Nous remercions J. et J. Cappellani Qiu pour le support technique. Ce travail a été soutenu par des fonds de l&#39;Institut national du cancer (U01 CA141451), le cancer du Consortium Starr, Susan G. Komen for the Cure, Long Marche Île Jour 2 de lutte contre le cancer du sein, de la Coalition des femmes contre la Manhasset cancer du sein ME, et un pré-doctoral du Programme de recherche sur le cancer du sein dirigé par le Congrès, États-Unis à ESNESN est également le destinataire de la rapide et Leslie C. William Randolph Hearst Bourses de la Fondation de l&#39;École des sciences biologiques Watson. AHA a été soutenue par des fonds du Conseil norvégien de la recherche (160698/V40 et 151 882), et du Sud-Est Regional Health Authorities (2007060).

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer. Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés IACUC.

Les réponses des tumeurs aux traitements systémiques in vivo peut être considérablement différents de ceux des cellules cancéreuses in vitro, comme le micro-environnement influence à la fois la réponse aiguë et la rechute 5. Un des plus grands obstacles à l&#39;expliciter dans les voies de chimiorésistance in vivo est la complexité des interactions entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. En particulier, parce que les tumeurs solides ont établi un équilibre entre le cancer et les cellules stromales, des perturbations de l&#39;une des composantes, telles que la mort cellulaire qui se produit pendant le traitement anti-cancéreux, peut entraîner des effets dramatiques sur l&#39;organisation des tissus. La technique d&#39;imagerie intravitale fournie ici permet la visualisation directe des cellules cancéreuses-stroma interactions au sein des tumeurs de souris anesthésiées en direct, pendant le traitement avec des médicaments anticancéreux. Nous utilisons la microscopie confocale disque rotatif, qui a une profondeur de pénétration relativement limitée (voir 17 </sup&gt;), mais nos techniques chirurgicales et l&#39;étiquetage peut être utilisé avec d&#39;autres types de microscopie. Films acquises à partir de ces expériences peuvent être utilisés pour suivre les processus qui tient compte des fluctuations de l&#39;intensité de fluorescence (par exemple due à l&#39;infiltration d&#39;une population marquée ou l&#39;induction de la mort cellulaire), la motilité cellulaire, la distribution de produits injectables (par exemple pour suivre les fuites vasculaires), et co- localisation des signaux fluorescents 5,12,17,20. Nous souris d&#39;image systématiquement depuis plus de 6 heures et d&#39;imagerie également effectué pendant plus de 18 heures. Cela nécessite de maintenir en permanence les souris sous anesthésie pour ces longues périodes de temps. Avec une anesthésie adéquate, plus de 90% de nos animaux survivent à 6 heures, et environ 80% survivent plus de 18 heures. Détails sur la façon d&#39;effectuer une anesthésie à long terme ont déjà été publiés 19. Dans notre expérience, cinq facteurs sont essentiels: éviter l&#39;hypothermie, évitant la déshydratation, le maintien des taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, uchanter gaz porteur humidifié pour l&#39;isoflurane, et en gardant les animaux au plus bas niveau de l&#39;anesthésie au cours de laquelle ils ne montrent pas de signes de douleur. Pour maintenir la température du corps, nous gardons souris sous une couverture chauffante (à 38 ° C). Pour éviter la déshydratation, on injecte de petites quantités de solution saline ip tout au long de la procédure d&#39;imagerie. Afin de maintenir les taux sanguins physiologiques de saturation en oxygène, nous commençons avec 21% d&#39;oxygène dans le gaz porteur (plutôt que le couramment utilisé à 100%). Cela nous permet d&#39;augmenter les niveaux d&#39;oxygène en inhalation si une souris - heures dans une expérience - montre une diminution de la saturation en oxygène du sang. D&#39;après notre expérience, ce qui augmente les niveaux d&#39;oxygène inhalé au moment (par exemple 30-40%) presque toujours se stabilisera l&#39;animal permettant des heures d&#39;imagerie complémentaire. Le niveau optimal de l&#39;anesthésie est pour la plupart des souris obtenus avec 1-1,5% isoflurane et les résultats des taux de respiration et le pouls 60-65/min de 400-450/min. Dans nos expériences d&#39;imagerie, nous utilisons principalement le modèle de souris transgéniques (MMTV-C3 et PyMT [1]-Tag), dans laquelle les tumeurs sont multifocales, ce qui permet l&#39;imagerie des lésions multiples à différents stades de progression de la tumeur en parallèle à x, Y positions multiples au cours d&#39;une session de formation d&#39;image unique. Cela diminue préoccupations concernant la souris à la souris variation par rapport à des expériences visant à identifier dépendent du stade de réponses thérapeutiques et de réduire le nombre d&#39;animaux nécessaires pour l&#39;imagerie. Le modèle MMTV-PyMT (et d&#39;autres modèles de cancer spontané) passer par les étapes progressives histopathologiques qui peuvent être reconnus lors de l&#39;imagerie intravitale, bien que la mise en scène pathologique des lésions tumorales qui peuvent être faites lors de l&#39;imagerie intravitale est différent, et moins détaillé que celui de coupes histologiques 5,17. En revanche, les modèles de transplantation ont tendance à refléter les tumeurs à un stade avancé de mieux, que les cellules cancéreuses sont généralement isolés de tumeurs avancées. Ces modèles sont donc plus propice à l&#39;étude des tumeurs du stromainteractions des tumeurs à un stade avancé que les différences de ces interactions entre les différentes étapes. Nous montrons des exemples de la façon d&#39;images nucléaires changements structurels qui se produisent après la mort cellulaire induite par le traitement. En l&#39;absence de traitement anti-cancéreux, cette stratégie étiquetage peut être utilisé à la place de l&#39;image de la division cellulaire in situ, élucider, par exemple, comment la prolifération cellulaire et la dormance est influencé par le microenvironnement. À l&#39;avenir, le marquage fluorescent des composants mitochondriaux, il peut être possible de l&#39;image change mitochondriales qui se produisent pendant la mort cellulaire par apoptose. Dans ce protocole, nous avons également montré des exemples de la façon d&#39;images interactions cellulaires de cancer des cellules immunitaires après une thérapie, mais d&#39;autres composants du micro-environnement peuvent également être visualisés et imagée. Lignes existantes reporter transgéniques pour les composants du stroma comprennent ceux des fibroblastes (p. ex., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) ou les cellules du système vasculaire (par exemple Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravitale imagerie permet de visualiser en temps réel des interactions et des processus qui se déroulent dans l&#39;administration in vivo suivant la chimiothérapie. Avec la technologie actuellement disponible, nous avons fait de grands progrès dans la compréhension de la façon dont les cellules myéloïdes influencer la réponse thérapeutique, mais parce que le microenvironnement de la tumeur est si complexe, les progrès importants sont encore nécessaires pour commencer à creuser mécaniquement dans les processus sous-jacents à l&#39;environnement induite par la résistance aux médicaments. L&#39;un des progrès les plus importants restent nécessaires est l&#39;identification des meilleurs marqueurs de populations cellulaires spécifiques. L&#39;importance des meilleurs marqueurs est bien illustré avec deux des composantes les plus importantes de cellules stromales de la microenvironnement de la tumeur du sein, les fibroblastes et les cellules immunitaires. muscle lisse α-actine (αSMA) est fréquemment utilisé pour identifierfibroblastes, mais la protéine est également exprimée par les cellules musculaires lisses et les cellules myoépithéliales 24. Ainsi, bien que les souris journaliste αSMA-GFP existent, déterminer le type de cellule spécifique étant ci-après au cours d&#39;une expérience d&#39;imagerie intravitale est difficile. De même, un seul marqueur fluorescent tel que EGFP exprimée sous le promoteur de c-fms identifiera souvent multiples sous-populations de cellules immunitaires 12,17. Ainsi, bien que l&#39;on souhaiterait idéalement utiliser un marqueur unique pour identifier un type de cellule spécifique la complexité de la biologie sous-jacente constitue un défi majeur dans l&#39;utilisation de cette approche. Une solution partielle à ce problème est d&#39;utiliser des étiquettes injectables afin de mieux différencier les sous-populations de cellules exprimant le même journaliste fluorescent. Par exemple, les dextranes fluorescents sont prises par les macrophages et peuvent être utilisées pour marquer les sous-populations de macrophages qui sont marqués par le c-fms-EGFP et FSP1-EGFP souris transgéniques journaliste <sup&gt; 17. Anticorps conjugués à des sondes fluorescentes ont également été utilisés pour identifier les sous-populations spécifiques (par exemple, la population Gr1 positive des cellules myéloïdes marqués par le journaliste c-fms-EGFP 17). Contrairement aux courbes de réponse tumorale générés par étrier de mesure, qui ne fournissent que peu d&#39;informations sur la façon mécaniste ou pourquoi les tumeurs répondre à la thérapeutique administrée, ou d&#39;une série histologique provenant de tissus prélevés à différents moments qui nécessitent de grandes cohortes d&#39;animaux, notre technique permet une information directe et quantifiable sur la dynamique de la mort cellulaire et sur les interactions entre les cellules stromales de cellules cancéreuses dans de petites cohortes. Ainsi, l&#39;avantage d&#39;utiliser la procédure indiquée ici est qu&#39;il fournit des informations dynamiques sur les réactions aux médicaments dans le contexte d&#39;un microenvironnement de la tumeur intacte en temps réel. Ces informations peuvent conduire à des indications importantes sur les processus sous-jacents qui déterminent les réponses thérapeutiques 5 &lt;/ Sup&gt;.

Les tumeurs solides sont constituées de deux compartiments principaux: les cellules cancéreuses et les constituants du stroma (cellulaires et non cellulaires) qui aident à maintenir un environnement approprié pour la croissance tumorale 1. Ces constituants stromales jouent un rôle essentiel dans le développement, la progression et les métastases de nombreux types de cancers, y compris ceux de l&#39;2-5 du sein. Le milieu stromal influence également les réponses thérapeutiques 2,4,5. Ainsi, pour déterminer comment les cellules cancéreuses répondent pas aux thérapies conventionnelles et nouvelles dans le cadre du micro-environnement intact est important pour approfondir notre compréhension de la biologie du cancer et l&#39;amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles. En outre, la définition de la façon dont le cancer des cellules du stroma interactions changer à la suite de l&#39;administration de la thérapie est essentielle pour la compréhension de la biologie de récidive de la tumeur. Organotypiques systèmes de co-culture ont été utiles pour l&#39;étude des interactions stroma tumoral <sup&gt; 6, mais il est évident que les méthodes actuellement disponibles ne parvient pas à récapituler le microenvironnement de la tumeur intacte in vitro, en particulier en ce qui concerne la fonction vasculaire et le recrutement des cellules immunitaires. En effet, les réponses des cellules cancéreuses à des thérapies qui sont observés in vitro sont souvent très différentes de celles observées in vivo, où le micro-environnement est intact 5. Ainsi, dans des modèles in vivo pour l&#39;étude des interactions stroma tumoral et leur impact sur ​​la réponse thérapeutique peut mieux refléter les mécanismes cliniquement pertinentes 7. Les moyens primaires de l&#39;étude des réponses à la thérapie anticancéreuse in vivo ont été par des mesures de taille de la tumeur et l&#39;évaluation histologique des tissus provenant d&#39;animaux traités ou des patients. Cependant, les progrès de la microscopie et rapporteurs fluorescents au cours des deux dernières décennies ont permis la visualisation des processus inter-et intracellulaireà haute résolution dans les vivants, les animaux anesthésiés (intravitale imagerie) 8. Ces technologies de microscopie intravitale se sont avérés particulièrement précieux pour disséquer spatialement et temporellement dans la dynamique de l&#39;in vivo de tumeurs du stroma-interactions à résolution cellulaire et sub-cellulaire 8,9. Les processus qui ont été démêlé par imagerie intravitale comprennent une cytotoxicité anti-tumorale des cellules T 10,11, les interactions entre les cellules T et les cellules myéloïdes 12, la dynamique des changements dans la composition du collagène et de l&#39;organisation suite à un traitement thérapeutique 13, macrophages dépendant intravasation cellules cancéreuses et les métastases 14, 15 et la perméabilité vasculaire. Il ya trois exigences majeures pour l&#39;imagerie intravitale. Il s&#39;agit notamment de la préparation appropriée et l&#39;exposition des tissus pour l&#39;imagerie, le marquage fluorescent des composants du tissu d&#39;intérêt, et une paire de microscopie caméra système capable d&#39;acquérir des images 16. Les stratégies les plus couramment utilisées pour répondre à ces exigences comprennent: 1) les préparations hétérotopiques (par exemple, l&#39;inoculation de l&#39;orbitale oreille ou l&#39;œil), l&#39;imagerie permanente fenêtres, ou des préparations extériorisés (par exemple, lambeau de peau dorsale), 2) transgéniques fluorescents et des journalistes.. injectables fluorescentes pour étiqueter les composants tissulaires et 3) systèmes de microscopie confocale multiphotonique ou jumelé avec des tubes photomultiplicateurs ou Charge-Coupled Device (CCD), respectivement 9. Nous utilisons un modèle de peau chirurgicalement préparé rabat pour exposer la glande mammaire inguinale pour l&#39;imagerie chez les animaux anesthésiés qui expriment des transgènes codant rapporteurs fluorescents. Les images sont obtenues sur une période de 12 à 40 heures en utilisant un CCD intensifié (ICCD) couplé à une caméra quatre-système de disque laser microscope confocal filage 17. Imagerie de cette manière nous a permis d&#39;étudier des processus tels que la distribution de médicaments in vivo, le stade dépendant chemotherapeutic réponses, le type de mort cellulaire induite par la chimiothérapie, et le comportement des cellules myéloïdes 5. Nous fournissons un protocole pour l&#39;imagerie intravitale des réponses des cellules cancéreuses à la thérapie anticancéreuse et du stroma tumoral interactions dans les modèles murins de cancer du sein. Ce protocole peut être utilisé pour suivre les comportements et la mort des cellules cancéreuses deux et les composants du stroma avec une grande variété de transgéniques et injectables marqueurs fluorescents dans les deux modèles transgéniques et la transplantation pour des périodes allant jusqu&#39;à 40 heures en une seule séance d&#39;imagerie.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP souris </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Fait maison </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, conjugué à la fluorescéine </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O (4 mg / ml, conserver à -20 ° C); diluer à 1 mg / ml dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Dextran 10 kD, Alexa Fluor 647-conjugué </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O (4 mg / ml, conserver à -20 ° C); diluer à 1 mg / ml dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de doxorubicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Reconstituer dans dH 2 O et conserver à 4 ° C; diluer dans 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurane) </td><td> Alimentation Butler santé animale </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> L&#39;iodure de propidium </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; dilué 1:15 dans PBS x 1 </td></tr><tr><td> Azote </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxygène </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;aiguille conique régulière </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Les logiciels libres </td></tr><tr><td> Tampon imbibé d&#39;alcool </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% des tampons d&#39;alcool isopropylique </td></tr><tr><td> Système d&#39;anesthésie </td><td> Produits d&#39;imagerie moléculaire, Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Couverture en verre </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No. 1 ½, 24x50 mm; désinfecter avec 70% d&#39;isopropanol lingettes </td></tr><tr><td> Éponges de gaze stérile (Curity) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Prénettoyé, sinon pré-nettoyage, désinfecter avec de l&#39;isopropanol 70% lingettes </td></tr><tr><td> Trempé ciseaux fins </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14090-11 </td><td> 2 paires; acier inoxydable, pointu pointus conseils, pointe droite, 26 mm de pointe, 11 cm de longueur </td></tr><tr><td> Couverture chauffante </td><td> Industries Gaymar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot stérilisateur à billes </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18000-45 </td><td> Mettez environ 30 min avant utilisation; stériliser les outils à&gt; 200 ° C pendant 30 secondes </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer Produits </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Bande de laboratoire (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bande de laboratoire (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Couvercle àune glacière en styromousse expédition </td><td></td><td></td><td> Il sera utilisé comme plate-forme chirurgicale </td></tr><tr><td> Micro pince à disséquer </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 dents, courbe légère, 0,8 mm de largeur pointe, 4 &quot;de longueur </td></tr><tr><td> Micro pince à disséquer </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Dentelé, légère courbe, 0,8 mm Largeur de pointe; 4 &quot;Longueur </td></tr><tr><td> Microscope </td><td></td><td></td><td> Spinning disque confocale, XYZ Piezo stade, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> Insert platine du microscope </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td></td><td> Fabriqué sur mesure, avec deux ports d&#39;imagerie circulaires </td></tr><tr><td> MouseOx oxymètre, des logiciels et des capteurs </td><td> STARR Sciences de la Vie </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene savoir Versi-Dry soakers laboratoire </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Coupez-les en quarts de queue plate-forme chirurgicale </td></tr><tr><td> Nébuliseur </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Utilisé pour humidifier les gaz; prévient les irritations des tissus pulmonaires </td></tr><tr><td> Slip-embout de la seringue jetable tuberculine (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo ensemble de perfusion à ailes </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra fine aiguille, 12&quot; de diamètre </td></tr><tr><td> Betadine pulvérisation </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Le micro-environnement tumoral joue un rôle essentiel dans l&#39;initiation de la tumeur, la progression des métastases, et la réponse aux thérapies anti-cancéreuses. En trois dimensions des systèmes de co-culture sont souvent utilisés pour expliquer la tumeur du stroma interactions, y compris leur rôle dans la réponse aux médicaments. Cependant, la plupart des interactions qui se produisent in vivo dans le microenvironnement intacte ne peut pas être complètement repris dans ceux-ci dans les paramètres in vitro. Ainsi, la visualisation directe de ces processus en temps réel est devenu un outil important dans la compréhension des réponses tumorales aux traitements et à identifier les interactions entre les cellules cancéreuses et le stroma qui peuvent influencer ces réponses. Ici, nous fournissons une méthode pour utiliser la microscopie confocale à disque rotatif en direct, des souris anesthésiées d&#39;observer directement distribution de médicaments, les réponses des cellules cancéreuses et les changements dans les tumeurs du stroma-interactions après l&#39;administration d&#39;une thérapie systémique dans des modèles de cancer du sein. Nous décrivons les procédures de labeling composants tumoraux différents, le traitement des animaux pour l&#39;observation de réponses thérapeutiques et la procédure chirurgicale pour exposer les tissus tumoraux pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à 40 heures. Les résultats obtenus par ce protocole sont time-lapse films, dans lequel les processus tels que l&#39;infiltration de drogue, la mort des cellules cancéreuses et la migration des cellules stromales peuvent être évaluées en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image.

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Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Nous décrivons une méthode d&#39;imagerie de la réponse à un traitement anticancéreux<em&gt; In vivo</em&gt; Et à la résolution de la cellule unique.

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

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Medicine

24.6K vues.  Watson School of Biological Sciences. Nous décrivons une méthode d'imagerie de la réponse à un traitement anticancéreux In vivo Et à la résolution de la cellule unique.

Vidéo: Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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Médecine

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Modèles de MAME pour 4D imagerie des cellules vivantes de la tumeur: Interactions microenvironnement Progression impact malin

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modale d&#39;imagerie de l&#39;angiogenèse dans un modèle de rat nu des métastases osseuses du cancer du sein par imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et volumétrique ultrasons

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l&#39;épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblastes

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...