Les auteurs tiennent à remercier Lirui Du pour la construction du vecteur pCAGAdDU et Oliver Gorka pour la fourniture du protocole de fixation.

1. Clonage d&#39;un gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;entrée <ol><li> Cloner le gène d&#39;intérêt dans un vecteur d&#39;entrée. Amplification par PCR du gène suivie d&#39;une ligature d&#39;extrémités franches dans un vecteur topoisomérase couplé (par exemple pENTR / D-TOPO) ou l&#39;enzyme de restriction à médiation par clonage peut être utilisé pour cette procédure. </li></ol> 2. Transfert du gène d&#39;intérêt dans le pCAGAdDu Vecteur de Destination <ol><li> Transférer le gène d&#39;intérêt à partir du vecteur d&#39;entrée dans le vecteur de destination par recombinaison LR (par exemple la passerelle LR Clonase II Enzyme Mix). Cela va créer le vecteur d&#39;expression adénoviraux (Figure 1). </li><li> Linéariser 10 ug du vecteur d&#39;expression adénoviral dans une digestion de restriction PacI, précipiter l&#39;ADN et remettre en suspension dans l&#39;eau à une concentration de 3 pg par 100 pi. Linéarisation libère les répétitions inversées virales (ITR), qui sont nécessaires pour la réplication et l&#39;encapsidation du vADN IRAL dans des particules virales. </li></ol> 3. Génération du lysat Virus primaire <ol><li> Graine de 1 x 10 5 cellules HEK293A dans deux milieux de culture de cellules ml (DMEM, 10% FBS, 5% Penstrep) dans un puits d&#39;une plaque de 6 puits et incuber les cellules pendant 6 à 14 heures à 37 ° C en 10% Incubateur à CO 2 pour leur permettre d&#39;adhérer. Les cellules doivent alors être à la confluence d&#39;environ 50%. </li><li> Lipofection: Transfert 6 pi de réactif jetPEI dans 94 ul de 50 uM NaCl, brièvement vortex. Ajouter la solution mélangée à 100 pi vecteur adénovirus linéarisé en vortex et incuber ce mélange de transfection pendant 15 - 30 min à température ambiante. </li></ol> Effectuez toutes les étapes suivantes dans les conditions appropriées de biosécurité pour l&#39;infection à adénovirus! <ol start="3"><li> Verser goutte à goutte la solution dans la cellule contenant HEK293A bien et incuber les cellules à 37 ° C et 10% de CO 2. Lorsque vous utilisez un marqueur de fluorescence, d&#39;évaluer le transfeefficacité ction visuellement après 12 à 36 h à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à fluorescence. Ajouter 0,5 ml de milieu frais tous les 3 jours. </li><li> Consultez toutes les 2 - 3 jours avec un microscope optique ou de fluorescence pour effet cytopathogène (CPE), qui sont des zones avec des cellules élargies et arrondies qui commencent à se détacher. Ceci est révélateur de la génération de virus efficace. Lors de l&#39;apparition de zones plus larges du CPE (figure 3), il faudra 24 à 72 h avant de toutes les cellules sont infectées. </li><li> Lorsque toutes les cellules présentent des signes de CPE, mais avant un décollement de l&#39;ensemble des cellules se produit, détacher les cellules par pipetage doux et les cellules de transfert de surnageant (SN, 3-5 ml) dans un tube en polystyrène de 15 ml. </li><li> Geler les cellules de la SN sur glace sèche pendant 15 - 20 min et décongeler rapidement à 37 ° C après la rupture des cellules. Répétez ce gel-dégel et-cycle (F / TC) deux fois plus. Gardez le lysat primaire du virus sur la glace pour une utilisation dans un jour ou le congeler à -80 ° C pour le stockage à long terme. Toute F supplémentaire/ TC permettra de réduire le titre viral de 30 - 50%. </li></ol> 4. amplification du virus <ol><li> Semences et cultiver des cellules HEK293A à 90% de confluence sur un cm boîte de culture 14 tissulaire. </li><li> Infecter les cellules avec la moitié du lysat de virus primaire (1,5 - 2,5 ml) et incuber les cellules pendant au moins 36 h. Presque toutes les cellules devraient être infectés puis, qui peut être déterminé par microscopie à fluorescence. Pour la ré-amplification d&#39;un stock de virus déjà amplifié (soit plus concentré), infecter HEK293A à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 50 (voir 6.3). </li><li> Les cellules doivent être récoltées lorsque tous d&#39;entre eux montrent CPE mais avant détachement. Avec une production efficace du virus cet état est atteint dans les 48 heures après l&#39;infection. (Si cela prend jusqu&#39;à une semaine, envisager un autre cycle d&#39;amplification en augmentant la quantité de stock de l&#39;adénovirus utilisé pour l&#39;infection décrite au point 4.2.) </li><li> Détacher les cellules par pipetage doux et des cellules de transfert et SN pour un tube en polystyrène de 50 ml. Spin cellules vers le bas à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirez le SN et remettre le culot dans un volume approprié de milieu ou SN (environ 1 ml). </li><li> Effectuez 3 F / TC de perturber les cellules et centrifuger à 800 xg pendant 15 min à 4 ° C. Enlevez le SN qui contient les particules de virus (c&#39;est à dire le lysat de virus concentré), et aliquote du lysat de virus de la stocker à -80 ° C. </li></ol> 5. Virus Détermination du titre <ol><li> Seed 10 5 cellules A549 par puits en 5 puits d&#39;une plaque de 12 puits dans 1 ml de milieu et de laisser cellules adhèrent pendant 6 heures. </li><li> Utilisez 1 pl de l&#39;adénovirus concentré (décongelé sur glace) pour effectuer une dilution en série dans le milieu (1:5000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) et ajouter 10 ul par puits. Laissez un bien non infecté pour régler le déclenchement en cytométrie en flux. </li><li> Après 36 heures, enlever le SN, lavez avec PBS, les cellules et détachement (par exemple par traitement à la trypsine). Pour les précautions risques biologiques, il est recommandé de fixer caunes de 100 pi paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante et lavage avec du PBS seule fois. </li><li> Effectuer une analyse FACS de l&#39;expression du marqueur d&#39;infection. Plot &#39;ul lysat viral appliquée »contre le nombre absolu de cellules infectées (figure 4). Déterminer la plage linéaire de l&#39;infection et de calculer le titre par ml de virus non dilué à partir de la courbe d&#39;étalonnage sur la plage linéaire avec x = 1000 pl. </li></ol> 6. L&#39;infection des cellules T <ol><li> Isoler les cellules T CD4 naïfs / repos de DO11.10 tg; souris Tg CARΔ1 utilisant MACS (T CD4 + naïves cellulaire Isolation Kit II) ou FACS (CD4 + CD25 + CD44-CD62L-). </li><li> Pour les expériences à petite échelle, une pipette un volume approprié de lysat viral pour atteindre une MOI de 50 dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits à fond rond. </li><li> Ajoutez jusqu&#39;à 4 x 10 5 cellules T dans un volume d&#39;infection final de 50 ul dans un milieu de cellules T (RPMI1640, 10% de FBS, 5% Penstrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamine, 1x L-glutamine, 1:250.000 Mercaptoéthanol, HEPES 10 mM). Exemple: Une MOI de 50 doivent être utilisés pour infecter 3 x 10 5 cellules T; le titre viral est de 3 x 10 9 ml -1 volume de virus = MOI x T numéro de cellulaire / titre viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0,005 ml </li></ol> Note: pour une infection du nombre de cellules plus grandes, l&#39;échelle en utilisant une MOI de 50 dans un volume d&#39;infection de 165 pi par 10 6 cellules T naïves dans un tube de polystyrène avec la tasse lâche (jusqu&#39;à tp 3 ml par tube). <ol start="4"><li> Incuber les cellules pendant 90 min à 37 ° C dans 5% d&#39;un incubateur à CO 2. </li><li> Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN. </li></ol> (Facultatif: les cellules peuvent être lavées à nouveau pour supprimer le virus plus efficacement) <ol start="6"><li> Remettre les cellulesdans 200 pi de milieu de cellules T sans anticorps stimulant et sans IL-2 ou d&#39;autres cytokines et les reposer pendant 40 heures à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur pour permettre l&#39;expression du gène d&#39;intérêt avant l&#39;activation. </li></ol> 7. Activation des cellules T et de la polarisation <ol><li> Pipette un volume d&#39;anti-CD3 et perles anti-CD28 couplés qui est égal au nombre de cellules (par exemple 4 x 10 5) dans une petite tasse de réactif, ajouter le volume 10 fois de PBS et mettez-les sur un aimant pour 2 min . Enlever le surnageant et remettre en suspension les perles dans 200 pi de milieu polarisant (pour les Tregs: milieu de cellules T + 1 ng / ml TGFß, 100 U / ml d&#39;IL-2). </li></ol> Note: Les cellules peuvent également être activés à l&#39;aide des boîtes de culture de tissu recouvertes d&#39;anticorps anti-CD28 et anti-CD3, ou d&#39;une manière spécifique du récepteur DO11.10 cellules T en utilisant irradiés splénocytes BALB / c pulsées avec de l&#39;ovalbumine 323-339 antigène peptidique. <ol start="2"><li> Centrifuge le reposa cellules comme avant, enlever le SN et remettre les cellules dans 200 ul milieu polarisant contenant des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 anticorps couplés à des perles. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur sans changer de support. </li></ol> 8. T Fixation cellulaire et coloration pour cytométrie en flux <ol><li> Laver les cellules: Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN. Effectuez toutes les étapes de lavage suivantes en conséquence. </li><li> Reprendre les cellules dans 100 ul solution fixable de coloration de cellules mortes et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules, remettre en suspension dans 100 pi de PBS, ajouter 100 ul paraformaldéhyde 4% dans du PBS, incuber 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules, les remettre en suspension dans 200 pi glacée 70% de méthanol dans du PBS et incuber pendant 30 min sur la glace. </li></ol> Note: Les cellules peuvent être traités à partir de maintenant sans précaution Biohazard!<ol start="5"><li> Préparer 60 pl mélange-maître de 60 pi de PBS + 10 pg / ml Fc-bloc (anti-FCR3 pour bloquer la liaison non spécifique). Laver les cellules, les remettre en suspension dans 40 pl de PBS + anti-FCR3 et incuber 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 20 ul de PBS + anti-FCR3 contenant 1 pg d&#39;anticorps anti-Foxp3 PE-couplé, bien mélanger et laisser incuber à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Laver les cellules deux fois dans du PBS et analyser les cellules sur un cytomètre de flux. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Génération Virus et titrage Pour obtenir des résultats de transfection optimales, la qualité et la quantité de vecteur linéarisé semblent les plus importants. Nous n&#39;avons pas observé d&#39;effets négatifs sur la production de lysat primaire d&#39;une prolifération initiale de la culture depuis l&#39;infection va procéder rapidement une fois que la production de virus efficace se produit. Cependant, la production de virus par les cellules HEK293A peut être affectée par de longs...

Tregs sont cruciales pour maintenir la tolérance immunitaire et à atténuer la réponse immunitaire de surréaction. Tregs supprimer l&#39;activation des cellules T du spectateur. Par conséquent, l&#39;ablation des Tregs conduit à l&#39;auto-immunité fatal et l&#39;auto-destruction entraînée par les cellules T activées 1. Tregs se développent dans le thymus au cours de sélection négative des CD4 précurseurs mono-positifs, mais ils peuvent aussi faire la différence dans la périphérie de CD4 des lymphocytes T naïfs lors de la stimulation antigénique faible dose optimale avec 1,2 co-stimulation. Thymique Tregs semblent supprimer l&#39;auto-immunité tissu contre des auto-antigènes, alors que périphérique Tregs ont été impliqués dans la fourniture de tolérance dans l&#39;intestin ou du poumon. Ceux-ci induit Tregs puissamment prévenir l&#39;activation des lymphocytes T après la reconnaissance d&#39;antigènes étrangers dans la muqueuse, y compris antigènes environnementaux de la nourriture et de l&#39;air, les bactéries commensales, et les allergènes 3,4. En outre, les Tregs sont essentielles pour établir la tolérance maternelle de peptides fœtales 5 et à prévent la maladie du greffon contre l&#39;hôte 6. Dans le même temps, Tregs également médier les effets indésirables en atténuant la surveillance immunitaire des cellules tumorales 7,8. La fonction caractéristique de Tregs est l&#39;expression de la sous-spécification transcription Foxp3 facteur, un facteur de transcription contenant un domaine fourche tête qui est nécessaire et suffisante pour conférer une fonction 9,10 Treg. Certaines voies de signalisation qui peuvent induire l&#39;expression de Foxp3 sont connus. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent, réguler ou moduler Treg différenciation en réponse au récepteur des cellules T déclenchement sont moins bien compris. Tregs peut être très efficace induite in vitro par la stimulation des cellules T CD4 naïfs avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 en présence de TGF et IL-2 11. Comme les Tregs émergents sont fonctionnelles in vivo, la manipulation de molécules qui favorisent la différenciation Treg porte un énorme potentiel pour l&#39;avenir therapies, par exemple, le traitement de l&#39;asthme, la maladie de Crohn et la transplantation 11,12. Inversement, la modulation thérapeutique de molécules afin de bloquer la différenciation Treg peut offrir des avantages dans les futures approches de traitement combiné des patients atteints de tumeurs. Dans les essais de différenciation in vitro ont joué un rôle important pour la description des changements moléculaires qui sont associés avec T différenciation de sous-ensemble de cellules. À l&#39;heure actuelle, les tentatives expérimentales à la recherche ou à l&#39;écran pour les produits de gènes qui contrôlent la différenciation des cellules T sont entravés par le fait que les méthodes les plus courantes de l&#39;expression des gènes extra-utérine ne parviennent pas dans les cellules T naïves. Par exemple, l&#39;électroporation et la transduction rétrovirale ne sont efficaces que dans les cellules T activées. Contrairement aux attentes initiales, la transduction lentivirus, qui est généralement efficace dans les cellules au repos, nécessite de pré-activation des cellules T naïves par des cytokines 13. En outre, le transfert de l&#39;ADNc ou de l&#39;ARNm durant l&#39;électroporationimplique une dépolarisation de la membrane plasmique, qui lui-même confère des caractéristiques de l&#39;activation des cellules T et peut même mobiliser Ca 2 + signalisation et activer des protéines NFAT (observation et ref inédit. 14). De même, pour la transduction rétrovirale, les cellules T naïves doivent être activés pour 18 - 40 h. Pendant ce temps, la répartition de la membrane nucléaire au cours de la division cellulaire se produit et permet l&#39;intégration de la génomique ultérieure du vecteur rétroviral 15. Ces méthodes ne sont donc pas en mesure de répondre à la régulation moléculaire début de la rencontre initiale des lymphocytes T avec l&#39;antigène, qui est la phase décisive de la différenciation des cellules T helper. Transduction adénovirus est connue pour conférer une expression ectopique du gène passagère dans un certain nombre de types de cellules humaines qui expriment le récepteur de l&#39;adénovirus humain Coxsackie (CAR). Il procède sans obligation pour l&#39;activation de la cellule ou de la progression du cycle cellulaire. L&#39;expression de surface de CAR est essentiel pour la fixation du virus efficace et l&#39;intériorisation et l&#39;expression transgénique de la version tronquée CARΔ1 sous un promoteur spécifique des cellules T a été trouvée pour rendre thymocytes de souris et des cellules T sensibles à l&#39;infection par adénovirus 16. Surtout, le transgène ne modifie pas le développement des thymocytes ou la différenciation in vitro des cellules CD4 T naïfs cellules dans différents sous-ensembles (données non présentées; ref 17).. Transduction adénovirus des cellules T a déjà été utilisé pour la surexpression 17,18 et knock-down approches 19,20. Les cellules T transgéniques peuvent être purifiés à partir de commerce DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. et ref 17).. Surtout, transduction adénovirale permet une haute expression d&#39;un gène d&#39;intérêt dans des cellules T naïves sans induire des signes évidents d&#39;activation. Les lymphocytes T restent naïfs (CD44 faible, CD62L élevé) et de repos (CD25 -, CD69 -) après infectisur et peut être activée et différenciée en Treg similaire aux cellules non infectées. Production d&#39;adénovirus recombinants peut être atteint après transfection de cellules avec des plasmides HEK293A adénoviraux (Figure 1). Ces plasmides contiennent généralement du génome de l&#39;adénovirus humain de type 5 avec les gènes E1 et E3 supprimées pour rendre adénovirus recombinants incompétent pour la réplication 21. Cellules HEK293A complètent carence de réplication tels qu&#39;ils ont été immortalisés par l&#39;intégration stable de l&#39;adénovirus 22 cisaillé. Depuis vecteurs adénoviraux sont grandes (~ 40 kb) et par conséquent pas bien adapté pour l&#39;enzyme de restriction induite par clonage traditionnel, nous avons utilisé le système de passerelle. Le gène d&#39;intérêt est initialement clonée dans un vecteur d&#39;entrée plus petit, à partir de laquelle il peut être facilement transféré dans le vecteur adénoviral de destination par l&#39;intermédiaire de la réaction de recombinaison lambda (LR) 23. Nous avons construit le vecteur pCAGAdDuen associant le promoteur CAG (promoteur de l&#39;actine de poulet et CMV) avec une cassette d&#39;expression contenant des sites LR flanquant le marqueur de sélection ccdB procaryote 24. Cette cassette d&#39;expression est fusionnée à un site d&#39;entrée interne du ribosome (IRES) de l&#39;élément qui permet de co-expression du marqueur renforcée protéine eucaryote de l&#39;infection fluorescente verte (EGFP), qui est fusionné à une séquence contenant l&#39;hormone de croissance bovine poly (A) de signal. Nous avons choisi des séquences cis-régulatrices CAG, puisque le promoteur CMV prototype a été jugée hautement dépendant de l&#39;activation et donc défavorable pour l&#39;expression des gènes dans les cellules T naïves. Ici, nous fournissons un protocole pour l&#39;efficacité dans Treg différenciation in vitro et une méthode pour la transduction de CD4 des lymphocytes T naïfs sans activation (figure 2). La méthode permet l&#39;expression des gènes extra-utérine ou abattre CD4 précédents différenciation des cellules T à l&#39;état naïf. Il permet de tester l&#39;effet d&#39;une overexpressegène d &#39;intérêt au cours des événements de signalisation précoces lors de la stimulation initiale TCR jusqu&#39;à engagement de sous-ensemble de cellules T. Nos expériences de validation fournissent également la base pour établir l&#39;application de l&#39;adénovirus similaire dans la différenciation des autres sous-ensembles de cellules T comme Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou des cellules TFH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

Les cellules T régulatrices (Treg) sont essentielles pour assurer la tolérance immunitaire à l&#39;auto ainsi que pour certains antigènes étrangers. Tregs peut être généré à partir de cellules T CD4 naïves in vitro avec le TCR et co-stimulation en présence de TGF et de l&#39;IL-2. Cela porte un énorme potentiel pour de futurs traitements, cependant, les molécules et les voies de signalisation que la différenciation de contrôle sont largement inconnues. Les cellules T primaires peuvent être manipulés par l&#39;expression des gènes extra-utérine, mais les méthodes communes parviennent pas à cibler l&#39;état naïf le plus important de la cellule T avant la reconnaissance de l&#39;antigène primaire. Ici, nous fournissons un protocole d&#39;exprimer des gènes extra-utérines en cellules T CD4 naïves in vitro avant d&#39;induire la différenciation Treg. Elle s&#39;applique transduction avec l&#39;adénovirus déficient pour la réplication et explique sa génération et de la production. L&#39;adénovirus peut prendre jusqu&#39;à de grands inserts (jusqu&#39;à 7 ko) et peut être équipé avec les promoteurs pour atteindre la haute et transitoire OVEREXPression dans les cellules T. Il transduit efficacement les lymphocytes T de souris naïves si elles expriment un récepteur de l&#39;adénovirus Coxsackie transgénique (CAR). Surtout, après l&#39;infection, les lymphocytes T restent naïfs (CD44 faible, CD62L élevé) et de repos (CD25 -, CD69 -) et peuvent être activées et différenciées en Tregs similaires aux cellules non-infectées. Ainsi, cette méthode permet la manipulation de cellules CD4 T différenciation cellulaire depuis ses débuts. Il assure que l&#39;expression des gènes extra-utérine est déjà en place lorsque les événements de signalisation précoces de la stimulation initiale TCR induit des changements cellulaires qui aboutissent dans Treg différenciation.

La production de virus Pour la production de titres élevés de virus, le moment de la récolte des cellules HEK293A dans la production primaire du virus ou d&#39;amplification du virus est cruciale. Représentant images de contraste fluorescents et en phase avec les signes visuels de la production de virus sont présentés dans la figure 3. Le CPE a été observée 10 jours après transfection de cellules HEK293A avec un pCAGAdDu contrôle vectoriel sans insert. CPE sont carac...

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Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Le transfert de gène adénoviral en CD4 des cellules T naïves avec expression transgénique du récepteur de l&#39;adénovirus Coxsackie permet l&#39;analyse moléculaire de la différenciation des cellules T régulatrices<em&gt; In vitro</em&gt;.

Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K vues.  Helmholtz Zentrum München. Le transfert de gène adénoviral en CD4 des cellules T naïves avec expression transgénique du récepteur de l'adénovirus Coxsackie permet l'analyse moléculaire de la différenciation des cellules T régulatrices In vitro.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation de queue peau d&#39;étudier allogéniques CD4 réponses des cellules T chez la souris

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Déchiffrer l’engagement précoce des lymphocytes T auxiliaires folliculaires dans l’infection aiguë à LCMV

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Pleins feux sur l’auteur : Élucider les voies de différenciation des cellules TFH dans les défis aigus du LCMV

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...