<p class="jove_content"&gt; Les auteurs tiennent à remercier Jennifer Strange et Greg Bauman pour leur aide à l&#39;analyse cytométrie en flux et tri. Ce travail a été soutenu par le NIH Grant Nombre 2P20 RR020171 de la NCRR et par l&#39;Université de fonds de démarrage du Kentucky à la bande FM; GIE reconnaît le soutien de la bourse d&#39;études supérieures présidentielle et le Mouvement des chances Kentucky.</p

1. Isolement des cellules humaines mononucléaires du sang périphérique (CMSP) de couche leuco-plaquettaire <ol><li> Acquérir une unité de couche leuco-plaquettaire de l&#39;hôpital ou à proximité emplacement en centre-sang. Notre centre de transfusion nous donne environ 40-60 ml de buffy coat unitaire obtenu à partir de donneurs de sang normaux. </li><li> Verser le sang dans un autoclave 500 ml flacon en verre contenant du PBS stérile pour diluer couche leuco-plaquettaire. Le volume final de PBS manteau + buffy devrait être de 250 ml. </li><li> Remplissez dix 50 ml tubes coniques chacun avec une solution à 20 ml Lymphoprep. </li><li> Doucement superposer la solution Lymphoprep avec 25 ml de la couche leuco-plaquettaire après dilution, en faisant attention de ne pas perturber la solution Lymphoprep. </li><li> Spin tubes pendant 30 minutes à température ambiante à 500 x g. Assurez-vous d&#39;éteindre de frein de la centrifugeuse, de sorte à ne pas perturber la fraction des lymphocytes. </li><li> Collecter les PBMC à l&#39;interface entre l&#39;Lymphoprep et les couches de plasma moyen d&#39;une pipette. Aspirer le hors-moyen jusqu&#39;à ce que le plasma d&#39;environ 1 mlcouvre encore la couche leuco-plaquettaire contenant des PBMC. Utiliser une pipette 10 ml de transférer à une nouvelle PBMC tube de 50 ml. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS, puis remettre en suspension les cellules dans 50 ml de RPMI froid pour compter sur un hémocytomètre. De récupération typique est de 8 x 10 8 - 1 x 10 9 PBMC. </li></ol> Cette procédure peut être revus à la baisse pour les petits volumes de sang. Dilution des échantillons de sang total est de 1:1 dans du PBS. 2. Magnétique de sélection négative des lymphocytes CD4 + Total des cellules T CD4 + CD45RA + cellules T naïves ou CD4 + CD45RO + mémoire des cellules T à partir de PBMC en utilisant Kits d&#39;enrichissement EasySep (cellules souches Technologies) Étapes à suivre pour 1 x 10 8 à 4,25 x 10 8 PBMC. <ol><li> PBMC Resuspendre à une concentration finale de 5 x 10 7 par ml dans du PBS contenant 2% de FBS et 1 mM EDTA. Déplacer les cellules à une nouvelle tube 14 ml en polypropylène à fond rond. <ol class = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> Isolement du total des CD4 + humains des cellules T par sélection négative: ajouter CD4 + humains Cocktails T enrichissement de cellules d&#39;anticorps (50 pi par ml de PBMC), mélanger et laisser incuber pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Isolement de l&#39;homme des cellules T naïves par une sélection négative: ajouter 50 ul d&#39;anticorps anti-CD45RO anticorps par ml de suspension cellulaire PBMC, mélanger et laisser incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter cocktail d&#39;enrichissement fourni avec le kit (50 uL de mL par des PBMC), mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. </li><li> Isolement de cellules T humaines de mémoire par une sélection négative: ajouter CD4 mémoire de l&#39;homme + cocktail T enrichissement de cellules d&#39;anticorps (50 pi par ml de PBMC), mélanger et laisser incuber pendant 10 minutes à température ambiante. </li></ol></li><li> Mélanger bien à des particules magnétiques aussi les distribuer à travers la solution. Avez nanoparticules pas créer de tourbillon de la trousse naïve. </li><li> Ajouter les particules magnétiques (100 pi par ml de PBMC pour CD4 + totaux et naïve sélection de cellules T, 50 pi par ml de PBMC pour la sélection des cellules T mémoire). Mélanger doucement pipetage 2-3 fois et incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour la sélection des cellules T naïves ou 5 minutes pour les CD4 mémoire ou totale + de sélection des cellules T. </li><li> Ajouter PBS contenant 2% de FBS et 1 mM d&#39;EDTA pour porter le volume à 10 ml par tube. Mélanger doucement pipetage 2-3 fois avant de placer le tube non plafonné en argent EasySep aimant pour les minutes 5, 10 ou 2,5 pour les CD4 + de cellules T totales, les sous-ensembles naïves et mémoires, respectivement. </li><li> Avec tube encore en aimant EasySep, verser le liquide dans un nouveau tube de 50 ml d&#39;isoler des cellules d&#39;intérêt. </li><li> Répétez les étapes 2.5 et 2.6 pour une meilleure récupération. </li></ol> 3. Conditions de culture cellulaire pour induire les lymphocytes T régulateurs <ol><li> La veille les étapes 1 et 2, les plaques manteau de culture de tissus en diluant d&#39;abord anticorps anti-CD3 (OKT3 clone) à une concentration de 1 ug / ml dans du PBS stérile. Pour une plaque à 6 puits, ajouter 2 mL de PBS + anti-CD3 par puits, pour une plaque 12 puits, ajouter 1 ml ou pour une plaque de 24 puits, ajouter 500 ul par puits. Maintenir la plaque revêtue à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer le milieu de polarisation en ajoutant 10% inactivé par la chaleur du sérum fœtal bovin (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / mL de streptomycine et 50 uM β-mercaptoéthanol à RPMI-1640 pré-complété avec 2,06 mM Glutamax-I et 25 mM tampon HEPES. Ensuite, ajoutez 2 ng / ml de TGF-β et 5 ng / ml d&#39;IL-2. Ici, on peut ajouter des ligands ou des inhibiteurs d&#39;intérêt pour les médias. Remettre en suspension les cellules de l&#39;étape 2 à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml de milieu de polarisation. </li><li> Pré-chauffer les assiettes à 37 ° C et aspirer le PBS sur l&#39;anti-CD3 puits revêtus avant d&#39;ajouter les cellules. Ajouter 4 ml par puits de la suspension cellulaire pour une plaque à 6 puits, 2 ml de cellules pour une plaque 12 puits ou 1 ml de cellules pour une plaque de 24 puits. Remplir les puits vides avec du PBS pour réduire l&#39;évaporation demultimédia. Incuber pendant 3 jours à 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Le placage après 3 jours, ralentit la plaque dans une centrifugeuse pendant 5 minutes à 500 x g. Sans déranger les cellules T sur fond de la plaque, retirer la moitié des médias et les remplacer par des milieux frais. Par ailleurs, si le bien devient surpeuplée avec des cellules (concentration supérieure à 3 x 10 6 / ml), diviser le volume aussi dans une autre plaque de revêtement anti-CD3 et d&#39;ajouter du milieu frais de retour au volume d&#39;origine. Incuber pendant deux à trois jours de plus à 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> 4. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de trois populations de cellules T <ol><li> Préparer FACS tampon de lavage en ajoutant 0,5% (p / v) de sérum albumine bovine (BSA) et 2 mM d&#39;EDTA à PBS stérile. Lieu de tampon à 4 ° C pour obtenir le froid. </li><li> Supprimer des cellules de culture de cellules bien et rincez chaque puits avec 2 ml de PBS pour assurer une récupération complète des cellules. Placez toutes les cellules dans 50 tubes en polypropylène mL et centrifuger à 500 xg pendant 10minutes à 4 ° C. </li><li> Compter les cellules sur un hémocytomètre pour déterminer la densité de cellules. </li><li> Lieu 3-5 x 10 5 cellules par tube à quatre distinctes 5 mL tubes ronds en polystyrène de fond pour les contrôles de compensation. Placez les cellules restantes dans 50 des tubes en polypropylène mL, pas plus de 35 x 10 6 cellules par tube. </li><li> Isoler les cellules pendant 5 minutes à 4 C des médias et aspirer °. Remettre en suspension les cellules à trier dans 90 pl de tampon de lavage à froid pour 1 x 10 6 cellules. Remettre en suspension dans 100 pl de tampon de lavage à froid des tubes de commande de compensation. </li><li> Pour les cellules à trier, combiner 2 ul d&#39;anticorps anti-CD25-PE, 3 ul d&#39;anticorps anti-CD45RA-PE-Cy5 et 1 ul d&#39;anticorps anti-CD127-APC pour 1 x 10 6 cellules. Ajouter pas d&#39;anticorps au tube de commande de compensation d&#39;abord, 2 pi d&#39;anticorps anti-CD25-PE au deuxième tube, 3 ul d&#39;anticorps anti-CD45RA - PE-Cy5 au tube et1 pL troisième anti-CD127-APC du quatrième tube. Incuber tous les tubes sur la glace pendant 45 minutes dans le noir. </li><li&gt; Ajouter 10 ml de tampon de lavage à froid aux cellules d&#39;être triés et 1 mL dans les tubes de commande de compensation. Centrifuger tous les cellules à 500 xg pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Aspirer les cellules tampons et resuspendre à une concentration de 1 x 10 7 cellules par ml de tampon de lavage. Ajouter 1,5 ul de DNase II par ml de cellules avant de filtrer à travers un filtre 40 uM en nylon cellule. Déplacer des cellules à plusieurs tubes 5 ml fond rond en polypropylène avec pas plus de 3,5 ml par tube. Remettre en suspension les cellules de contrôle de compensation dans 300 ul de tampon de lavage. </li><li> Réglez la correction sur le cytomètre en flux pour minimiser la détection MoFlo croix par le PE, APC et PE-Cy5 filtres. Réglez portes pour trier iTregs (CD25 CD127 Salut -/LOW CD45RA - cellules), naïfs (CD25-CD45RA +) et de la mémoire (CD25 - CD45RA -) des cellules T dans 5 ml tubes ronds en polystyrène de fond contenant 1 ml de sérum de veau nouveau-né. </li></ol> 5. Essai répression <ol><li> Assurez-supprles médias de dosage ESSION en ajoutant 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 5 ng / ml d&#39;IL-2 et 2 ng / ml de TGF-β à l&#39;AIM-V. </li><li> Le jour de l&#39;essai, de purifier CD4 + de cellules T hétérologues de couche leuco-plaquettaire, comme indiqué dans les étapes 1 et 2. Ceux-ci seront les cellules cibles pour le dosage de suppression et ne contient pas CD25 + Treg, comme on peut le voir sur la figure 2, Jour 0. </li><li> Cellules d&#39;étiquettes avec CellTrace kit que par les instructions du fabricant, à l&#39;exception en utilisant seulement 1 pl de solution à 5 mm Stock par ml de cellules au lieu de 2 pl. Garder hors de la lumière directe, ajouter 18 ul du DMSO fourni par le kit CellTrace à un flacon de CFSE pour obtenir une solution stock 5 mM. Remettre en suspension le nombre requis de cellules cibles (jusqu&#39;à un maximum de 1 x 10 7) dans du PBS préchauffé + 0,1% (p / v) de BSA à une concentration finale de 1 x 10 6 cellules / ml. Ajouter 1 ul de 5 mM CFSE par ml de cellules et incuber dans un bain à 37 ° C eau pendant 5 minutes. Ajouter 5 volumes de complet, RPMI glacée avec FBS 10% pour étancher la coloration et incuber sur de la glace pendant 5 minutes. Laver les cellules deux fois plus de froid RPMI complet et remettre en suspension 1 x 10 5 cellules par 100 pl de médias de dosage de suppression. </li><li> Treg perles inspecteur d&#39;extinction sont à une concentration stock de 2 x 10 7 billes / mL. Pellet un certain nombre de billes égal au nombre total de cellules par l&#39;expérience par centrifugation rapide dans un tube Eppendorf. Laver une fois avec du RPMI perles et re-pastille. Après aspiration de RPMI, Remettre les billes de telle sorte que la quantité appropriée de perles par puits sont à 8 pl des médias de dosage de suppression. </li><li> Dans une plaque de 96 puits de culture ronde en bas des tissus, ajouter CFSE cellules colorées (1 x 10 5 cellules / ml), des perles de l&#39;inspecteur et des cellules polarisées et triés (1 x 10 5 cellules / mL) dans les médias frais d&#39;analyse de suppression d&#39;une cible souhaitée (teinté CFSE): effecteur (triés) rapport dans un volume final de 200 pl. Toutes les conditions sont définies en trois exemplairesCates. </li><li> Préparer la première des deux conditions de contrôle par l&#39;ajout de 100 ul de cellules colorées CFSE, 8 pi de perles inspecteur et 1 x 10 5 de frais, les cellules non colorées dans 92 uL milieu de dosage suppresseur par puits. Préparer le deuxième contrôle avec les mêmes composants cellulaires comme ci-dessus mais sans Treg perles inspecteur. </li><li> Couvrir la plaque de papier d&#39;aluminium et incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant cinq jours. </li><li> Dans l&#39;obscurité, recueillir des cellules provenant de chaque puits par pipetage et le lieu dans un 5 ml de fond en polystyrène tube rond. Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes à 4 ° C, les médias aspirer, et remettre en suspension dans 300 ul du tampon de lavage à froid FACS de l&#39;étape 4. Analyser le premier 3 x 10 4 CFSE + les événements de la porte en direct des lymphocytes représentant cellules cibles dans un histogramme avec le logiciel Cell Quest. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Exemple de pseudo-cytométrie de flux parsèment parcelles sur une durée de cinq jours de temps-course différenciation iTreg surveillance basée sur le rapport de co-expression de CD25 avec FoxP3, CTLA-4 et CD45RA peut être vu dans la figure 2. L&#39;histogramme de la figure 3 montre un test de suppression de succès dans laquelle triés iTregs (CD25 Salut CD45RA - CD127 cellules -/LOW). Sont le sous-ensemble seulement d&#39;une culture de cinq jours qui a acquis la capacité de réglementation / suppresseur de la figure 4 montre l&#39;induction des Treg à partir d&#39;un pool de cellules T naïves (panneaux supérieurs) et un pool de cellules T mémoire (panneaux inférieurs), après cinq jours de culture dans un milieu iTreg standard. Coloration des cellules CFSE initiales montrent que, soit des cellules T naïves (en haut à droite) ou de la mémoire (en bas à droite) se différencient en iTregs (plus FoxP3 cellules exprimant) seulement après plusieurs cycles de division cellulaire. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la procédure expérimentale. PBMC are séparé du sang périphérique humain par centrifugation de gradient de sélection négative avant magnétique de cellules CD4 + CD25 - Les cellules T. Après cinq à six jours de culture, les cellules subissent FACS et sont co-incubées avec des cellules CFSE hétérologues cibles marquées pour mesurer l&#39;activité suppresseur. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> Figure 2 purifiés humains CD4 + CD25 primaires -. Cellules T sont cultivées dans iTreg moyenne. Un aliquot de cellules est prélevé juste après l&#39;isolement (jour 0) et aux jours 1, 3 et 5 de la culture cellulaire pour suivre les progrès de CD45RA, FoxP3, CTLA-4 et des marqueurs CD25. Le profil correspond à iTreg CD45RA -, FoxP3 Salut, CTLA-4 et CD25 Salut Salut (mis en évidence dans la fenêtre en graphique). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> Figure 3. Purifiée CD4 + CFSE lacellules Beled (1 x 10 5 / puits) sont cultivées avec Treg perles inspecteur d&#39;extinction dans la présence de cellules triées naïf, mémoire ou iTreg (3 x 10 4 / puits). Après cinq jours, les cellules sont récoltées et le profil CFSE des cellules colorées est analysée par cytométrie de flux. La présence de cellules iTreg abolit complètement la prolifération des cellules T CD4 +. Les chiffres sont indicatifs du pourcentage de cellules CFSE-étiquetés qui ont subi la division. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> Figure 4 humaine purifiée primaire naïf. (CD4 + CD25 - CD45RA +) et de la mémoire (CD4 + CD25 - CD45RO +) des cellules T sont colorées avec CFSE et cultivées dans iTreg moyennes. Après cinq jours, les cellules sont phénotypés et les taux de division cellulaire estimé. Comme indiqué dans la figure 2, le sous-ensemble iTreg différencier les deux sous-ensembles correspond àCD45RA - CD25 FoxP3 Salut Salut et CTLA-4 Salut (ces deux derniers non représenté). Comparatives profils de coloration CFSE identifier iTregs (ici en tant que plus les cellules exprimant T FoxP3) que les cellules les plus prolifératifs au cours de la culture de cinq jours.

<ol>
	<li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4++T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity.">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li><li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-expanded,+islet-specific+CD4++CD25++CD62L++regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice.">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+collagen-induced+arthritis+by+adoptive+transfer+of+CD25++regulatory+T+cells.">Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells.</a> Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).</li><li>Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infusion+of+ex+vivo+activated+and+expanded+CD4(+)CD25(+)+immune+regulatory+cells+inhibits+graft-versus-host+disease+lethality.">The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality.</a> Blood. 99, 3493-3493 (2002).</li><li>Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP3:+of+mice+and+men.">FOXP3: of mice and men.</a> Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).</li><li>Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+T+regulatory+cell+therapy:+take+a+billion+or+so+and+call+me+in+the+morning.">Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.</a> Immunity. 30, 656-6565 (2009).</li><li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+FOXP3+mRNA+is+not+confined+to+CD4+CD25++T+regulatory+cells+in+humans.">Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans.</a> Human Immunology. 66, 13-20 (2005).</li><li>Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Generation+and+Enhanced+Suppression+of+Human+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+Retinoic+Acid.">De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid.</a> Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li><li>McHugh, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)CD25(+)+immunoregulatory+T+cells:+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor.">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16, 311-323 (2002).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+Self-Tolerance+Maintained+by+Cd25+Cd4+Regulatory+T+Cells+Constitutively+Expressing+Cytotoxic+T+Lymphocyte-Associated+Antigen+4.">Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).</li><li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD127+expression+inversely+correlates+with+FoxP3+and+suppressive+function+of+human+CD4++T+reg+cells.">CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).</li><li>Schraven, B., Kalinke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+superagonists:+what+makes+the+difference+in+humans.">CD28 superagonists: what makes the difference in humans.</a> Immunity. 28, 591-595 (2008).</li><li>Reneer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling.">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Alors que le transfert de Treg détient d&#39;énormes promesses thérapeutiques dans la lutte contre le rejet de greffe auto-immunité et d&#39;autres troubles immunitaires ou inflammatoires à médiation, les méthodes pour leur production efficace et un maintien stable n&#39;ont pas encore été développé. Comme seulement 1-5% des cellules T humaines circulant sont Tregs, leur expansion contrôlée et la différenciation de surmonter ce manque comme un obstacle majeur de la mise en œuvre des Tregs dans la clinique...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Conserver à température ambiante </td></tr><tr><td> Réfrigéré Centrifugeuse de table </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Bright-ligne hémocytomètre </td><td> Hausser scientifique </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> CD4 + de l&#39;homme EasySep Kit enrichissement de cellules T </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> CD4 EasySep mémoire de l&#39;homme + Kit enrichissement de cellules T </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep homme CD4 + naïves Kit enrichissement de cellules T </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> Le Big Easy EasySep Magnet </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 18001 </td><td> Argent </td></tr><tr><td> 5 ml tubes ronds en polystyrène de fond </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 15 ml à centrifuger en polypropylène </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ml en polypropylène à fond rond Tubes </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml à centrifuger en polypropylène </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Humaine anticorps anti-CD3 </td><td> Bio X portable </td><td> BE0001-2 </td><td> Clone: ​​OKT3 </td></tr><tr><td> 24 plaques à puits culture cellulaire polystyrène </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits ronde Culture sur le fond de tissus </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 avec Glutamax-I et tampon HEPES </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Sérum de veau fœtal (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Human TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant Human IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M d&#39;EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-CD25 humain-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Clone: ​​4E3 </td></tr><tr><td> Souris Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Clone: ​​HI100 </td></tr><tr><td> Souris anti-CD127 Human-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Clone: ​​MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNase II </td><td> MP Biomedicals Inc </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> Cytomètre en flux MoFlo </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Software </td><td> Star Tree, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cell Quest Pro Software </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Veau nouveau-né Sérum </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CFSE CellTrace Cell Kit prolifération </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg Perles inspecteur de suppression </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 uM souche cellulaire en nyloner </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

Le développement et la maintenance de CD4 + de immunosuppresseurs des cellules T régulatrices (Treg) contribuer à la tolérance périphérique nécessaire pour rester dans l&#39;homéostasie immunologique avec la grande quantité des antigènes du soi et commensaux à l&#39;intérieur et sur ​​le corps humain. Perturbations de l&#39;équilibre entre Tregs et inflammatoires cellules T conventionnelles peuvent entraîner immunopathologie ou le cancer. Bien que l&#39;injection thérapeutique des Treg a été démontré pour être efficace dans des modèles murins de la colite 1, diabète de type I 2, la polyarthrite rhumatoïde et maladie du greffon contre l&#39;hôte, 4 plusieurs différences fondamentales dans l&#39;homme par rapport à la souris Treg biologie 5 a jusqu&#39;à présent empêché l&#39;utilisation clinique. L&#39;absence d&#39;un nombre suffisant, la pureté, la stabilité et la spécificité de ralliement de la thérapeutique Tregs a nécessité une plate-forme dynamique de développement humain, sur laquelle Treg afin d&#39;optimiser les conditions de leur expansion ex vivo 6. Ici, nous D ÀEscribe une méthode pour la différenciation des lymphocytes T régulateurs induits (iTregs) à partir d&#39;un seul donneur de sang périphérique humain qui peut être décomposé en quatre étapes: l&#39;isolement de cellules mononucléées du sang périphérique, la sélection magnétique de cellules T CD4 +, dans la culture cellulaire in vitro et activé par fluorescence tri cellulaire (FACS) de sous-ensembles de lymphocytes T. Depuis la transcription Treg facteur de la signature P3 boîte de forkhead (FoxP3) est un facteur de transcription induite par activation chez les humains 7 et aucun autre marqueur unique existe, un panneau de combinatoire des marqueurs doit être utilisé pour identifier les cellules T avec une activité suppresseur. Après six jours de culture, les cellules de notre système peut être délimitée en cellules T naïves, les cellules T mémoires ou iTregs en fonction de leur expression relative de la CD25 et CD45RA. Comme les cellules T mémoires et naïves avoir des exigences différentes de polarisation signalés et plasticités 8, pré-tri de la population de cellules T initial en CD45RA + et CD45RO + sous-ensembles peuvent be utilisé pour examiner ces divergences. Conformément à d&#39;autres, notre CD25 Salut CD45RA - iTregs expriment des niveaux élevés de FoxP3 9, GITR et CTLA-4 11 et de faibles niveaux de CD127 12. À la suite FACS de chaque population, des cellules résultantes peut être utilisé dans un dosage suppresseur qui évalue la capacité par rapport à retarder la prolifération carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE)-marqué cellules T autologues.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃ¯ve and Memory T Cells at JoVE.com

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

Nous décrivons une méthode pour générer des cellules T régulatrices, de mémoire et naïve d&#39;un donneur de sang humain unique. Polarisée Tregs peut être ensuite comparé à des sous-ensembles d&#39;autres dans une variété d&#39;applications génétiques et fonctionnelles avec une homogénéité génétique, y compris un test de suppression aussi détaillé ici.

Génération de cellules T régulatrices induites de l&#39;homme primaires cellules T naïves et mémoire

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

generation-induced-regulatory-t-cells-from-primary-human-nave-memory

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K vues.  University of Kentucky. Nous décrivons une méthode pour générer des cellules T régulatrices, de mémoire et naïve d'un donneur de sang humain unique. Polarisée Tregs peut être ensuite comparé à des sous-ensembles d'autres dans une variété d'applications génétiques et fonctionnelles avec une homogénéité génétique, y compris un test de suppression aussi détaillé ici.

Vidéo: Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Recherche

Immunologie et infection

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Dérivation des cellules T<em&gt; In Vitro</em&gt; De la souris les cellules souches embryonnaires

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre Autoimmunité

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Évaluation de l’Interface synaptique des cellules primaires humaines T du sang périphérique et le tissu lymphoïde

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.