Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Reynolds au Rosalind Franklin Université de médecine et des sciences, et le laboratoire Chen Dong à l&#39;Université du Texas MD Anderson Cancer Center pour l&#39;optimisation de ce protocole. Ce travail a été financé par une subvention de JMR de la National Institutes of Health (K22AI104941).

Toutes les procédures expérimentales sont effectuées en utilisant les protocoles approuvés par le bureau de la santé et de la sécurité de l&#39;environnement à l&#39;Université Franklin Rosalind de médecine et des sciences. C57BL / 6 (acheté chez NCI) utilisé pour ce protocole ont été logés dans des conditions exemptes d&#39;organismes pathogènes spécifiques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en utilisant des protocoles approuvés par le Comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle des animaux (IACUC) au Franklin Université Rosalind de médecine et Science. 1. Préparation des instruments, des fournitures et réactifs <ol><li> Manteau de 48 puits ou à 24 puits avec des plaques anti-CD3 et anti-CD28 (Tableau 1) dans PBS stérile, couvrir et envelopper dans du parafilm pour éviter l&#39;évaporation et la contamination, puis incuber O / N à 4 o C le jour avant T isolement des cellules. Alternativement, revêtir les puits 1 h à 37 o C. Effectuer conditions Th0, Th1, Th2, et en revêtant la fois iTreg anti-CD3 et anti-CD28 à 1 pg / ml dans 0,5 à 1 ml dele volume tal (plaque 48 puits). Pour Th17, nous typiquement couche anti-CD3 à 2 ug / ml et anti-CD28 à 1 ug / ml. REMARQUE: Nous avons trouvé qu&#39;une concentration inférieure anti-CD3 est optimale pour la génération Th1, Th2, et iTreg alors qu&#39;une concentration plus élevée anti-CD3 est optimale pour la génération Th17. Ainsi, l&#39;anti-CD3 et anti-CD28 concentrations doivent être titrés et optimisés pour les laboratoires individuels (tableau 2). </li><li> Stériliser un ensemble d&#39;outils de dissection (des ciseaux et des pinces) par une solution autoclave ou désinfectant. Un tube ou petit bécher contenant 70% d&#39;éthanol seront nécessaires pour la stérilisation rapide d&#39;outils entre les dissections. Enfin, un flacon pulvérisateur contenant 70% d&#39;éthanol sera nécessaire pour la stérilisation de la surface de la souris avant la dissection. </li><li> Préparer une surface de dissection en enroulant un morceau plat de styromousse ou de liège dans une feuille d&#39;aluminium. Épingles ou des aiguilles de dissection sont utilisés pour fixer l&#39;animal en place. </li><li> Préparer des plats ou des plaques de collecte de tiquest. Si les tissus de mise en commun, 60mm plats séparés contenant 3 ml de solution stérile PBS + 1% de FBS (PBS +) pour les tissus de la rate et des ganglions lymphatiques est suffisante. Si gardant tissus provenant de souris individuelles séparées, préparer un 1ml plaque de 24 puits contenant de PBS + dans le nombre souhaité de puits. </li><li> Préparer du milieu RPMI complet pour la culture cellulaire et pré-chaud avant utilisation (tableau 1). NOTE: Nous utilisons régulièrement RPMI mais d&#39;autres médias tels que IMDM et DMEM peut être tout aussi efficace ou supérieure selon le laboratoire et l&#39;expérience. </li><li> Couper des carrés de 2x2 cm nylon engrènent avec une taille de pores de 120 um et autoclave pour stériliser (tableau 1). </li><li> Facultatif: si vous utilisez la cellule magnétique à haute vitesse système de tri comme autoMACS pour l&#39;enrichissement de cellules CD4 +, la course pré-chaud et le rinçage tampons C dans un bain d&#39;eau à 37 o pour éviter d&#39;endommager la machine. </li><li> NOTE: L&#39;enrichissement est recommandé d&#39;augmenter le rendement de tri et de diminuer le temps de tri. </li><li> Tousétapes de préparation, à l&#39;exception de dissection, doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile. </li></ol> 2. Isolement des ganglions lymphatiques et la rate de souris <ol><li> Euthanasier le nombre requis d&#39;animaux en utilisant une technique institutionnellement approuvé. Utilisez C57BL / 6 souris femelles, l&#39;âge 5-10 semaines, en raison de leur pourcentage élevé de cellules T naïves et graisse du bas du corps en comparaison aux hommes ou à des souris âgées. REMARQUE: Les cellules dérivées de souris mâles se effectuer de façon similaire in vitro et les étapes du protocole restent les mêmes. Des souris femelles, âgées de 5 à 10 semaines, donne habituellement 3-6 x 10 6 cellules naïves T CD4 + par souris. Cependant, en utilisant différentes souches de souris peuvent affecter le rendement et la performance. Par exemple, des cellules provenant de souris C57BL / 6 sont meilleurs pour générer des cellules Th1 tandis que les cellules provenant de souris Balb.c sont meilleurs pour générer des cellules Th2. </li><li> Répartir les membres de l&#39;animal et les épingler en place comme le montre la figure 1. Couper la peau à longitudinally de l&#39;anus vers le menton tout en faisant attention à ne pas percer des tissus plus profonds. </li><li> Déployez la peau avec une pince et la broche de la peau en place pour permettre un accès facile aux ganglions lymphatiques comme le montre la figure 1. </li><li> Récolter les ganglions lymphatiques accessibles depuis les emplacements indiqués sur la figure 1. Saisir le ganglion lymphatique avec une paire de pinces pendant que le tissu de séparation avec une autre paire de pinces permet un retrait facile. Placez le tissu dans le plat de collecte. </li><li> Récolter la rate à partir de l&#39;emplacement représenté sur la figure 1. Dans ce cas, la découpe soigneuse dans le péritoine est nécessaire pour accéder à la rate. Placez le tissu dans un plat de collecte. </li><li> Répétez la procédure si d&#39;autres tissus seront récoltés. Procéder autrement pour les prochaines étapes. À ce stade, effectuer toutes les étapes restantes sur la glace jusqu&#39;à ce que le placage des cellules T après le tri. </li></ol> 3. Traitement des tissus et CD4 + Enrichissement<ol><li> Traiter les ganglions lymphatiques et la rate dans différents plats pour augmenter le rendement de préparations de cellules ganglionnaires ne nécessitent pas la lyse des érythrocytes, ce qui peut entraîner la mort de leucocytes mineur. Par conséquent, les étapes ci-dessous décrivent un procédé pour traiter des populations de rate et de ganglions lymphatiques puis en combinant séparément avant l&#39;étiquetage pour le tri. </li><li> Retirer le tissu (la rate ou des ganglions lymphatiques communs) de la boîte de collecte et dans une nouvelle boîte de 60 mm contenant 3 ml de PBS +. Placer un carré de nylon stérile maillage sur le tissu en utilisant des pinces stériles. </li><li> Prenez le côté du pouce d&#39;un piston de la seringue (3-10 ml) et casser doucement le tissu contre la maille. Presque tous les tissus devrait aller en suspension. Sinon, placez le tissu entre deux lames dépolies autoclaves et broyé en suspension. </li><li> Introduire à la pipette la suspension de haut en bas à quelques reprises pour briser les mottes solubles restantes. Placez un nouveau carré de filet de nylon sur l&#39;ouverture d&#39;une15 ml de tube conique et filtrer la suspension à travers pour éliminer les débris restants. </li><li> Répétez les étapes 2-4 pour ganglionnaire supplémentaires et le tissu splénique. </li><li> Une fois que la suspension a été filtrée dans un tube de 15ml remplir le reste du tube avec du PBS + et retournant plusieurs fois. Centrifuger les cellules à 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Pour les cellules spléniques, aspirer le surnageant après centrifugation et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml d&#39;une solution glacée ACK par rate 1X pendant 1 min pour lyser les érythrocytes. Ensuite, ajoutez 10 ml de PBS + sur le dessus de l&#39;ACK, inverser le tube et centrifuger 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Pour les cellules de ganglions lymphatiques, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de PBS +. Si on le désire ceux-ci peuvent être combinés avec les cellules spléniques après leur lyse ACK et l&#39;étape de lavage. </li><li> Aspirer le surnageant après centrifugation des splénocytes et remettre en suspension dans 10 ml de PBS +. A ce stade, la suspension de ganglion lymphatique peut être undded au-dessus de la suspension de rate si la mise en commun des tissus est nécessaire pour le tri. Centrifuger le tube à nouveau à 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Le culot de cellules peut alors être préparé pour l&#39;enrichissement CD4. Si cette étape ne sera pas exécutée, passer aux étapes de préparation de tri. </li><li> Pour l&#39;enrichissement CD4 en utilisant le système de tri cellulaire magnétique à haute vitesse, remettre en suspension le culot cellulaire avec des billes CD4. Typiquement 15 ul de billes dilué dans 85 pi de PBS + est utilisé pour étiqueter les tissus de 1 souris. Montée en puissance du volume de mélange de perles au besoin, remettre le culot, et incuber pendant 15-30 min à 4 o C. </li><li> Laver les cellules avec 10 ml de PBS +, passer la suspension à travers nylon dans un nouveau tube de 15 ml pour enlever les débris, et centrifuger à nouveau à 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS par souris + et procéder à une sélection positive sur le système de tri à haute vitesse cellule magnétique. Si l&#39;on utilise un système de séparation manuelle, fuivez les instructions du fabricant pour l&#39;enrichissement. En variante, remettre en suspension les échantillons dans du tampon FACS: PBS avec 1 mM d&#39;EDTA (pH = 8) et BSA à 1%, stérilisée par filtration. </li><li> Retirez la fraction positive et laver de nouveau avec 10 ml de PBS +. La fraction enrichie en cellules CD4 + est maintenant prêt à être étiqueté pour le tri. </li></ol> 4. cellules Tri Naïf T CD4 + <ol><li> Marquer le culot de cellules avec du PBS + contenant des anticorps fluorescents dirigés contre CD62L, CD44, CD25, CD4 et. Si l&#39;on utilise les anticorps énumérés dans le tableau 1, pour chacune des dilutions sont fournis. Pour la coloration, un volume de 100 pl de cocktail d&#39;anticorps est utilisé par les tissus d&#39;une souris. </li><li> Reprendre le culot de cocktail d&#39;anticorps et incuber pendant 15-30 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec 10 ml de PBS et centrifuger + 475 g pendant 5 min à 4 o C. </li><li> Passez le mélange sur un autre capuchon de filtre en nylon ou un tamis cellulaire à nouveaudéplacer tout débris. Pipeter des cellules marquées dans un tube qui est compatible pour le trieur de cellules. Gardez cellules sur la glace et à l&#39;abri de la lumière jusqu&#39;à la sorte. </li><li> Préparer des tubes de prélèvement par aspiration de 1-2 ml du milieu RPMI complet ou de FBS dans le fond de tubes compatibles pour la collecte sur un trieur de cellules. </li><li> Trier les cellules naïves T CD4 + en tant que CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - population (Figure 2). Laver les cellules recueillies avec du milieu RPMI complet et centrifuger comme décrit ci-dessus. </li><li> Reprendre le culot dans RPMI complet, compter les cellules naïves, et ajuster la concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. </li></ol> 5. Configuration de la différenciation in vitro <ol><li> Aspirer les puits des plaques revêtues anti-CD3 et anti-CD28 et laver chaque puits avec 1 ml de PBS stérile (pas de FBS). Pour les plaques à 48 puits, la plaque 0,5 x 10 6 cellules / puits dans 0,5 ml de RPMI. Pour les plaques à 24 puits, la culture 1 x 10 6 cellules / puits dans 1,0 ml de RPMI. </li><li> Si tester l&#39;influence d&#39;un facteur tel qu&#39;un médicament ajouter la substance dans les puits appropriés, soit avant, pendant ou après le processus de différenciation en fonction de l&#39;expérience. Ensuite, compléter le milieu de culture avec des cytokines et des anticorps de blocage en conséquence. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml de rmIL-12, 30 U / ml de hIL-2, et 5 000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml de rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / ml 37,51 soluble, et 5 000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, XMG1.2 5000 ng / ml et 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml de rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, XMG1.2 5000 ng / ml et 5,000 ng / ml 11B11. REMARQUE: Les conditions présentées ci-dessus ont été trouvés être optimale pour maximiser la production de cytokines tel que mesuré à la fin de l&#39;expérience de différentiation (section des résultats représentatifs). Cependant, chaque condition doit être optimisée pour les laboratoires individuels (tableau 2 </strong&gt;). En outre, l&#39;addition d&#39;anti-CD28 soluble en plus de l&#39;anti-CD28 lié à une plaque a été trouvé pour améliorer la production de cytokines Th2 dans notre laboratoire, mais n&#39;a aucun effet sur les autres sous-ensembles de cellules T: </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 4-5 D avant l&#39;analyse de l&#39;expression génétique et la production de cytokines. Alternativement, éliminer les cellules des stimuli TCR après 2 d, ajustée à 1 x 10 6 cellules / ml avec un milieu frais, et la plaque dans de nouveaux puits (non-couché) pour améliorer la prolifération et le rendement final. Dans ce cas, les cytokines polarisantes frais et les anticorps ne sont pas nécessaires, mais 10 U / ml d&#39;IL-2 devraient être ajoutés aux nouveaux médias pour Th0, Th1, Th2 et cultures iTreg. </li></ol> 6. Analyse de la différenciation <ol><li> Pour l&#39;analyse des cytokines par cytométrie de flux, restimuler chaque puits avec 10 ng / ml de PMA et 1 000 ng / ml d&#39;ionomycine ou 1 pg / ml anti-CD3 pendant 4-6 heures en présence d&#39;un inhibiteur de Golgi comme brefeldine A (Tableau1). Effectuer une coloration de cytokine intracellulaire en fonction de l&#39;expérience (figure 3). REMARQUE: Teinture des cytokines ou des facteurs de transcription, comme l&#39;IL-4 (non représenté) et non-IFNy spécifique lignée (figure 3) pour les cultures Th17, pour chaque état ​​en tant que témoins négatifs et comme un indicateur de l&#39;efficacité de la différenciation. En outre, la tache de Foxp3 cultures Th17 que le développement réciproque des Treg peut se produire avec l&#39;ajout de TGFß. </li><li> Pour la quantification des protéines, de recueillir les surnageants provenant de chaque puits de dosage et spécifique à une cytokine par ELISA (figure 3). Si l&#39;on craint que le facteur mis à l&#39;essai a influencé la prolifération par rapport aux échantillons de contrôle, les cellules peuvent être lavées, comptées, normalisée, puis restimulées avec 1 ug / ml d&#39;anti-CD3 pour 24 h avant de recueillir surnageants pour les tests ELISA. Si le dosage de l&#39;IL-4 de type Th2 conditions, le lavage et restimulating est nécessaire d&#39;éliminer l&#39;IL-4 qui peut être leftover partir de la culture initiale de différenciation. </li><li> Pour l&#39;analyse de l&#39;expression du gène par PCR en temps réel, les cellules de récolte après la période d&#39;incubation, laver, normaliser et pour stimuler la re-2-6 h avec 1 pg / ml d&#39;anti-CD3 avant la récolte de l&#39;ARNm (figure 3). </li></ol>

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	<li>Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+murine+helper+T+cell+clone.+I.+Definition+according+to+profiles+of+lymphokine+activities+and+secreted+proteins.">Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins.</a> J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).</li><li>Dong, C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+decision:+T-helper+1+and+2+subsets+in+immune+responses.">Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses.</a> Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).</li><li>Hsieh, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+TH1+CD4++T+cells+through+IL-12+produced+by+Listeria-induced+macrophages.">Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages.</a> Science. 260 (5107), 547-549 (1993).</li><li>Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+12+acts+directly+on+CD4++T+cells+to+enhance+priming+for+interferon+gamma+production+and+diminishes+interleukin+4+inhibition+of+such+priming.">Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).</li><li>Szabo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transcription+factor,+T-bet,+directs+Th1+lineage+commitment.">A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment.</a> Cell. 100 (6), 655-669 (2000).</li><li>Afkarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-bet+is+a+STAT1-induced+regulator+of+IL-12R+expression+in+naive+CD4.">T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4.</a> T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+T-bet+is+induced+by+multiple+pathways+and+prevents+an+endogenous+Th2+cell+program+during+Th1+cell+responses.">The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses.</a> Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).</li><li>Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+interleukin+4+(IL-4)-producing+cells+in+vivo+and+in+vitro:+IL-2+and+IL-4+are+required+for+in+vitro+generation+of+IL-4-producing+cells.">Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells.</a> J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).</li><li>Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+directs+the+development+of+Th2-like+helper+effectors.">IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors.</a> J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).</li><li>Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+GATA-3+is+differentially+expressed+in+murine+Th1+and+Th2+cells+and+controls+Th2-specific+expression+of+the+interleukin-5+gene.">Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene.</a> J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).</li><li>Zheng, W., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+is+necessary+and+sufficient+for+Th2+cytokine+gene+expression+in+CD4+T+cells.">The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells.</a> Cell. 89 (4), 587-596 (1997).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li><li>Jiang, S., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+issue+on+CD4(+)+T-cell+subsets.">A complex issue on CD4(+) T-cell subsets.</a> Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).</li><li>Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+Foxp3.">Regulatory T cells and Foxp3.</a> Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).</li><li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance.">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li><li>Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation,+polyendocrinopathy,+enteropathy,+x-linked+syndrome:+a+paradigm+of+immunodeficiency+with+autoimmunity.">Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity.</a> Front Immunol. 3, 211 (2012).</li><li>Shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4+T+cells.">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li><li>Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+CD4++T+cell+lineage+differentiation.">Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation.</a> Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).</li><li>Harrington, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17-producing+CD4++effector+T+cells+develop+via+a+lineage+distinct+from+the+T+helper+type+1+and+2+lineages.">Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).</li><li>Langrish, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+lineage+of+CD4+T+cells+regulates+tissue+inflammation+by+producing+interleukin+17.">A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).</li><li>Chung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+regulation+of+early+Th17+cell+differentiation+by+interleukin-1+signaling.">Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling.</a> Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).</li><li>Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+signaling+in+T+cells+promotes+autoimmune+inflammation.">Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).</li><li>Reynolds, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4(+)+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1.">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li><li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pathogenic+T(H)17+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling.">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrentes.

Bien que la rate contient des cellules Th naïves, la proportion de cette population dans les ganglions lymphatiques est beaucoup plus élevé. L&#39;incapacité d&#39;identifier correctement et enlever les ganglions lymphatiques dans ce protocole se traduira par un mauvais rendement des cellules naïves. Cela peut être particulièrement difficile dans les souris des souris mâles âgés ou qui ont plus de tissus gras. Comme le montre la figure 1, une fixation correcte et piégeage des membres et de la...

Le concept de lignées ou sous-ensembles de CD4 + T auxiliaires distinctes (Th) cellules a été autour depuis la dernière partie du 20 e siècle 1. Reconnaissance de l&#39;antigène correspondant à la présence de signaux de co-stimulation dans les résultats de plusieurs cycles de la prolifération cellulaire et la différenciation ultérieure dans les cellules Th effecteur. Le type de cellule Th générée lors de ce processus dépend de l&#39;environnement de cytokines présentes lors de l&#39;activation 2. Initialement, les cellules Th naïves étaient considérés polariser en deux lignées distinctes suivantes récepteur de cellule T (TCR) d&#39;activation, co-stimulation CD28 ligation et la signalisation des cytokines. 1 des cellules auxiliaires de type Th1 () sont caractérisées par leur production de la cytokine effectrice IFNy ainsi que leur exigence pour l&#39;IL-12 au cours de la signalisation de 3,4 processus de différenciation. Finalement, il a été découvert que les cellules Th1 différenciées ont un profil génétique qui se caractérise plus distinctement by l&#39;expression de la boîte de T facteur de transcription de la famille, Tbx21 (T-bet), qui est considéré comme le régulateur maître du programme génétique Th1 5. En outre, l&#39;IL-12 ainsi que IFN peut favoriser l&#39;expression T-bet 6,7. Dans la réponse immunitaire, les cellules Th1 sont importants pour la défense de l&#39;hôte contre les pathogènes intracellulaires ainsi que des promoteurs forts de l&#39;inflammation auto-immune. En revanche, les cellules de type 2 auxiliaires (Th2) nécessitent l&#39;IL-4 pour leur développement et leur cytokines effectrices, y compris l&#39;IL-4, IL-5 et IL-13, sont importantes pour entraîner des réponses de lymphocytes B et sont pathogènes dans l&#39;allergie 8, 9. Semblables à des cellules Th1, Th2 ont été trouvés pour exprimer leur propre régulateur maître de transcription, appelé GATA-3 10,11. Fait intéressant, la présence de cytokines polarisantes et la génération d&#39;une lignée Th spécifique sont antagonistes à l&#39;élaboration d&#39;autres 2,12, ce qui suggère que seul un sous-ensemble particulier Th peut devenir dominante au cours d&#39;une re immunitaireréponse. Depuis l&#39;identification des lignées Th1 et Th2, d&#39;autres travaux ont démontré sous-ensembles encore plus unique de cellules T auxiliaires, y compris folliculaire aide (TFH), IL-9-production (Th9), et IL-22-production (TH22) (récemment en revue dans 13). Aux fins d&#39;expériences in vitro de différenciation, ce protocole se concentrer uniquement sur ​​deux sous-ensembles Th supplémentaires, appelés cellules T régulatrices (Treg) et les cellules T CD4 + IL-17-production (Th17). cellules T régulatrices CD25 + peuvent se produire naturellement (nTreg) dans le thymus; cellules Th naïves peuvent également être induites (iTreg) pour devenir réglementaire dans la périphérie (revue dans 14,15). Les deux types de Tregs expriment un facteur de transcription caractéristique, appelé boîte forkhead P3 (Foxp3), ce qui est essentiel pour leurs mécanismes de suppression effectrices qui incluent la production soluble anti-inflammatoire médiateur, IL-2 la consommation, et la cellule mécanismes de contact dépendant 14,15. Le manque de Foxp3 résultats d&#39;expression dans un grave, plusieurs organes trouble auto-immune appelés dysrégulation immunitaire, polyendocrinopathie, entéropathie, le syndrome lié à l&#39;X (IPEX), démontrant le rôle critique de ce sous-ensemble Th dans la résolution de l&#39;inflammation et de réglementer la tolérance périphérique aux antigènes du soi 16. In vitro, les cellules T helper CD4 + naïfs jusqu&#39;à régulent Foxp3 et adhérer au programme Treg lors de la stimulation par l&#39;IL-2 et TGF-β 14,15. Il peut être modérée à la plasticité considérable lignées de cellules T CD4 +, en particulier lorsque l&#39;on considère que la production de cytokines (revue dans 17,18). Toutefois, pour les fins de protocoles in vitro de différenciation, nous allons discuter chaque sous-ensemble comme une lignée unique. Récemment, un sous-ensemble de cellules Th17 qui produit la cytokine IL-17 a été identifié comme une lignée unique avec des fonctions pro-inflammatoires qui sont particulièrement pathogène pendant une inflammation auto-immune 19-21. Th17 cellules expriment un facteur de transcription unique appelé liés rétinoïde-récepteur orphelin gamma t (RORγt) qui coordonne le programme génétique 22 Th17. TGFß est important pour la génération de la lignée Th17 par l&#39;induction de RORγt. Cependant, on croit l&#39;effet de la signalisation TGF pour induire seul engagement sur ​​Th17 synergie avec l&#39;IL-6 (revue dans 12). D&#39;autres études ont montré qu&#39;une variété d&#39;autres signaux qui peuvent réguler positivement l&#39;engagement Th17, y compris l&#39;IL-1β, l&#39;augmentation de sodium et de signalisation TLR 23-26. D&#39;autres rapports ont suggéré que les cellules Th17 pathogènes in vivo sont ceux qui contournent effectivement signalisation TGFß et se appuient sur ​​une combinaison de IL-1, IL-6, IL-23 et de 27 leur différenciation. Ainsi, les cellules Th17 peuvent être dérivées d&#39;une variété de voies de signalisation; aux fins de ce protocole, l&#39;couramment utilisé (TGFß et de l&#39;IL-6) voie d&#39;un engagement de la lignée Th17sera présenté. Les protocoles décrits ci-dessous de différenciation pour toutes les lignées effectrices repose sur l&#39;anticorps fixe comme stimuli pour le TCR et CD28 pendant toute la durée de l&#39;expérience. Cependant, d&#39;autres ont démontré que l&#39;activation du TCR avec des cellules présentatrices d&#39;antigène 28 ou de reticulation anti-CD3 et anti-CD28 avec un anticorps de hamster pendant 2 jours 29 sont également des moyens très efficaces pour induire la production de divers sous-ensembles Th. Le protocole présenté ici se appuie sur les méthodes précédemment rapportées pour isoler des cellules T CD4 + murines des organes lymphoïdes secondaires 30 et générer des cellules Th17 31. Une différence majeure est que ce protocole repose sur l&#39;utilisation d&#39;un trieur de cellules pour isoler les cellules T CD4 + naïfs provenant de tissus lymphoïdes. Cependant, de nombreuses entreprises offrent maintenant des kits de séparation rapides qui peuvent enrichir des cellules naïves T CD4 +, qui peuvent être en mesure de contourner l&#39;exigence fou le tri en fonction de l&#39;expérience. Les méthodes et les réactifs présentés dans ce protocole sont ce que nous utilisons régulièrement et de trouver pour être le plus efficace. Cependant, gardez à l&#39;esprit que les réactifs et les méthodes alternatives existent pour la plupart des étapes présentées ci-dessous et ce est au laboratoire individu de déterminer ce qui fonctionnera le mieux pour leurs fins.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Le point de temps pour l&#39;analyse de la différenciation peut varier en fonction de l&#39;état en cours de test Th, ainsi que la force de l&#39;activation du récepteur de cellule T. Après 2-3 jours de différenciation, les cellules peuvent être visualisées par microscopie optique afin de déterminer l&#39;étendue de la prolifération des lymphocytes T. Wells présentant vaste prolifération et l&#39;agglutination des cellules sera probablement prêt pour l&#39;analyse au jour 4. conditions de différenciation r...

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Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.3K vues.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolement et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...