Nous tenons à remercier le Fonds de microscopie optique avancée à l&#39;Hôpital Princess Margaret, en particulier James Jonkman pour leur aide dans la configuration initiale de canaux sur le microscope 2Photon. Les auteurs tiennent à remercier le ciblage spatio-temporelle et l&#39;amplification du programme de rayonnement de réponse (STTARR) et ses organismes de financement affiliées. Nous remercions le Dr Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael Nagy et Dr.Andras pour alimenter les plasmides VEGFTrap et de leurs corrections manuscrites et des commentaires. Le soutien continu et la discussion du personnel de la BTRC a été précieux et nous tenons à commémorer Dr.Abhijit Guha pour son apport scientifique. Le travail a été financé par les IRSC et subventions du NIH.

Tous les travaux d&#39;animal a été réalisée sous soins aux animaux et COMITÉ DE L&#39;UTILISATION protocole approuvé et exécuté en CONFORMITÉ AVEC TOUTES LES LIGNES DIRECTRICES, les règlements et les organismes de réglementation. Pour le dépannage Tableau de référence 2. 1. Reconstitution de moelle osseuse (Facultatif) Figure 1 (30 min de préparation, 5 min par souris) Toute chirurgie doit être réalisée en utilisant une technique aseptique stricte avec du matériel stérile autoclave. Une souris donneuse va reconstituer trois souris d&#39;accueil. <ol><li> Anesthésier destinataire de la souris et de la situation NODscid, avec le plomb pour protéger la tête, à l&#39;intérieur du centre de l&#39;irradiateur Gammacell 40 &#39;exactor ». </li><li> Irradier souris NODscid avec 2,5 Gy d&#39;irradiation corporelle totale (TBI). </li></ol> CRITIQUE STEP: Optimisation de TBI peut être nécessaire en raison de la variation de la dose requise pour l&#39;hôte suffisante immunitaire CEll épuisement dans différentes souches de souris. point de Pause: souris d&#39;accueil peuvent être irradiés à l&#39;avance mais doivent être utilisés dans les 24 heures d&#39;irradiation. <ol start="3"><li> Euthanasier souris donneuses selon les directives du comité de protection des animaux. Nettoyez les membres postérieurs et enlever le tibia et le fémur à la fois, en éliminant tous les excès de tissu à partir des os (figures 1ai, 1aii). </li></ol> ÉTAPE CRITIQUE: os fibulaires sont pas viables pour une utilisation en raison de lumière très étroites. <ol start="4"><li> Retirer les plaques d&#39;extrémité des deux extrémités de quatre os extraites et les rincer à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 22 et 1 ml de PBS stérile jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient en apparence blanc (figure 1aiii). Tableau de référence 2. </li><li> Mélanger la moelle osseuse suspension extrait (BM) et à prélever 300 pi en trois aiguilles 27 G tuberculine. Extrait BM devrait contenir environ 2 x 10 7 cellules etest suffisant pour 3 souris hôte reconstitutions. Tableau de référence 2. </li><li> Injecter la suspension dans la veine caudale latérale de trois souris NODscid précédemment irradiés provenant de l&#39;étape 1.1 (figure 1b). Tableau de référence 2. </li></ol> ATTENTION: Pour vérifier la stérilité de la BM injecté nous vous recommandons de plaquer le reste de BM et de la culture pendant 24 heures pour vérifier infection. La principale cause de la mort à ce stade est l&#39;infection chez les souris nouvellement reconstitués. 2. Intracrânienne fenêtre Generation - Figure 2 (30 min par souris) Toute chirurgie doit être réalisée en utilisant une technique aseptique stricte avec du matériel stérile autoclave et sous une lampe chauffante pour garder les animaux au chaud (figure 2A). <ol><li> Anesthésier bénéficiaires souris NODscid avec IACUC approuvé anesthésie, l&#39;injection IP Avertin à 0,5 mg / g et sa position, avec le plomb pour protéger la tête, à l&#39;intérieur du centre de laGammacell 40 &#39;exactor&#39; irradiateur. Enlever les poils du cuir chevelu. En outre appliquer le gel lacrymogène pour empêcher la déshydratation cornée. </li><li> Cuir chevelu propre d&#39;abord avec une solution de Bétadine puis avec de l&#39;alcool, puis réaliser une incision du point milieu de l&#39;oreille au-dessus des yeux. Retirez le cuir chevelu 3 mm de chaque côté de la première incision, ce qui expose le crâne et les monuments de la surface du crâne (Figure 2Bi). </li><li> Élever le périoste par injection de lidocaïne 2%: solution d&#39;épinéphrine et de disséquer loin de la surface du crâne (Figure 2bii). </li><li> Utilisation de 2,7 mm trépan de forage, d&#39;affaiblir un cercle mm du crâne 2.7 sur le cortex de l&#39;hémisphère droit entre lambda et bregma. NE PAS pénétrer l&#39;os avec le forage (Figure 2biii). Tableau de référence 2. </li></ol> Étape cruciale: si forage traverse le crâne la surface du cerveau peut être endommagé résultats influencent supplémentaire avec trauma. En outre saignement excessif se produira prévenir une fenêtre claire d&#39;être générée. <ol start="5"><li> Retirez le volet osseux affaibli l&#39;aide de pinces à dissection et crochet dentaire et la force délibérée mais contrôlée (Figure 2biii). </li><li> (Facultatif) Si regardant pathologie tumorale, injecter des lignées de cellules tumorales choisies (avec le gène rapporteur fluorescent) dans le centre de la fenêtre générée à l&#39;étape 2.5. <ol><li> Charger 10 pl 30 G seringue Hamilton avec la suspension de cellules et de l&#39;aiguille de la charge dans un cadre stéréotactique. ÉTAPE CRITIQUE: Le nombre de cellules devra être optimisé pour les cellules tumorales dans l&#39;utilisation et la chronologie de la croissance nécessaire. Par U87 cultures, nous utilisons 2 x 10 5 cellules dans 10 ul par souris. </li><li> Charger la souris sur le cadre stéréotaxique numérique aligner l&#39;aiguille au point central de la fenêtre générée. </li><li> Basse aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;elle touche la surface corticale et réinitialiser les coordonnées du numérique. </li><li> Faibleer à l&#39;aiguille de 3,2 mm dans le tissu cortical et injecter à 3 mm de profondeur. </li><li> Rétracter l&#39;aiguille lentement puis retirez souris du cadre. ÉTAPE CRITIQUE: Injecter la solution sur la durée de 1 min et laisser l&#39;aiguille en suivant l&#39;injection de position pour assurer réduit le reflux. ÉTAPE CRITIQUE: Si hémorragie mineure est rencontrée irriguer avec une solution saline stérile pour 1-5 minutes pour arrêter le saignement superficiel. Procéder aux étapes suivantes. </li></ol></li><li> Humecter la surface du cerveau avec une goutte de PBS stérile pour maintenir le tissu cérébral irrigué. </li><li> Flotter à 3 mm lamelle sur la surface du cerveau pour sceller complètement autour de la fenêtre de 2,7 mm généré. Tableau de référence 2. </li><li> Crâne entourant totalement sec puis appliquer Vetbond à l&#39;ensemble du crâne exposé aux tissus du cuir chevelu refermer le crâne osseux et la lamelle en place. NE PAS appliquer un excès car il fuira sous la vitre et diminuer le potentiel de l&#39;imagerie. </li><li> Mix poudre fraîche acrylique dentaire et solution, environ 30% (p / v), et s&#39;appliquent sur le dessus de la Vetbond. Pour assurer une bonne étanchéité chevauche le acrylique légèrement sur ​​le bord lamelle de verre (Figure 2biv). Tableau de référence 2. </li></ol> ATTENTION: dentaire acrylique est extrêmement dangereux si nous recommandons l&#39;utilisation de gants et masque tout au long des procédures. ÉTAPE CRITIQUE: acrylique dentaire doit rester souple lors du moulage pour garantir une bonne étanchéité et de réduire les excès. Construire des acryliques sur la fenêtre seront floues les images. <ol start="11"><li> Permettre aux souris de récupérer dans une cage chaud. </li></ol> 3. rayonnement stéréotaxique (Facultatif) - Figure 3 (25 min par souris) Des variations existent dans les différents irradiateurs utilisés et que cette optimisation sera nécessaire. Nous avons utilisé un irradiateur conçu sur mesure. <ol><li> Anesthésier les sourisà l&#39;isoflurane à 4% pour l&#39;induction suivie de 1,5-2% tout au long de la procédure avec 0,5-1 litres O 2 a min, et le lieu sur limiteur de tête coutume à l&#39;intérieur du dispositif d&#39;irradiation stéréotaxique (Figure 3AI). </li><li> Obtenir un 360 ° à faisceau conique CT scan avec le tube à rayons X fonctionnant à 40 kV et 0,05 mA à travers un filtre en aluminium de 2 mm. Utiliser l&#39;image pour guider le mouvement de la scène, diriger le rayonnement isocentre à l&#39;hémisphère droit en s&#39;assurant qu&#39;il est central dans la direction ventrale dorsale. </li><li> Insérez le collimateur hémisphérique mm x bloc 8 de 11 mm. </li></ol> ÉTAPE CRITIQUE: collimateurs peuvent être conçus pour de nombreuses configurations différentes et peuvent donc être améliorées afin d&#39;inclure et d&#39;exclure les différentes parties du cerveau. 8 mm x 11 mm définit une zone hémisphérique du cerveau. <ol start="4"><li> Obtenir simples images orthogonales CT fois de haut (AP) et en bas (PA) à travers le collimateur pour améliorer encore la mise en place du cerveau, anatstructures osseuses omical peuvent être utilisés pour la reproductibilité. </li><li> Remplacez le filtre en aluminium pour un traitement 0.93 mm en cuivre filtrer et d&#39;administrer la moitié de la dose de rayonnement désiré avec le tube à rayons X fonctionnant à 225 kV et 13 mA par le haut dans une direction AP. </li><li> Retour portique à la position inférieure et à administrer la seconde moitié de la dose de rayonnement à nouveau avec le tube à rayons X fonctionnant à 225 kV et 13 mA forme le fond dans une direction AP. </li></ol> ÉTAPE CRITIQUE: Il est essentiel pour irradier à la fois le haut et le bas pour réduire le gradient RT à travers le tissu du cerveau, elle contribue également à l&#39;alignement de l&#39;isocentre au centre du cerveau. 4 In vivo à deux photons microscopie laser -. Figure 3 (1-3 heures par session) Des variations existent dans les différents microscopes utilisés et que cette optimisation sera nécessaire. Nous avons utilisé un Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning ConfocMicroscope al. <ol><li> Anesthésier les souris avec IACUC approuvé anesthésie, l&#39;injection IP Avertin à fenêtre 0,5 mg / g et propre à l&#39;aide de pulvérisation d&#39;alcool. </li><li><ol class="ualpha"><li> (Facultatif) Injecter marqués vasculaire 5-10 min colorant avant l&#39;imagerie, dans la veine de la queue avant l&#39;imagerie. Alexa647-Dextran utilisé à 0,35 pg / g ou APC-CD31 utilisé à 0,2 pg / g. Voir le tableau 2. </li><li> (Facultatif) Injecter fluorescéine via la veine de la queue à la dose de 7,7 mg / kg, 5 min avant de l&#39;imagerie, pour délimiter une tumeur. Tableau de référence 2. </li></ol></li><li> canaux de configuration sur le microscope confocal tel que déterminé par le fluorochrome utilisé chez la souris chimérique généré. Tableau 1 illustre les canaux décrits dans ce modèle. </li><li> Inverser la souris sur la platine du microscope mobile et stabiliser la tête en position de mouler la pâte à modeler. (Figure 3Aii) Tableau de référence 2. </li></ol> &lt;p class = &quot;de jove_content&quot;&gt; étape critique: La ICW doit être perpendiculaire au point du laser et en tant que tels doivent être positionnés horizontalement pour assurer la formation d&#39;image est optimale. <ol start="5"><li> Allumez le premier laser de canal et utiliser pour positionner au centre de l&#39;ICW. </li><li> Utilisez l&#39;objectif 5x et de prendre une image de la fenêtre entière à utiliser comme une carte pour des images de résolution plus élevées. </li><li> L&#39;imagerie doit être réalisée en utilisant des lentilles 20X «longue portée» 10X et d&#39;obtenir la meilleure qualité d&#39;image. </li></ol> CRITIQUE STEP: Canaux et objectifs sur le 2PLM devrait être mis en place en utilisant des cellules manipulées in vitro avant l&#39;imagerie des modèles murins de veiller à ce qu&#39;ils mettent en évidence la bonne fluorochrome. <table border="1"><tbody><tr><td> Fluorochrome </td><td> PCP </td><td> GFP / fluorescéine / FITC </td><td> mCherry / DP / DsRED </td><td> APC / Alexa647 </td><td> SHG Autofluorescence </td></tr><tr><td> laser d&#39;excitation </td><td> 458 nm </td><td> 488 nm </td><td> 543 nm </td><td> 633 nm </td><td> Chameleon laser 820 nm </td></tr><tr><td> Collection Filter </td><td> 480-520 nm </td><td> 500-550 nm </td><td> 565-615 nm </td><td> 650-710 nm </td><td> 390-465 nm </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Guides de configuration Fluorochrome. Pour l&#39;utilisateur de voir le laser d&#39;excitation et collecteur de spectres d&#39;émission utilisés pour chacun des canaux disponibles dans le modèle.

<ol>
	<li>Kienast, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+the+single+steps+of+brain+metastasis+formation.">Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation.</a> Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+observation+reveals+time-course-dependent+characteristics+of+tumour+vascularisation.">Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation.</a> Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).</li><li>Kherlopian, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+imaging+techniques+for+systems+biology.">A review of imaging techniques for systems biology.</a> BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).</li><li>Kedrin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nature Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).</li><li>Marker, D. F., Tremblay, M. -. E., Lu, S. -. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Thin-skull+Window+Technique+for+Chronic+Two-photon+In+vivo+Imaging+of+Murine+Microglia+in+Models+of+Neuroinflammation.">A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).</li><li>Drew, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).</li><li>Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in-vivo+analysis+of+normal+brain+response+to+cranial+irradiation.">High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation.</a> PLoS ONE. 7, e38366 (2012).</li><li>Tate, M. C., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+angiogenesis+and+invasion+in+glioma.">Biology of angiogenesis and invasion in glioma.</a> NURT. 6, 447-457 (2009).</li><li>Aghi, M., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+bone+marrow-derived+cells+to+blood+vessels+in+ischemic+tissues+and+tumors.">Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors.</a> Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).</li><li>Nussenbaum, F., Herman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+insights+and+innovations.">Tumor angiogenesis: insights and innovations.</a> J. Oncol. 2010, 132641 (2010).</li><li>Zhang, H. -. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+endothelial+progenitor+cells+into+the+neovasculature+of+malignant+glioma+xenograft.">Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft.</a> J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).</li><li>Blouw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxic+response+of+tumors+is+dependent+on+their+microenvironment.">The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment.</a> Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).</li><li>Du, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1alpha+induces+the+recruitment+of+bone+marrow-derived+vascular+modulatory+cells+to+regulate+tumor+angiogenesis+and+invasion.">HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion.</a> Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).</li><li>Rajantie, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+bone+marrow-derived+cells+recruited+during+angiogenesis+comprise+precursors+for+periendothelial+vascular+mural+cells.">Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells.</a> Blood. 104, 2084-2086 (2004).</li><li>Shin de Patil, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+lin(-)c-kit(+)Sca-1++stem+cells+do+not+contribute+to+vasculogenesis+in+Lewis+lung+carcinoma.">marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma.</a> Neoplasia. 7, 234-240 (2005).</li><li>Purhonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+circulating+endothelial+precursors+do+not+contribute+to+vascular+endothelium+and+are+not+needed+for+tumor+growth.">Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).</li><li>Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stromal-derived+factor-1+recruits+vascular+progenitors+to+mitotic+neovasculature,+where+microenvironment+influences+their+differentiated+phenotypes.">Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes.</a> Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).</li><li>Burrell, K., Zadeh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , (2012).</li><li>Thorball, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-dextran+tracers+in+microcirculatory+and+permeability+studies+using+combined+fluorescence+stereo+microscopy,+fluorescence+light+microscopy+and+electron+microscopy.">FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy.</a> Histochemistry. 71, 209-233 (1981).</li><li>Tolentino, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiography+of+fluoresceinated+anti-vascular+endothelial+growth+factor+antibody+and+dextrans+in+experimental+choroidal+neovascularization.">Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization.</a> Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).</li><li>Holash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Trap:+a+VEGF+blocker+with+potent+antitumor+effects.">VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).</li><li>Shinoda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-guided+resection+of+glioblastoma+multiforme+by+using+high-dose+fluorescein+sodium.">Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium.</a> , 1-7 (2003).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les trois canaux décrits dans toutes les images jusqu&#39;ici sont interchangeables pour les trois marqueurs de l&#39;intérêt dans d&#39;autres modèles et les feuilles des chercheurs avec un ensemble d&#39;outils précieux à chercher un nombreux types de cellules et les interactions. La planification est nécessaire pour s&#39;assurer que tous les marqueurs et les types cellulaires ont réussi à intégrer une molécule de fluorescence de journaliste dans un canal distinct. En plus des trois canaux standard utilisés ici, nous avons également pu intégrer un quatrième canal PCP (figure 4A) et une base de collagène SHG canal 7 (figure 4B). Cela étend la possibilité de regarder les interactions cellulaires in vivo et permet en outre l&#39; utilisateur de procéder à mélanger pour étudier les interactions cellules-cellules spécifiques tout en conservant deux canaux pour d&#39;autres marqueurs population. Par exemple, nous avons examiné les cellules tumorales (DP) et les cellules souches du cancer (PCP) dans un rapport de 1:3 avec un intérêt de comparer leur intratuminteractions orales (figure 4A). Nous avons observé que sept jours après l&#39;implantation de la population mixte, le rapport a été confirmée et les deux populations cellulaires pourrait encore être vu. Le canal PCP offre problèmes techniques en raison du chevauchement avec le canal de la GFP dans les deux spectres d&#39;excitation et d&#39;émission et en tant que tels nécessite un traitement post-imagerie pour définir le vrai PCP + cellules de ceux qui sont réellement GFP +. Le traitement post imagerie peut être effectuée sur les microscopes à 2 photons construits dans le logiciel Zeiss LSM directement par lequel, l&#39;image GFP est soustraite de l&#39;image PCP entraîne les véritables cellules de la PCP étant laissés (figure 4A). La prémisse pour le rapport soustraction dépend également des images lumineuses et est dû au laser CFP (458 nm) fluorescent à la fois de la PCP et cellules GFP tandis que le laser GFP (488 nm) est trop élevé pour fluorescence des cellules de la PCP. En plus de la PCP, nous avons également été en mesure d&#39;utiliser les configurations précédemment publiés pour regarder la SHGniveaux et ainsi dépeindre les fibres de collagène qui forment la membrane basale entourant vasculaire (figure 4B). Une autre adaptation de ce modèle a profité d&#39;un petit irradiateur animale construite sur mesure qui a la capacité d&#39;utiliser un rayonnement stéréotaxique guidée pour irradier des coupes de tissu aussi petit que 2 mm de diamètre. En ciblant la fenêtre avec l&#39;irradiation, il est possible de regarder le rayonnement de l&#39;effet a sur le tissu sous-jacent. Nous avons récemment publié une étude sur le rayonnement de l&#39;effet a sur le tissu cérébral normal en ce qui concerne le recrutement de BMDCs au système vasculaire, portant spécifiquement sur leur rôle dans les changements de tissus post-irradiation. Nous avons constaté que le recrutement des BMDCs était à la fois du temps et dose-dépendante dans les tissus normaux 11. Il est possible d&#39;étudier les mécanismes de prestation et l&#39;intégration de produits thérapeutiques qui fournissent la drogue est marqué avec un marqueur fluorescent. Au cours denotre recherche, nous avons été en mesure de suivre la production de VEGFTrap, un médicament anti-angiogénique qui bloque toute la signalisation du VEGF dans la région de production 25. En modifiant génétiquement les cellules tumorales pour exprimer le gène de VEGFtrap couplé avec un IRES à EGFP (Figure 4CI) et l&#39;utilisation de DP «donneur» BM nous avons réussi à l&#39;image de la EGFP: production de VEGFtrap, interaction BMDC et vasculaire simultanément (Figure 4Cii). Cela a démontré la polyvalence du modèle et de canaux disponibles. Il est également possible de regarder la cinétique de la drogue en raison de la promesse d&#39;une seule cellule de résolution. Fluorescéine (GFP +) est utilisée pour délimiter les tumeurs pendant une intervention chirurgicale afin d&#39;assurer la résection maximale est atteinte 26. En injectant par voie intraveineuse imagerie alors qu&#39;il est possible de démontrer que la délimitation se produit pas par l&#39;absorption active de la fluorescéine dans les cellules tumorales elles-mêmes, mais plutôt grâce à la collecte de la drogue dans le domaine du stroma avec time, vu le manque de co-localisation 10 min après l&#39;injection de la fluorescéine (figure 4D). Dans l&#39;ensemble notre stratégie combine des techniques nouvelles et existantes pour atteindre une plate-forme expérimentale unique, ce qui est avantageux pour l&#39;étude des interactions cellulaires dynamiques. Cette stratégie s&#39;est avérée être une approche précieuse pour l&#39;examen haute résolution évolution dynamique unicellulaire de BMDC, la vascularisation de la tumeur cérébrale normale et en réponse à la thérapie, intracrânienne. Imagerie intravitale peut fournir une meilleure compréhension des régulateurs moléculaires de recrutement BMDC, la migration et la différenciation dans intracrânienne cerveau vascularisation de la tumeur ainsi que de nombreux autres processus dynamiques adaptables à d&#39;autres domaines de recherche. Présumés facteurs inhibiteurs qui régulent BMDC en combinaison avec d&#39;autres stratégies thérapeutiques peuvent aider à l&#39;identification de la synchronisation précise des thérapies combinatoires. En outre, cette stratégie peut être adaptée à de nombreux avenir projets en utilisant non seulement in vivo colorants coloration vitale, mais aussi de petits inhibiteurs et des nanoparticules qui sont marqués par fluorescence permettant aux chercheurs de retracer la répartition et la migration des thérapeutiques plus ciblées ainsi que regarder longitudinalement à leur cinétique moléculaire.

Une meilleure compréhension des changements structurels et biologiques qui surviennent dans le cerveau en réponse à différentes pathologies et des interventions thérapeutiques est essentielle pour améliorer les stratégies de traitement. Cependant, l&#39;un des défis actuels dans l&#39;étude de ces changements structurels et biologiques, en particulier en ce qui concerne les pathologies intracrâniennes, est l&#39;inaccessibilité du tissu et de l&#39;incapacité d&#39;étudier l&#39;évolution temporelle et la progression dynamique des changements dans un cadre en vivo. La génération de la technologie «fenêtre» a déjà fait ses preuves dans l&#39;examen des modifications des tissus mous à travers le développement de tumeurs 5-7. Développement de modèles ICW s&#39;avère techniquement plus difficile, en raison de la nécessité de retirer l&#39;os du crâne sans endommager le instigateur infection dans le tissu cérébral sous-jacent. Les articles précédents ont tenté d&#39;éclaircir le crâne de visualiser les 8-10 tissulaires cependant, pour produire de haute im clair de résolutionâges élimination complète de l&#39;os du crâne est nécessaire 11. Répéter à long terme d&#39;imagerie (30 jours +) n&#39;est devenue que récemment une option réalisable grâce à l&#39;imagerie 1,11, des délais plus courts précédemment ont été étudiés 5. Au cours de la dernière décennie, un objectif majeur a été d&#39;élucider l&#39;origine de la néo-vascularisation stimuli pathologiques suivants, en particulier en réponse à la formation et la progression tumorale, de fournir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des tumeurs. Une grande controverse demeure autour de la source de la nouvelle vasculaire dans le cerveau au cours du développement tumoral ou la radiothérapie suivant. Traditionnellement vascularisation a été considéré à se produire à travers l&#39;angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux se forment à partir de la germination de vaisseaux préexistants 12. Des études plus récentes suggèrent cependant que le processus embryonnaire pris précédemment de vasculogénèse peut jouer un rôle plus important dans la formation du système vasculaire pathologique. Vasculogenesis implique le recrutement des homologues ANGIOBLAST adultes de la moelle osseuse qui à leur tour sont alors directement impliqués dans la formation de nouveaux endothélium des vaisseaux 12-14. L&#39;accumulation des données indique que les cellules précurseurs de cellules endothéliales sont mobilisés à partir de la moelle osseuse pour initier la formation de vaisseaux de novo en réponse à des médiateurs oncogènes 15-17. Cependant, ces études fournissent des preuves contradictoires de la contribution directe de ces cellules dérivées de la moelle osseuse (BMDCs) à l&#39;endothélium des vaisseaux avec la contribution de pourcentage variant selon le type de stimulus pathologique et la réponse au traitement 18-21. Par conséquent, l&#39;établissement de méthodes expérimentales reproductibles qui permettent l&#39;imagerie intravitale haute résolution pour répéter étude à long terme du processus d&#39;intégration BMDC dans la vascularisation tumorale et la réponse au traitement est inestimable. Techniques histologiques standard ne parviennent pas à fournir l&#39;information dynamiqueinformations nécessaires pour déterminer la survie à long terme, la différenciation et l&#39;intégration des cellules qui donnent lieu à des néovaisseaux et ne peut donc pas démontrer définitivement les mécanismes d&#39;interaction cellulaire. Nous avons montré par notre approche expérimentale qu&#39;il ya un degré variable de recrutement BMDC après deux rayonnements ionisants intracrânienne et la croissance de la tumeur, un recrutement qui est cependant, le site pathologie spécifique et non une invasion de l&#39;ensemble du tissu intracrânienne 11,22. Nous avons montré que le recrutement suit une tendance sensible à la fois démontrée par l&#39;imagerie répétée d&#39;un seul animal 11,22. De même, l&#39;imagerie in vivo peuvent également fournir des indications précieuses sur le mimétisme des cellules tumorales par lequel les cellules tumorales marquées par fluorescence peuvent être visualisés et suivis avec un anticorps intra-vital CD31 pour les cellules endothéliales de mettre en évidence la possibilité de transdifférenciation des cellules tumorales pour former directement sa propre endothélium. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La polyvalence du modèle est renforcée par la capacité de l&#39;image 4 canaux fluorescents, fournissant un nombre exhaustif de combinaisons pour l&#39;étude des différents processus cellulaires et biologiques. Nous sommes en mesure de intravitally l&#39;image CFP (bleu), la GFP (green), Cerise / DP (rouge), et Alexa647/APC (rouge lointain), simultanément dans un seul champ à plusieurs reprises au fil du temps. Les chercheurs peuvent modifier génétiquement les cellules d&#39;exprimer fluorochromes pour chacun des canaux ainsi que des colorants d&#39;achat et d&#39;anticorps pour mettre en évidence les changements structurels d&#39;un intérêt particulier. À ce jour, les colorants et les anticorps couramment utilisés dans les études comprennent CD31 et le dextran qui soulignent tous deux la microvascularisation et ses changements dans le tissu 1,11,23,24, même si nous avons utilisé le canal rouge lointain à cet effet les deux sont disponibles pour une utilisation dans l&#39;autre canaux mentionnés. De même, d&#39;autres colorants dont Sytox Orange, qui mettra en évidence les domaines de l&#39;apoptose et des marqueurs tels que ceux de la société Visen, ont été spécialementquement conçu pour une utilisation in vivo. Outre les quatre canaux fluorescents couramment utilisés mentionnés, un second canal de génération d&#39;harmoniques (SHG), peut être ajouté et optimisé pour imager les fibres de collagène endogènes du modèle 7, visualisant la membrane basale environnante vasculaire. Pour démontrer l&#39;adaptabilité de notre modèle, ainsi que les interactions entre cellules mentionnées ci-dessus, nous avons pu étudier les interactions des cellules de la drogue. Nous avons examiné les inhibiteurs de la drogue comme AMD3100, un inhibiteur de SDF-1, et son rôle dans les réseaux de signalisation impliquées dans le recrutement BMDC 11. De même, nous avons modifié génétiquement des cellules de gliome U87 xénogreffes d&#39;exprimer VEGFTrap, un inhibiteur de VEGF 25, conjointement par un IRES à une molécule de GFP. En utilisant DP + BM nous sommes en mesure d&#39;étudier le rôle du VEGF a sur le recrutement de BMDCs au système vasculaire. Plus récemment, nous avons utilisé le modèle pour étudier la cinétique de la drogue en regardant le mechanism derrière le médicament fluorescéine tumeur délimitant 26, au niveau cellulaire. Grâce à l&#39;utilisation d&#39;une mesure construite en petite maison irradiateur animal que nous avons pu intégrer radiation délivrée stéréotaxique pour évaluer la réponse à la fois la tumeur et BMDCs au traitement. Grâce à l&#39;utilisation de notre méthode de nouveaux chercheurs en imagerie intravitale se faire une idée des changements unicellulaires en temps réel qui se produisent dans diverses pathologies et des systèmes, facilitant l&#39;élucidation de nombreuses caractéristiques fonctionnelles et biologiques des changements dans les tissus.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NODSCID mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td>8 week old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B5/EGFP Mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>003516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB/DsRED mice</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>005441</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tear Gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>T296/2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Lidocaine-Epinephrine</td>
			<td>Bimeda MTC</td>
			<td>25SP</td>
			<td>Use neat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self curing acrylic kit</td>
			<td>Bosworth</td>
			<td>166260</td>
			<td>Use ~30% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MW Dextran-Alexa647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Use @ 0.6 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-APC</td>
			<td>BDPharmingen</td>
			<td>551262</td>
			<td>Use @ 0.3 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AK-fluor (Fluorescein) 10%</td>
			<td>AKORN inc.</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>Use @ 7.7 mg/kg in Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Purdue Products</td>
			<td>NDC 67618-150</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Dissection Scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25870-002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G 0.5 ml TB syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Micro-Drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.7 mm Trephine drillbit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18004-27</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l 30G Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>20909-U</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslip 3 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720 CS-3R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence goggles</td>
			<td>BLS</td>
			<td>FHS/T01</td>
			<td>Basic head frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>stoelting</td>
			<td>51950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer for IV injection</td>
			<td>Brain Tree Lifescience</td>
			<td>MTI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics

Nous avons intégré avec succès précédemment établi intracrânienne fenêtre (ICW) 1-4 technologie avec intravitale microscopie confocale à 2 photons de développer une nouvelle plate-forme qui permet la visualisation directe à long terme des changements dans la structure des tissus intracrânienne. Imagerie à une résolution de cellule unique dans un mode en temps réel fournit des informations supplémentaires dynamique au-delà de celle fournie par l&#39;analyse histologique point terminal standard, qui est uniquement au niveau de sections transversales &quot;instantané&quot; de tissu. L&#39;établissement de cette technique d&#39;imagerie intravitale chez les souris chimériques fluorescentes, nous sommes en mesure d&#39;images fluorescentes quatre canaux simultanément. En incorporant les cellules marquées par fluorescence, comme la GFP + de la moelle osseuse, il est possible de suivre le destin de ces cellules qui étudient leur migration à long terme, l&#39;intégration et la différenciation au sein du tissu. Poursuite de l&#39;intégration d&#39;une cellule de rapporteur secondaire, tel qu&#39;une ligne de tumeur mCherry gliome, permet une caractérisationtrage de la cellule: les interactions cellulaires. Les changements structurels dans le microenvironnement tissulaire peuvent être mis en évidence grâce à l&#39;ajout de colorants et d&#39;anticorps intra-vitales, par exemple CD31 des anticorps marqués et molécules de dextran. En outre, nous décrivons la combinaison de notre modèle d&#39;imagerie ICW avec un animal petit micro-irradiateur qui fournit irradiation stéréotaxique, la création d&#39;une plate-forme à travers laquelle les changements des tissus dynamiques qui se produisent après l&#39;administration de rayonnement ionisant peuvent être évaluées. Les limites actuelles de notre modèle sont pénétrance du microscope, qui est limitée à une profondeur de 900 um à partir de la surface sous cortical, ce qui limite l&#39;imagerie à l&#39;axe dorsal du cerveau. La présence de l&#39;os du crâne rend la ICW une procédure technique plus difficile, par rapport aux modèles de la chambre plus établies et utilisées actuellement utilisées pour étudier les tissus mammaires et coussinets adipeux 5-7. En outre, la ICW provides de nombreux défis lors de l&#39;optimisation de l&#39;imagerie.

L&#39;étape facultative de la reconstitution de la BM de souris NODscid devrait se traduire par une absorption de 80% de la fluorescence «donneur» BM dans 100% des souris du NODscid «d&#39;accueil», cependant optimisation du TBI sera nécessaire pour améliorer la reconstitution dans d&#39;autres non souches-immunocompromsed. Si les souris sont reconstitués en vain, ils tombent malades et meurent rapidement après la procédure, les souris affaiblis peuvent nécessiter des suppléments de nourriture et d&#39;eau. L&#39;ICW une fois terminé devrait ressembler à celle observée dans la figure 2biv. Il est idéal d&#39;avoir une crête de l&#39;acrylique entourant la lamelle de verre car cela donne de la force à la jointure avec le crâne. Fenêtres parfaites sont reproductibles et permettent l&#39;imagerie répétée jusqu&#39;à 8 semaines après leur génération (figure 2C). Images produites par ces fenêtres optimales vont regarder que ceux observés dans la figure 3Bi. Imperfections dans la génération de fenêtre de produire des images de mauvaisela qualité par exemple, des bulles d&#39;air sous la fenêtre empêcher des champs entiers de vue étant imagé, zones apparaîtront plus sombres que l&#39;air empêche l&#39;imagerie laser (Figure 3bii). Grâce à l&#39;excès de colle et acrylique sur la lamelle, il y aura un haut niveau de fond fluorescence et zones du champ étant effacé comme on le voit dans la figure 3Biii, même s&#39;il ya de la saleté sur la petite fenêtre des points de fluorescence de fond seront visibles sur le terrain (Figure 3Biv). Le succès de l&#39;imagerie ICW est prédéterminé par l&#39;intégrité de la technique chirurgicale, cependant, même ICWS optimales peuvent rencontrer des problèmes lors de la session d&#39;imagerie. En tant que tel, un éventail et le degré de clarté existe dans les images générées comme on le voit sur ​​la figure 3. L&#39;image de la qualité des publications illustrées dans la figure 3C se produit lorsque tout est optimal. Même s&#39;il n&#39;est pas possible pour toutes les souris, il est possible de s&#39;attendre à 80% de l&#39;images généré à ressembler à ceci. L&#39;un des défauts majeurs dans la configuration de la microscopie actuelle est l&#39;utilisation de lasers inversées. Les souris doivent être positionnés sur le dos et cela se traduit par un stress excessif et l&#39;inconfort qui peut conduire à des difficultés respiratoires au cours de l&#39;imagerie. Cela produit une image «bordée», comme la respiration interfère avec la moyenne qui se produit au cours de l&#39;imagerie, de sorte que, chaque rangée de pixels est représenté quatre fois et la moyenne des quatre est affichée dans l&#39;image finale. Tout mouvement au cours de la moyenne, comme celle causée par une respiration difficile, va créer un artefact qui apparaît comme une ligne sur l&#39;image, comme on le voit dans la figure 3D. Les souris qui sont insuffisamment anesthésiés pendant l&#39;imagerie peuvent rencontrer ce problème également. L&#39;effet «doublé» peut être réduite en limitant l&#39;image moyenne de sur, mais ce sera à son tour de réduire la qualité de l&#39;image et ne peut pas éliminer le problème. Sinon souris peuvent être repositionnés ou rejugés lors de la respiration s&#39;est normalisée. L&#39;utilisation of un 2PLM verticaux annulerait ce problème que les souris pourraient être imagées »dans la position couchée. Un autre problème avec l&#39;imagerie sur une 2PLM inversé comprend l&#39;accessibilité limitée pour le positionnement de la ICW une fois que la souris est sur ​​le microscope, et cela conduit à des images «segmentés» comme ceux vus à la figure 3E. Ici, le laser et la lamelle ne sont pas positionnées perpendiculairement les unes aux autres et en tant que tel se produit la formation d&#39;image à un angle. Cela se traduit par la génération d&#39;une image «segmenté» où les côtés du champ de vision ne sont pas imagés. Le problème se résout facilement avec le repositionnement de la souris afin d&#39;assurer la lamelle est complètement à l&#39;horizontale une fois sur la tête de montage comme le montre la figure 3Aii. Le modèle présenté ici a été spécifiquement utilisé pour examiner le rôle des BMDCs dans la vascularisation du tissu tumoral et démontre la capacité d&#39;utiliser trois canaux différents simultanément (Cherry, la GFP, l&#39;Extrême-rouge - Alexa647 et APC) making la PCP et redondant SHG pour cette histoire particulière. Nous avons pu souris d&#39;image longitudinalement pour jusqu&#39;à 8 semaines, en étudiant le recrutement et l&#39;intégration des cellules de BM dans le système vasculaire au niveau de la cellule unique, sans effets néfastes causés par la fenêtre. Ce modèle démontre la facilité de collecte des informations dynamiques sur la source et la formation de la vascularisation et l&#39;interaction des différents types de cellules d&#39;intérêt, précédemment perdus par le point analyse histologique final. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Problème </td><td> Raisonnement </td><td> Solution </td></tr><tr><td> 1.4 </td><td> Os briser </td><td> Outils émoussés </td><td> Recueillir la moelle osseuse former une souris fraîche avec des ciseaux pointus ou lame de scalpel frais, des fragments d&#39;os vont inhiber injection de télévision </td></tr><tr><td> 1.5 </td><td> Basse extraction (faible viscosity) </td><td> plateaux d&#39;os coupés trop distale, une mauvaise méthode de collecte </td><td> Bones doivent être coupés comme proximale que possible et prélevés avec l&#39;os à l&#39;intérieur de tube de prélèvement pour éviter dosseret Temps devrait être consacré à extraire la BM au maximum et avec soin Si nécessaire piscine plus d&#39;une souris dans 1 ml </td></tr><tr><td></td><td> Haute Extraction (haute viscosité) </td><td> Tampon de basse collection </td><td> Diluer la solution avec supplémentaire de 0,1% de BSA, split de trois souris receveuses jusqu&#39;à 500 pi par maximale de la souris </td></tr><tr><td> 1.6 </td><td> L&#39;injection intraveineuse Bad </td><td> Mauvais vasodilatation et la visibilité de la cuve </td><td> Améliorer la dilatation avec lampe chauffante. Placez la souris dans la veine caudale restrainer avec construit dans la source de lumière pour faciliter l&#39;accès </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Souris malades </td><td> Infection </td><td> Sacrifier les souris selon les règles de l&#39;institution. Assurez-queues sont nettoyés avant l&#39;injection et vérifier la stérilitéextrait du BM dans la culture </td></tr><tr><td></td><td> Les souris meurent </td><td> Mauvais BM absorption </td><td> Vérifiez% de l&#39;absorption BM fluorescent de souris morte. Optimiser TBI pour la souche de souris utilisées Augmenter quantité d&#39;injection BM (par exemple l&#39;utilisation d&#39;une souris des bailleurs de fonds pour deux destinataires) </td></tr><tr><td> 2.4 </td><td> Hémorragie mineure </td><td> Dura a manqué pendant le forage </td><td> Pression avec coussinets de gel et de lavage et une solution saline stérile continue </td></tr><tr><td></td><td> Major hémorragie </td><td> Cerveau endommagé par forage </td><td> Sacrifiez souris selon les directives de l&#39;institution </td></tr><tr><td> 2.8 </td><td> Les bulles d&#39;air sous la lamelle </td><td> Mauvais contact avec la surface corticale empêche bon placement </td><td> Retirer la lamelle et ajouter supplémentaire PBS flotter la lamelle sur la fenêtre pour enlever les bulles </td></tr><tr><td> 2.10 </td><td> Le glissement de la lamelle lors du collage </td><td> Acrmasse ylic est lourd, exerce une pression sur la lamelle et déplace la lamelle sur la manière </td><td> Pince à épiler doit être utilisé pour maintenir la lamelle vers le bas tout Vetbond et acrylique est appliquée </td></tr><tr><td> 4.2 </td><td> L&#39;injection intraveineuse Bad </td><td> Mauvais vasodilatation et la visibilité de la cuve </td><td> Améliorer la dilatation avec lampe chauffante. Placez la souris dans la veine caudale restrainer avec construit dans la source de lumière pour faciliter l&#39;accès </td></tr><tr><td> 4.4 Figure 3C </td><td> Images «doublés» </td><td> Travaillé ou respiration irrégulière </td><td> Retirer souris à partir de châssis et permettre de récupérer Augmenter le niveau d&#39;anesthésique administré et ajuster la position pour assurer cou n&#39;est pas trop fléchi ou étendu à empêcher la respiration </td></tr><tr><td> Figure 3C </td><td> Image »sectorielle» </td><td> Cerveau n&#39;est pas parallèle aux objectifs </td><td> Ajustez la position de la lamelle afin de s&#39;assurer qu&#39;elle est plate </td></tr><tr><td></td><td> Navire pas visualisé </td><td> injection intravasculaire pas vu </td><td> Refaire l&#39;injection dans la veine caudale de remplacement, la queue chaud pour assurer une bonne vasodilatation </td></tr><tr><td></td><td> Bruit de fond élevé </td><td> Sale lamelle, bulles d&#39;air, Acrylique </td><td> Essuyer avec un chiffon humide lamelle d&#39;éthanol à 70%, ne pas tremper comme on peut pénétrer sous acrylique et endommager le tissu cérébral </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Dépannage. Un guide pour les étapes correctives nécessaires pour les zones problématiques des procédures. <img alt="Les schémas 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363schemata1.jpg" /> Les schémas 1. Diagramme expérimental. Cela démontre la chronologie des événements à travers les étapes expérimentales 1-4. Des modèles murins sont configurés sur une semaine, àassurer la BM reconstitue correctement, et ne sont pas traités avec le médicament jusqu&#39;au jour 7 de la tumeur pour s&#39;assurer que les greffes tumorales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363schemata1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig1.jpg" /> Figure 1. Reconstitution BM. (A) Procédure d&#39;extraction BM i. Dissection des os des membres postérieurs. Ii. Fémur disséqué et le tibia des membres postérieurs, nettoyé et prêt pour l&#39;extraction. Iii. Bones avec plaque d&#39;extrémité enlevé et rincé à travers, ce qui démontre l&#39;aspect blanc des os vides. (B) Les schémas montrant où nervures latérales pour injection sont positionnés dans la queue. <p class="jove_content" fo:keep-together.withinPage = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig2.jpg" /> Figure 2. Génération ICW. (A) est configuré aseptique recommandé (B) i. Surface du crâne exposé révèle les repères nécessaires pour la chirurgie, ICW doit être placé sur l&#39;hémisphère droit à égale distance du bregma et lambda. Ii. Periostieum levé avec une solution de lidocaïne, prêt pour l&#39;enlèvement . iii. crochet dentaire requis pour le retrait du fragment d&#39;os généré avec la perceuse. iv. Fini ICW à l&#39;acrylique dentaire. (C) Trois fenêtres par exemple démontrer la reproductibilité de la méthode. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig3.jpg" /><br/&gt; Figure 3. 2PLM résultats escomptés. Toutes les images montrent vert BM, tumeur rouge, bleu (pseudo couleur rouge lointain) vascularisation. (A) i. Démontre le cadre de la tête qui retient flux isoflurane à l&#39;intérieur de la petite irradiateur animal. Le 8 x 11 mm collimateur peut aussi être vu se déplacer à travers le portique. Ii. La souris dans le inversé positionné dans le cadre de la tête requis pour l&#39;imagerie, plastercine malléable assure toutes les fenêtres peuvent être accueillis. (B) Photos démonstratifs des résultats de problèmes avec la génération de la fenêtre à partir de i. une fenêtre optimale, ii. une fenêtre avec des bulles d&#39;air emprisonnées sous, déversement acrylique iii sur la lamelle et iv. saleté sur la fenêtre elle-même. (C) souligne les problèmes qui surviennent avec l&#39;imagerie après génération réussie d&#39;un ICW i. optimal imagerie ii artefacts. respiratoirescréer une image «doublé» iii. lamelle pas perpendiculaire au laser génère une image «segmenté». <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50363/50363fig4.jpg" /> Figure 4. Emplois fonctionnels et les adaptations du modèle. (A) le traitement d&#39;imagerie poste CFP par lequel l&#39;image GFP est soustraite de l&#39;image CFP pour révéler l&#39;image de la PCP vrai que peuvent être superposées les trois autres canaux en blanc. Vert BM, tumeur rouge, blanc CSC, Bleu (pseudo couleur rouge lointain) vasculaire (B) la démonstration des fibres de collagène qui peuvent être imagées avec SHG. cellules VEGFTrap dans vitr vert Dextran, rouge BM, Cyan collagène (C) i.o démontrer le signal de GFP produite avec le VEGFtrap. ii. imagerie in vivo démontre les cellules VEGFtrap clairement et en plus met en lumière la facilité de changer de canal pour démontrer le système que vous regardez. VEGFTRap vert + tumorale, Red BM, Bleu (pseudo couleur rouge lointain) vascularisation. (D) montre la collection de fluorescéine dans le stroma de la tumeur et non dans les cellules directement, illustré par l&#39;absence de signal vert superposition avec une tumeur rouge. Vert fluorescéine, une tumeur rouge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50363/50363fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics at JoVE.com

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

Nous décrivons un roman<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie que les couples de souris chimériques fluorescentes avec des fenêtres intracrâniennes et à haute résolution de la microscopie 2 photons. Cette plate-forme d&#39;imagerie études sur le sida de changements dynamiques dans le tissu cérébral et microvasculaire, au niveau d&#39;une seule cellule, à la suite des insultes pathologiques et est adaptable à évaluer l&#39;administration de médicaments intracrânienne et de distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

a-novel-high-resolution-vivo-imaging-technique-to-study-dynamic

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

11.4K vues.  Hospital for Sick Children, Toronto Medical Discovery Tower. Nous décrivons un roman In vivo Technique d'imagerie que les couples de souris chimériques fluorescentes avec des fenêtres intracrâniennes et à haute résolution de la microscopie 2 photons. Cette plate-forme d'imagerie études sur le sida de changements dynamiques dans le tissu cérébral et microvasculaire, au niveau d'une seule cellule, à la suite des insultes pathologiques et est adaptable à évaluer l'administration de médicamen...

Vidéo: A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Recherche

Médecine

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Implantation intracrânienne avec 3D ultérieures In Vivo Bioluminescent imagerie des gliomes murin

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La mesure et le traitement de répression dans l&#39;amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Technique Gene Transfer et<em&gt; In vitro</em&gt; Essais cellule sur la base de l&#39;étude de la perte osseuse dans les troubles musculo-squelettiques

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Visage axotomie des nerfs chez la souris: Un modèle pour étudier motoneurone réponse à une blessure

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Mise en place d&#39;un modèle de xénogreffe humain de myélome multiple dans le poulet pour étudier la croissance tumorale, l&#39;invasion et l&#39;angiogenèse

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

À l’aide de l’imagerie rétinienne pour étudier la démence

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...