrane basale reconstituée (RBM) en diluant la matrice DQ-collagène IV dans FrP (Cultrex ou Matrigel) dans un tube à refroidies une concentration finale de 25 pg / ml et 12-15 mg / ml, respectivement. Mélanger sur la glace en utilisant un léger pipetage pour éviter de créer des bulles. </li></ol> 2. Préparer cocultures MAME Voir Figure 1 pour un schéma de co-cultures. <ol><li> Placez deux rectangulaires en plastique (des lamelles stérilisées dans l&#39;alcool à 70% pendant 10 min et séché à l&#39;air) dans une boîte de culture de 35 mm ou utiliser un ibiTreat 35 mm μ-vaisselle. Itinéraire ici sont pour les deux lamelles et microéquivalents Plats, que nous utilisons pour étudiantsmeurt sur un microscope droit. Pour les études sur un microscope inversé, nous utilisons uniquement microéquivalents Plats. </li><li> Mélanger le nombre souhaité de fibroblastes avec DQ-collagène de type I: collagène I matrice. Pour les co-cultures à long terme illustrés dans les figures 2 et 3, nous utilisons 500 fibroblastes dans 10 ul des médias, augmenté de 60 pi de DQ-collagène I: collagène I de la matrice. </li><li> Utiliser une micropipette de 100 pi, soigneusement la pipette et 70 pi de répandre des fibroblastes: DQ-collagène de type I: matrice de collagène de type I sur toute la surface de chaque lamelle et laisser à 37 ° C dans un incubateur humidifié sans CO 2 pendant 30 min à se solidifier. </li><li> Transfert de 35 mm contenant des lamelles plats à 37 ° C avec incubateur 5% de CO 2 pour 10 min de s&#39;équilibrer. </li><li> Retirer de l&#39;incubateur et de laisser les plats de 35 mm sous le capot jusqu&#39;à ce qu&#39;ils arrivent à la température ambiante. </li><li> Ajouter 60 ul de DQ-collagène IV: FrP matrice au sommet de l&#39;solidifié DQ-collagène de type I: matrice de collagène de type I avec des fibroblastes embarqués. Avec la pointe de pipette, carefully répandre DQ-collagène IV: FrP matrice uniforme, en évitant de rayer la fibroblastes: DQ-collagène de type I: collagène I matrice. </li><li> Transfert de 35 mm contenant des lamelles plats à 37 ° C avec incubateur 5% de CO 2 pour 10 min à se solidifier. Alors que la IV DQ-collagène: FrP matrice est la solidification, trypsiniser et compter les cellules épithéliales. </li><li> Placer 50 ul d&#39;une suspension de cellules épithéliales / tumeur sur des lamelles revêtu DQ-collagène IV: FrP matrice. Place de 35 mm plats contenant des lamelles dans un incubateur à 37 ° C. Laisser 40 à 60 min pour les cellules de se fixer à DQ-collagène IV: FrP matrice. Pour les co-cultures à long terme illustrés dans les figures 2 et 3, nous utilisons 2500 cellules épithéliales ou une tumeur. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de culture contenant FrP 2% à chaque plat de 35 mm. Si vous le faites tous les traitements médicamenteux, les médicaments devraient être ajoutés à ce moment. </li><li> Incuber pendant la période de temps désirée avant l&#39;imagerie. Pour cultures à long terme, les médias doivent être changés tous les 3-4 jours. Les cellules peuvent être maintenuesdans leur milieu de culture normale. Pour cocultures MAME de lignées de cellules mammaires, nous utilisons épithéliale milieu basal (MEBM-PRF) complémenté avec SingleQuots MEGM. </li></ol> 3. Effectuer 4D (3D + temps) de l&#39;imagerie en direct cocultures MAME par microscopie confocale <ol><li> Pour les études de preuve de principe illustré, cocultures MAME ont été marquées avec un colorant fluorescent suivi de cellules en fonction de notre procédure publiée 1. Après lavage avec du PBS, cocultures ont été incubées avec 5 Orange CellTracker uM dans un milieu MEGM pendant 45 min dans un incubateur à 37 ° C, lavées à nouveau avec du PBS et incubées avec MEGMmedium préchauffé pendant 30 min à 37 ° C avec 5% de CO 2 incubateur avant l&#39;imagerie . </li><li> Image cocultures MAME vivre à un faible grossissement (10X lentille d&#39;eau, trempage) sur un microscope Zeiss LSM 510 META-confocale. </li><li> Sections optiques sont capturées à des intervalles tout au long de toute la profondeur des structures. Pour nos études, nous capturons des sections optiques à 10intervalles um. </li><li> Utiliser les sections optiques pour reconstruire des images en 3D. Nous utilisons un logiciel pour générer Volocity reconstructions 3D. </li><li> Réalisez des films des reconstructions 3D de sorte que les structures, la cellule: les interactions des cellules et les interactions avec les matrices environnantes peuvent être visualisées. Nous avons fait des films avec le lecteur QuikTime 7. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Le cocultures MAME que nous avons développé sont un modèle souple expérimental pour imagerie des cellules vivantes en temps réel des interactions entre les différents constituants cellulaires qui composent une tumeur du sein et son microenvironnement. Ici, nous démontrons la capacité des modèles de MAME pour récapituler la cellule: les interactions cellulaires au cours de la progression du cancer du sein et de l&#39;imagerie des cellules vivantes pour suivre ces interactions au fil du temps. Nous illustrons la capacité à des interactions d&#39;image entre un préinvasif MCF10.DCIS sein lignée cellulaire humaine et un cancer du sein humain associé à la ligne des fibroblastes, WS-12TI, plus deune période de plus de trois semaines de culture. Le co-cultures ont été imagées à 3, 16 et 23 jours. Sections optiques à travers l&#39;ensemble du volume de la cocultures ont été reconstruits dans les exemples 3D et le représentant sont indiqués pour chacun des trois points dans le temps de la figure 2. La fluorescence rouge dans la figure 2 représente la MCF10.DCIS et WS-12TI cellules. Pour distinguer les deux types de cellules et à long terme cocultures, on peut transfecter ou transduire types cellulaires individuels avec des protéines fluorescentes avant d&#39;établir les cultures. Un co-culture de cellules MAME MCF10.DCIS et WS-12TI qui sont marquées de façon différentielle avec des protéines fluorescentes pour l&#39;identification est illustré à la Figure 3. En incorporant des substrats, dans ce cas-DQ collagènes, dans le cocultures MAME, nous pouvons évaluer et quantifier les changements au fil du temps dans la protéolyse associée à la transition vers un phénotype invasif. Nous avons établi des méthodes pour quantifier les produits de clivage fluorescents qui résultentà partir de DQ-collagène dégradation 2,3. On normalise les produits de dégradation dans tout le volume 3D de l&#39;cocultures MAME sur une base par cellule par marquage et de comptage noyaux cellulaires. En outre, on peut localiser la dégradation des compartiments intracellulaires et extracellulaires et de quantifier les produits de dégradation total, intracellulaires et extracellulaires comme nous l&#39;avons décrit précédemment 2. La fluorescence verte dans les figures 2 et 3 représente des produits de clivage des deux DQ-collagène substrats. A cette époque, les collagènes différentiellement marqués ne sont pas disponibles qui nous permettrait de faire la distinction entre la dégradation de collagène de type IV et de la dégradation du collagène de type. Les interactions dans le cocultures MAME sont dynamiques et peuvent changer au fil du temps. Pour obtenir de l&#39;information temporelle et dynamique, le même champ de vision peut avoir d&#39;autres sections de représentation et d&#39;optique prises par le spécimen du volume à plusieurs reprises sur une période de temps de quelques minutes à plusieurs semaines,ainsi la collecte des données en 4-D. Dans la figure 2, nous illustrons les changements assez spectaculaires qui se produisent plus de 23 jours: des changements dans le nombre de cellules, la migration cellulaire et les interactions cellulaires, les volumes, les formes de structure structure, les écarts des structures de la sphéricité, les excroissances envahissantes et la protéolyse. En outre, nous avons également démontrer un changement global de volume due à la dégradation de leur cocultures MAME entourant la matrice extracellulaire au cours de cette période. A trois jours comme illustré dans la figure 2A, le volume est 110000 um 3. En revanche, le volume de la cocultures MAME à 16 et 23 jours est seulement 46250 um 3, comme illustré dans les figures 2B et C <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de principe de co-cultures de MAME. Lamelle plastique est recouverte de collagène I, contenant DQ-collagène de type I et des fibroblastes (magenta). Une 2ème couche de la membrane basale reconstituée (RBM) contenant DQ-collagen IV est ajouté. Les cellules tumorales (rouge) sont plaqués sur le dessus et FrP 2% dans la culture des médias est superposée (points blancs) à chaque changement de médias. Le vert représente les produits de clivage fluorescentes de DQ-collagène I et IV. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig2.jpg" /> Figure 2. Cocultures de cellules MAME MCF10.DCIS mammaires humaines et WS-12TI fibroblastes mammaires humaines. Les fibroblastes ont été intégrés dans le collagène I / DQ-collagène de type I et recouverte d&#39;FrP contenant DQ-collagène IV. Les cellules ont ensuite été ensemencées CCIS sur le RBM et recouvert d&#39;un milieu contenant 2% FrP. Au cours des 23 jours de coculture illustrés ici, il y avait la prolifération cellulaire, la dégradation de la DQ-collagène IV et I (vert) et des matrices de collagène, comme indiqué par la réduction du volume de la cocultures. Les cellules ont été localisés par l&#39;étiquetage avec Orange CellTracker in situ avant d&#39;imagerie (rouge). Les cocultures mêmes vivants ont été observés au cours des 23 jours avec des images capturées par cmicroscopie onfocal à 3, 16 et 23 jours de coculture. Les tranches optiques résultant ont été reconstruites en 3D avec le logiciel Volocity. Grossissement, 10X. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3661/3661fig3.jpg" /> Figure 3. Cocultures MAME jour 16 de cellules mammaires humaines et MCF10.DCIS WS-12TI fibroblastes mammaires humaines qui expriment DP (rouge) et la YFP (blanc), respectivement. Cocultures ont été établies et analysées comme dans la figure 2. Les deux types de cellules présentées ici ont, cependant, été marqués de façon différentielle afin qu&#39;ils puissent être distingués les uns des autres. Les images agrandies plus élevés dans ce chiffre, par rapport à celles de la figure 2, illustrent la protéolyse de la DQ-collagène IV à la surface des cellules CCIS et la protéolyse diffuse de DQ-collagène de type I dans les zones proches des fibroblastes. Grossissement, 20X.

<ol>
	<li>Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+proteolysis:+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis.">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).</li><li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protease+activity+in+living+cells:+from+two+dimensions+to+four+dimensions.">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).</li><li>Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+hepatocyte+growth+factor+promotes+invasion+of+human+mammary+ductal+carcinoma+in+situ.">Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ.</a> Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+live-cell+imaging+demonstrates+that+beta1-integrin+promotes+type+IV+collagen+degradation+by+breast+and+prostate+cancer+cells.">Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells.</a> Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).</li><li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p21-activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer.">p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> Neoplasia. 10, 314-328 (2008).</li><li>Sameni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantifying+the+dynamics+of+tumor+associated+proteolysis.">Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).</li><li>Cavallo-Medved, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+demonstrates+that+proteases+in+caveolae+of+endothelial+cells+degrade+extracellular+matrix.">Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix.</a> Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).</li><li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microvasculature+and+microenvironment:+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models.">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Comme l&#39;a démontré, le co-cultures de MAME peut être utilisé pour imagerie des cellules vivantes en temps réel des interactions entre les différents constituants cellulaires qui composent une tumeur du sein et son microenvironnement. Dans les études en cours dans notre laboratoire, nous avons utilisé cocultures MAME pour identifier les voies protéolytiques associés à la transition à partir d&#39;un CCIS carcinome canalaire invasif, ainsi que les interactions entre les voies protéolytiques et d&#39;autre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Membrane basale reconstituée (Cultrex) </td><td> Trevigen </td><td> 3445-005-01 </td><td> Comparable à Matrigel (BD Biosciences) </td></tr><tr><td> Collagène de type I </td><td> Laboratoires de cohésion </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> DQ-substrats (Collagène de type I, IV) </td><td> Invitrogen </td><td> DQ-col I-D12060 DQ IV-col D12052 </td><td></td></tr><tr><td> 22-mm lamelles en plastique </td><td> Fisher Scientific Co. </td><td> 12-547 </td><td> Couper en deux, laisser dans l&#39;éthanol à 70% pendant 10 min et sécher à l&#39;air avant de l&#39;utiliser. </td></tr><tr><td> Milieu de culture cellulaire </td><td> Lonza </td><td> MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 </td><td> Le rouge de phénol libre </td></tr><tr><td> ibiTreat μ-vaisselle </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel Volocity </td><td> Perkin-Elmer </td><td> Version 5.5 </td><td> Les autres marques de logiciels d&#39;imagerie peut être utilisée pour générer des reconstructions 3D et les films. </td></tr></tbody></table>

mame models for 4d live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression

Nous avons développé des modèles 3D coculture, que nous appelons MAME (m ammary une rchitecture et m icroenvironment e NGÉNIERIE), et les a utilisés pour imagerie des cellules vivantes en temps réel de la cellule: les interactions cellulaires. Notre objectif global est de développer des modèles qui récapitulent l&#39;architecture des lésions mammaires préinvasives d&#39;étudier leur progression vers un phénotype invasif. Plus précisément, nous avons développé des modèles pour analyser les interactions entre les variantes du sein pré-malignes de cellules épithéliales et d&#39;autres types cellulaires de l&#39;microenvironnement de la tumeur qui ont été impliqués dans l&#39;amélioration ou la réduction de la progression des cellules mammaires épithéliales préinvasives à des carcinomes canalaires invasifs. D&#39;autres types cellulaires étudiés à ce jour sont des cellules myoépithéliales, les fibroblastes, les macrophages et les cellules sanguines et endothéliales lymphatiques microvasculaires. En plus des modèles de MAME, qui sont conçus pour récapituler les interactions cellulaires dans le sein au cours dela progression du cancer, nous avons développé des modèles comparables de la progression de cancers de la prostate. Ici, nous illustrons les procédures d&#39;établissement des cocultures 3D avec l&#39;utilisation de l&#39;imagerie des cellules vivantes et un dosage de la protéolyse fonctionnelle de suivre la transition de cocultures de cancer du sein canalaires in situ (CCIS) des cellules et des fibroblastes à un phénotype invasif dans le temps, ce cas plus de vingt-trois jours de culture. Le cocultures MAME constitués de couches multiples. Fibroblastes sont noyées dans la couche inférieure de collagène de type I. Qui est placé sur une couche de membrane basale reconstituée (RBM) sur lequel les cellules sont ensemencées CCIS. Une couche supérieure finale de la GAR 2% est inclus et réapprovisionné à chaque changement de médias. Pour la protéolyse image associée à la progression vers un phénotype invasif, nous utilisons colorant trempés (DQ) fluorescentes protéines de la matrice (DQ-collagène de type I en mélange avec la couche de collagène de type I et DQ-collagène IV mélangée avec la couche intermédiaire de RBM) et d&#39;observer les cultures vivantes en utilisant la microscopie confocale. Sections optiques sont capturés, traités et reconstruit en 3D avec un logiciel de visualisation Volocity. Au cours de 23 jours en cocultures MAME, les cellules prolifèrent et CCIS se fondent en de grandes structures envahissantes. Les fibroblastes migrent et sont incorporés dans ces structures envahissantes. Fluorescentes des fragments protéolytiques de les collagènes sont trouve en liaison avec la surface des structures CCIS, intracellulairement, et également dispersé dans la matrice environnante. Drogues que les voies protéolytiques cible, chimiokines / cytokines et de la kinase ou des modifications dans la composition cellulaire de la cocultures peut réduire le caractère invasif, ce qui suggère que les modèles de MAME peut être utilisé comme écrans précliniques pour de nouvelles approches thérapeutiques.

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MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Nous avons développé des modèles 3D pour coculture imagerie des cellules vivantes en temps réel des interactions entre cellules tumorales mammaires et d&#39;autres cellules dans leur microenvironnement que la progression d&#39;impact à un phénotype invasif. Ces modèles peuvent servir d&#39;écrans précliniques de médicaments afin de cibler paracrine induites par les voies protéolytiques, des chimiokines / cytokines et de la kinase impliqués dans envahissant.

Modèles de MAME pour 4D imagerie des cellules vivantes de la tumeur: Interactions microenvironnement Progression impact malin

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

mame-models-for-4d-live-cell-imaging-tumor-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

14.3K vues.  Wayne State University. Nous avons développé des modèles 3D pour coculture imagerie des cellules vivantes en temps réel des interactions entre cellules tumorales mammaires et d'autres cellules dans leur microenvironnement que la progression d'impact à un phénotype invasif. Ces modèles peuvent servir d'écrans précliniques de médicaments afin de cibler paracrine induites par les voies protéolytiques, des chimiokines / cytokines et de la kinase impliqués dans envahissant.

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Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

Orthotopique xénogreffe de l&#39;homme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test d&#39;agents thérapeutiques candidats

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Recherche

Médecine

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Évaluation de la migration des cellules souches du cancer utilisant compartimenter dispositifs microfluidiques et imagerie des cellules vivantes

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Hétérotypique tridimensionnelle<em&gt; In Vitro</em&gt; Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l&#39;initiation et la progression du cancer des ovaires

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Une tumeur au cerveau / organotypiques Slice système de co-culture pour l&#39;étude des tumeurs Microenvironnement et ciblée Thérapies de drogue

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Méthode tumeur Quantification bioluminescence-Basé pour Progression Surveillance de la tumeur et les effets de traitement dans les modèles de souris lymphome

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo l&#39;imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...