Department of Defense (Prix Idée W81XWH-07-0406) - Pour Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Pour Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Pour Ulus Atasoy Université de Missouri fonds institutionnels - Pour Ulus Atasoy

Préparation Expérience Avant de commencer l&#39;expérience, il est essentiel d&#39;avoir tous les réactifs, les contenants et les ustensiles RNase libres. Traiter la verrerie avec inhibiteur de RNase (RNaseZAP, Ambion) suivie d&#39;un rinçage à l&#39;eau traitée au DEPC. Assurez-vous que tous les réactifs sont confirmés comme RNase. 1. Préparer mRNP Lysate <ol><li> Cultiver et récolter les cellules des tissus en croissance exponentielle pour produire entre 2-5 mg de protéines totales pour chaque RIP. <ol class="lalpha"><li> Deux P150 boîtes de culture sont généralement suffisants. </li><li> Pour chaque RBP objet d&#39;une enquête, le total des quantités cellulaires numériques et les protéines doivent être optimisées afin de maximiser l&#39;ARNm cible appropriée et les interactions pratiques commerciales restrictives. </li><li> RIP pour qRT-PCR peut exiger lysat cellulaire moins (environ 400 ug de protéine totale) grâce à son amplification et la méthode de détection en particulier pour les pratiques commerciales restrictives abondance élevés tels que HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 8-10 min à 4 ° C, puis laver trois fois avec PBS glacé. </li><li> Après lavage final, tapotez doucement la partie inférieure du tube et resuspendre le culot cellulaire dans des volumes égaux de tampon de lyse préparée polysome (PLB) avec les inhibiteurs de la protéase et la RNase. <ol class="lalpha"><li> Il est recommandé de mesurer le volume exact de culot cellulaire. </li></ol></li><li> Mélange pipette doucement (ne pas vortexer) pour briser les amas de cellules et incuber lysat sur glace pendant 5 min. </li><li> Centrifugeuse à 13.000 xg pendant 20 min à 4 ° C pour effacer le lysat de débris. </li><li> Transférer immédiatement effacé surnageant dans le tube de centrifugeuse pré-réfrigérés. </li><li> Garder sur la glace et conserver à -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Congélation immédiate complète la lyse des cellules correcte et empêche la liaison indésirable. Passez par le dégel RIP échantillon immédiatement suivant et conserver les échantillons sur la glace pour éviter la dégradation des ARN. &lt;/ Li&gt; <li> Ce lysat peut être stocké pendant jusqu&#39;à six mois à -80 ° C. Eviter de multiplier les cycles de congélation-décongélation, car cela peut conduire à des protéines et / ou la dégradation de l&#39;ARNm. </li></ol></li><li> Quantifier la concentration de protéines dans le lysat en utilisant un dosage standard de protéines Bradford. </li></ol> 2. Protéine d&#39;enveloppe A billes de sépharose avec des anticorps et Wash <ol><li> Pré-houle protéine A-Sepharose (PAS) des perles pendant la nuit dans NT2 tampon (volumes 3-4) avec 5% de SAB. Stocker à 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Le stockage à long terme de plusieurs mois à 4 ° C est possible lorsque complété avec de l&#39;azide de sodium à 0,1%. </li><li> Billes de Sepharose protéines doit être choisie en fonction de l&#39;isotype de l&#39;anticorps RBP cible. Un protéines G, et A / G ont toutes des cibles spécifiques d&#39;isotype et de modification de l&#39;affinité cible. Un protéines perles de sépharose ont été utilisés en fonction de la spécificité et de l&#39;affinité isotype des anticorps anti-protéines HuR. </li></ol></li><li> Avant toute utilisation, enlever l&#39;excès de tampon NT2, de sorteque les perles finales au rapport du tampon est de 1:1. </li><li> En utilisant des tubes de 1,5 ml microtubes RNase, retirez PAS 100 pl de suspension et ajouter 30 pg d&#39;anticorps pour chaque réaction IP individuelle (c.-à-spécifique RBP et contrôle isotypique). </li><li> Ajouter 100-200 ul de tampon NT2 à l&#39;anticorps talon mix. <ol class="lalpha"><li> Mélange peut être conservé pendant plusieurs semaines à 4 ° C quand il est complété avec de l&#39;azide de sodium à 0,1%. </li><li> Un anticorps d&#39;isotype apparié ou toute sérums normaux de même espèce doit être utilisé en parallèle comme un contrôle de l&#39;anticorps contre l&#39;ARN de fond. </li></ol></li><li> Ajouter anticorps approprié mélange de billes et incuber pendant la nuit, tumbling fin sur l&#39;extrémité à 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimiser le titre d&#39;anticorps de la protéine spécifique à l&#39;étude (pg 1, 5, 10 ou 30 de l&#39;anticorps est généralement suffisant). </li></ol></li><li> Préparer anticorps billes revêtues immédiatement avant l&#39;utilisation d&#39;un lavage avec 1 ml deglacée NT2 tampon de 5 fois. <ol class="lalpha"><li> Laver mélange de billes par centrifugation à 13.000 xg pendant 1-2 min à 4 ° C. </li><li> Retirez délicatement le maximum de surnageant avec pipette à la main ou un aspirateur mais attention à ne pas perturber le culot. </li><li> Lavage aide à éliminer les anticorps non liés ainsi que les contaminants RNase partir d&#39;un mélange d&#39;anticorps. </li></ol></li><li> Une fois que le dernier lavage est terminé, remettre en suspension les billes dans 700 ul d&#39;glacé NT2 tampon suivi d&#39;un traitement avec des inhibiteurs de RNase différents pour protéger les ARNm cibles, y compris 10 pl de RNase Rupture à 40 U / ul, 10 ul de 100 mM TNT et 15 ul d&#39;EDTA (15 mM). Amener le volume à 1000 pi avec NT2 tampon. <ol class="lalpha"><li> Complexes de vanadyle ribonucléoside ne sont pas utilisés en raison de l&#39;effet inhibiteur de l&#39;EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprécipitation et de l&#39;ARN Précipitations <ol><li> Étape facultative Préclair:<ol class="lalpha"><li> Pour réduire le fond, des perles et des anticorps de contrôle peut être utilisé pour pré-clair lysat. Cela peut réduire de signal à la sortie. </li><li> Cette étape peut être nécessaire de réduire le fond lorsque vous faites IP suivie par microarray. Il n&#39;est généralement pas nécessaire pour IP suivie par qRT-PCR. </li><li> Préclair avec 15 pg de contrôle isotypique pour 30 min / 4 ° C fin tombant sur la fin. </li><li> Ajouter 50 ul de billes PAS pré-gonflée non enrobées avec l&#39;anticorps de l&#39;étape 2.1. </li><li> Incuber 30 min / 4 ° C avec rotation sur l&#39;extrémité fin </li><li> Centrifuger à 10000 xg à 4 ° C. Conserver le surnageant pour la propriété intellectuelle. </li></ol></li><li> Ajouter 100 ul de lysat clarifié isolé (environ 2-5 mg) de mélange d&#39;anticorps préparée. <ol class="lalpha"><li> Dilution lysat aidera à réduire le fond et la liaison non spécifique. </li><li> Montant de la contribution lysat peut varier en fonction de la méthode de détection et l&#39;abondance des RBP ol&#39;efficacité de l&#39;anticorps r RBP comme indiqué dans 1.1.C. étape </li></ol></li><li> (Optionnel) Mélanger immédiatement tube en effleurant doucement plusieurs fois suivi par une brève centrifugation à 10.000 xg à 4 ° C à billes de granulés et de retirer immédiatement 100 pl de surnageant comme une représentation ARNm total des intrants pour l&#39;analyse qPCR en utilisant des techniques d&#39;isolement d&#39;ARN. <ol class="lalpha"><li> Cette étape consiste à confirmer que l&#39;entrée lysat ARN est optimale pour la propriété intellectuelle et ne doivent être effectuées que d&#39;une étape de contrôle ou comme une étape de dépannage suivant RIP avec des résultats ARN pauvres. </li></ol></li><li> Envelopper dans un tube de parafilm afin d&#39;assurer une fermeture hermétique et laisser incuber à 4 ° C pendant 2 à 4 heures, tumbling fin sur l&#39;extrémité. <ol class="lalpha"><li> Timing sur incubation doit être optimisée en fonction de l&#39;abondance cible et doit être minimisée pour éviter réarrangement complexe ou de dégradation. Pour certaines pratiques commerciales restrictives courtes incubations peuvent être plus optimale. </li></ol></li><li> Perles pellets à 5.000 XGFou 5 min à 4 ° C et conserver le surnageant pour l&#39;analyse par Western blot potentiel. Boutique aliquotes à -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Des aliquotes de surnageant avec de grandes quantités de protéine cible résiduel peut indiquer une défaillance de la protéine à être précipité par billes de sépharose. </li></ol></li><li> Comme décrit précédemment, laver perles 5 fois avec 1 ml de tampon glacé NT2 et centrifugation (5000 xg pendant 5 min à 4 ° C), puis enlever le surnageant avec pipette à la main ou un aspirateur. <ol class="lalpha"><li> Méthodes de lavage plus rigoureuses peuvent être utilisés pour réduire le fond en le complétant NT2 tampon avec le désoxycholate de sodium, l&#39;urée ou le SDS. </li><li> Conserver les échantillons sur la glace autant que possible et de travailler rapidement pour minimiser la dégradation de l&#39;ARNm cible. </li></ol></li><li> En option: Enregistrer une petite aliquote (10%) du mélange de billes ou d&#39;exécuter un échantillon supplémentaire en parallèle pour vérifier l&#39;efficacité de la protéine cible IP en utilisant une analyse par Western blot.</li></ol> 4. DNase et la protéinase K Traitements <ol><li> Après le lavage, les billes remettre les avec 100 ul de tampon NT2 supplémenté avec 5 ul de RNase-free DNase 1 (2 U / pl). </li><li> Conserver à 37 ° C pendant 5-10 min. Ajouter 1 ml de tampon NT2 et centrifuger à 5000 xg pendant 1 min à température ambiante. <ol class="lalpha"><li> Un petit (~ 10%) aliquote de billes peuvent être utilisés pour vérifier l&#39;efficacité IP par analyse SDS-PAGE. </li></ol></li><li> Resuspendre PAS concentré dans 100 ul de tampon NT2, 5 pi protéinase K (10 mg / ml), et 1 pi SDS à 10%. </li><li> Incuber le mélange remis en suspension de billes pendant 30 min à 55 ° C dans un bain d&#39;eau, doucement effleurant à toutes les 10 min. <ol class="lalpha"><li> Protéinase K facilitera la libération des composants RNP. </li></ol></li><li> Perles granulés dans 5000 xg pendant 5 min à température ambiante (RT) et recueillir le surnageant (~ 100 pi). </li><li> Ajouter 200 ul de tampon NT2 à billes, centrifuge 5000 xg pendant 2 min à température ambiante, ramasser le surnageant (~ 200 pi), et des perles de rejet. </li><li> Combinez surnageants (100 pi et 200 pi) et ajouter 300 ul couche inférieure de l&#39;acide phénol-CHCl 3. </li><li> Vortex, 1 min RT (ou 37 ° C dans un shaker) et centrifuger à 16000 xg à température ambiante pendant 1 min. </li><li> Recueillir 250 ul de la couche supérieure (NE PAS perturber l&#39;interface), ajouter 25 ul d&#39;acétate de sodium à pH 5,2, 625 ul EtOH à 100% et 5 glycoblue pi, et bien mélanger. </li><li> Rangez la nuit à -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Pour assurer une récupération correcte de l&#39;ARN, l&#39;addition de glycoblue va augmenter la visibilité de la culot d&#39;ARN, en agissant comme une molécule porteuse. </li></ol></li><li> Le lendemain, les tubes de mélange par inversion 3-5 fois, tournent à 12.000 xg à 4 ° C pendant 30 min et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de EtOH à 70% à la pastille bleue et mélanger par inversion ou vortex. </li><li> Centrifuger 12.000 xg à 4 ° C pendant 2 min. </li><li> Discard surnageant et centrifuger 12.000 xg pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Retirez tout ETOH résiduelle de 70% avec une pipette et l&#39;air sec de bouletage à TA pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension dans ul 20-40 du RNase / DNase eau ou un autre volume approprié selon les besoins. <ol class="lalpha"><li> L&#39;échantillon est maintenant prêt pour d&#39;autres applications en aval tels que qRT-PCR ou puces à ADN. </li><li> Spectrophotométrie Nanodrop peut être utilisée pour évaluer la concentration d&#39;échantillon, mais de précieux échantillons, il peut être avantageux d&#39;éviter échantillons nanodropping car il peut être inutile et relativement imprécis. Nous vous proposons des échantillons de normalisation à transcrits du gène d&#39;entretien ménager pour évaluer la pureté et l&#39;efficacité IP pour les échantillons précieux de rendement ou faible. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs Si la procédure est optimisé et réalisé correctement, l&#39;immunoprécipitation devrait donner enrichissement significatif des ARNm cibles. Typiquement, En fonction de la RBP et son ARNm cible (s), nous voyons enrichissement d&#39;environ 10 - à 50 fois lorsqu&#39;elle est évaluée par qRT-PCR. De nombreux objectifs de pratiques commerciales restrictives peuvent être découverts en masse en utilisant l&#39;analyse des microréseaux. Cependant, cette méthode est plus sensible à la dégradation par rapport à qRT-PCR. En fonction de la RBP, le nombre de cibles et de l&#39;efficacité de la réaction, puces à ADN peuvent révéler des centaines de nouvelles cibles, ou il ne peut découvrir quelques-uns, le cas échéant. Par exemple, l&#39;un des mieux caractérisés ARN protéines HuR obligatoire, post-transcriptionnel régule l&#39;expression et la traduction de nombreux gènes importants physiologiques 1, 2. L&#39;isolement du HuR-ribonucleo complexe via le protocole RIP-Chip dans les lignes cellulaires du cancer du sein, par exemple, a révélé l&#39;enrichissement de plusieurs objectifs importants Hur connus, y compris β-actine en utilisant qRT-PCR comme le montre la figure 1. Dans les deux lignées de cellules cancéreuses β-actine est enrichie 12 - à 15 fois. En règle générale, lorsqu&#39;il est effectué correctement, nous voyons une importante enrichment de β-actine dans différentes lignées cellulaires. Toutefois, si le RIP ne révèle aucun enrichissement significatif pour β-actine cela indique un problème avec le RIP et la procédure peut être répétée. Par ailleurs, l&#39;analyse des microréseaux d&#39;échantillons immunoprécipités provenant de ces lignées cellulaires ont révélé des sous-ensembles distincts d&#39;expression de cibles Hur en récepteurs aux œstrogènes différents (ER) de cellules positives MCF-7 de cancer par rapport aux ER négatives lignes du sein MB-231 de cellules cancéreuses comme le montre la figure 2 1. Ces objectifs se répartissent en plusieurs catégories: les objectifs Hur connus et inconnus qui étaient soit associés ou non associés au cancer. Par exemple, CALM2 et CD9 sont à la fois les gènes du cancer qui n&#39;ont pas été précédemment identifiées comme cibles Hur. Utilisation de la puce à ADN et en confirmant avec qRT-PCR, CALM2 et CD9 sont révélés être de 5 - à 180 fois enrichi dans le culot HuR indiquant une interaction importante entre la protéine et HuR ces gènes cibles. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figure 1&quot; /&gt; Figure 1. Immunoprécipitation et RIP MB-231 (ER-) et MCF-7 (ER +) des cellules cancéreuses du sein. Immunoprécipitations ont été réalisées à partir de MB-231 ou MCF-7 lysats cellulaires en utilisant anti-HuR anticorps monoclonal (3A2) et IgG1 isotype contrôle. IP A. ouest de HuR révélé bande de taille attendue détectée par 3A2. Groupe d&#39;experts sur le droit révèle quantités de HuR en entrée lysats occasion à partir de deux lignées cellulaires, avec β-tubuline comme un contrôle du chargement. B. Vérification par RT-PCR quantitative a montré quinze et onze fois enrichissements de β-actine, une cible HuR connu, dans les PI 3A2 du MB-231 et MCF-7, respectivement. Toutes les valeurs ont été normalisées à ΔΔCT GAPDH. Des expériences ont été faites en double exemplaire (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. HuR RIP-CHIP identifie différents profils génétiques dans ER + et les cellules cancéreuses du sein ER-.Immunoprécipitations ont été réalisées à partir de Hur MB-231 ou MCF-7 lysats cellulaires en utilisant un anticorps IgG1 et HuR contrôle isotypique hybridé à Illumina tableaux Sentrix (47.000 gènes). Les signaux de commande ont été soustraites. Les résultats représentent les données cumulatives de 12 tableaux différents. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3) pour chaque lignée cellulaire avec des contrôles correspondants. Les échelles sont log2.

<ol>
	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis.">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li><li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li><li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonomics:+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays.">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera.">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+RIP-Chip+Analysis.">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li><li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li><li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR:+post-transcriptional+paths+to+malignancy.">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors.">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li><li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery.">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li><li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export.">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li><li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability.">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts.

En raison de la nature de cette expérience, l&#39;optimisation et l&#39;expérience seront les seuls moyens garantis pour réussir à acquérir les résultats escomptés. Dans de nombreuses étapes de cette procédure, la température et un traitement efficace des réactifs et les produits sont d&#39;une importance capitale. Une bonne planification et l&#39;exécution de la technique aidera à assurer que l&#39;expérience a été réalisée dans un délai approprié aux températures optimales recommandées. Un problème majeur avec les expériences d&#39;isolement d&#39;ARN est la sensibilité des ARN à la dégradation par les RNases. Tous les réactifs doivent être RNase et stocké ou utilisé dans des récipients sans RNase. Il s&#39;agit d&#39;une étape essentielle pour assurer l&#39;intégrité de votre échantillon d&#39;ARNm. Même lorsque l&#39;expérience est réalisée correctement, cependant, le résultat souhaité ne peut être atteint en raison de la nature de l&#39;interaction entre le RBP et ses ARNm cibles. Un problème potentiel est faible, voire avoir aucun signal de l&#39;ARN isolé par RIP-Chip.Bien qu&#39;il y ait peut être un signal à partir d&#39;ARN total, cela peut être le résultat d&#39;une protéine de liaison insuffisante étant tiré vers le bas par les billes. La première étape de dépannage consiste à confirmer que le lysat cellulaire a utilisé l&#39;expression adéquate de la RBP spécifique. Lors de la confirmation, la protéine peut être isolée après le dernier lavage NT2 et remises en suspension dans du tampon de Laemmli ou un autre tampon approprié de dénaturation et on a chauffé à 95 ° C pendant 5 min. Analyse par Western blot peut être utilisé sur ces échantillons en coordination avec lysat d&#39;entrée ainsi que les contrôles négatifs pour assurer suffisamment de tirer vers le bas de la protéine associée. En outre, parce que la lyse de la cellule est nécessaire pour accéder à ces composants, le risque d&#39;interactions anormales ou indésirables entre les protéines normalement séparés et de l&#39;ARNm peut être mis en place. Ces interactions pourraient se lier et &quot;absorber&quot; vos ARNm cibles ou des protéines de liaison à travers des interactions non spécifiques. De plus, les protéines de ces co variantnditions peuvent se replier en de multiples variations et leurs motifs de liaison peut devenir inaccessible à leurs ARNm cibles, empêchant leurs interactions. Ces deux renforcer l&#39;importance de travailler de manière efficace ainsi que l&#39;utilisation des températures optimales énumérées à limiter ces interactions indésirables. De plus, l&#39;optimisation des conditions de lavage pour chaque protéine cible spécifique sera critique pour optimiser la pureté de l&#39;interaction. Les conditions de lavage plus strictes peuvent être nécessaires. Par exemple, le tampon de lavage peuvent être complétés avec du SDS ou d&#39;une quantité appropriée d&#39;urée pour réduire les interactions non spécifiques et de fond dans votre signal. Ce sera totalement dépendante de RBP cible de l&#39;expérimentateur, ainsi que l&#39;ARNm cible dans leurs propres conditions physiologiques. Certaines conditions ne conviennent pas à certains outils d&#39;analyse d&#39;ARNm, qui doivent être notées dans la préparation des échantillons. Enfin, bien que RIP est couronnée de succès dans l&#39;enrichissement de l&#39;ARNRBP-interactions, un problème bien connu avec RIP (CHIP) méthode est l&#39;incapacité à identifier les domaines spécifiques de liaison de la RBP sur les ARNm cibles transitoires. Plusieurs techniques de réticulation peut être utilisé, suivi par RIP pour isoler les cibles de séquence uniques, mais l&#39;utilisation des ondes courtes UV tend à conduire à des dégâts d&#39;acide nucléique. Une nouvelle méthode connue sous le nom de PAR-CLIP, ou la réticulation photoactivable ribonucléoside et immuoprecipitation, emploie longueur d&#39;onde UV pour intégrer thiouridine en ARN naissants permettant l&#39;identification des sites de liaison spécifiques d&#39;interactions ARN à la fois stables et transitoires. Dans l&#39;ensemble, RIP-Chip a été établi comme un excellent outil pour isoler et d&#39;étudier les interactions entre les protéines liant l&#39;ARN et leurs cibles ARNm par notre groupe ainsi que de nombreux autres groupes de recherche. Bien que de nature délicate et la pratique, l&#39;exécution correcte de cette procédure donnera l&#39;isolement de ces complexes RNP, qui, jusqu&#39;à récemment, ont été inaccessible de découverte et d&#39;analyse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 1 M de dithiothréitol </td><td> Pêcheur </td><td> BP172-5 </td><td> TNT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase </td></tr><tr><td> Acide éthylènediamine Tetraccetic </td><td> Pêcheur </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Le glycogène </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1 </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Pêcheur </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M de MgCl 2 </td><td> Pêcheur </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 tampon </td><td> * Voir ci-dessous </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon de lyse polysome </td><td> * Voir ci-dessous </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Comprimés inhibiteurs de la protéase cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protéines Perles A Sepharose </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Pêcheur </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out inhibiteur de RNase </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M de NaCl </td><td> Pêcheur </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium </td><td> Pêcheur </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M de Tris-HCl </td><td> Pêcheur </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Complexes ribonucléoside vanadyle </td><td> Nouvelle-Angleterre Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Préparation en vue de réactif </td></tr><tr><td> Préparer les réactifs dans RNase / DNase, traitée au DEPC verrerie </td></tr><tr><td> Tampon de lyse polysome </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> MgCl2 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 unités / ml de RNase Out </td></tr><tr><td> 400 VRC uM </td></tr><tr><td> Tablette cocktail inhibiteur de la protéase </td></tr><tr><td> 5 ml de tampon de lyse polysome </td></tr><tr><td> Ajouter 50 ul d&#39;HEPES 1 M (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 pi de 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 pl de 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 ul de NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml de RNase DNase H 2 O </td></tr><tr><td> 50 pl de 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 ul de 100 U / ml de RNase Out </td></tr><tr><td> 200 ul de cocktail d&#39;inhibiteurs de protéase (dissous selon le fabricant) </td></tr><tr><td> 10 pl 200 mM VRC (au moment de l&#39;utilisation) </td></tr><tr><td> NT2 tampon </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> NaCl 150 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 1 mM </td></tr><tr><td> 0,05% de NP40 </td></tr><tr><td> 1 L de tampon NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml de Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml de NaCl 5 M </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ul NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml de RNase DNase H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

À la suite de la mise au point de séquençage à haut débit et l&#39;analyse par microréseau efficace, l&#39;analyse d&#39;expression génique globale est devenue une forme simple et facilement disponible de collecte de données. Dans la recherche de nombreux modèles de la maladie cependant, l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm du gène cible ne sont pas toujours directement en corrélation avec les taux de protéines stables de l&#39;État. Régulation post-transcriptionnelle est une explication probable de la divergence entre les deux. Poussé par la liaison de protéines liant l&#39;ARN (RBP), régulation post-transcriptionnelle affecte localisation des ARNm, la stabilité et la traduction en formant une ribonucléoprotéine (RNP) complexe avec des ARNm cibles. L&#39;identification de ces cibles inconnues de novo d&#39;ARNm à partir d&#39;extraits cellulaires dans le complexe RNP est essentielle à la compréhension des mécanismes et des fonctions de la RBP et leur effet résultant sur la production de protéines. Ce protocole décrit une méthode appelée RNP immunoprécipitation de microréseau (RIP-Chip), qui permet l&#39;identification de sARNm SPECIFIQUE associé dans le complexe de ribonucléoprotéine, sous l&#39;évolution des conditions expérimentales, avec des options pour optimiser une expérience pour le chercheur individuel. Avec cet outil expérimental important, les chercheurs peuvent étudier les mécanismes complexes associés à la régulation post-transcriptionnelle, ainsi que les interactions ribonucléoprotéiques autres.

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Une étape par étape pour le protocole isolement et l&#39;identification des complexes ARN associés via RIP-Chip.

Méthode pour l&#39;isolement et l&#39;identification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d&#39;extraits cellulaires utilisant RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K vues.  University of Missouri. Une étape par étape pour le protocole isolement et l'identification des complexes ARN associés via RIP-Chip.

Vidéo: Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purification et visualisation de la grippe A complexes ribonucléoprotéiques virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Recherche

Biologie

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identification et caractérisation des glycosylation des protéines spécifiques en utilisant des endo-et exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procédure pour évaluer l&#39;efficacité de floculants pour l&#39;élimination des particules dispersées dans des extraits de plantes

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Échantillonnage de Sap de phloème de Brassica napus pour 3D-PAGE des protéines et des Complexes ribonucléoprotéiques

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...