Ce travail a été soutenu par des fonds de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, Génome Canada, l&#39;Ontario Genomics Institute, le ministère de l&#39;Innovation, et les Instituts de recherche en santé du don à JG et E. L&#39;AE rouge exprimant coli souche DY330 était un gentil cadeau de Donald L. Cour (National Cancer Institute, Frederick, MD).

1. Construction de gènes spécifiques SPA-tagging dans E. coli souche DY330 <ol><li> Le plasmide pJL148 englobant la séquence d&#39;ADN SPA-tag et la kanamycine marqueur de résistance aux antibiotiques de cassette (Kan R) sont utilisés comme matrice dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) 7. A 45 nt gène spécifique à l&#39;amorce sens, située immédiatement en amont du codon stop du gène cible dans le cadre avec un 27 pb (&#39;5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) amorce sens étiquette spécifique, et un 45 nt spécifique du gène amorce inverse, situé immédiatement en aval du codon stop du gène cible dans l&#39;image avec un point d&#39;ébullition 27 (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) amorce anti-sens spécifique tag, sont utilisés pour amplifier le marqueur et SPA-Kan R cassette du pJL148 utilisant les conditions suivantes: 94 cycles de PCR ° C pendant 5 min; 30 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 1 min, 68 ° C pendant 2 min 10 sec, puis 68 ° C pendant 10 min. Ces séquences amplifiées servir uns substrats pour la ectopique introduit λ-Rouge machines de recombinaison homologue (voir ci-dessous). </li><li> Le produit de PCR est purifié en utilisant un kit QIAquick PCR purification pour éliminer les sels qui peuvent interférer avec l&#39;électroporation. Le produit de PCR purifié est ensuite ciblé pour intégrer à l&#39;extrémité 3 &#39;(juste en amont du codon d&#39;arrêt natif) d&#39;un gène spécifique dans DY330 souche dans laquelle le mécanisme de recombinaison λ-rouge 10 est exprimé. </li><li> Le DY330 λ-Rouge souche exprimant est cultivée pendant une nuit dans 2 ml de Luria-Bertani (LB) à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute. 1 ml de la culture d&#39;une nuit est ensuite inoculée dans 70 ml de milieu LB frais dans 500 ml fiole conique. L&#39;inoculum est cultivé à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute jusqu&#39;à ce que la DO 600 atteigne environ 0,8. </li><li> La culture est transférée dans un nouveau erlenmeyer de 250 ml, où les cellules sont induites par incubation de la fiole dans un bain d&#39;eau à 42 ° C en agitant doucement à180 tours par minute pendant 15 minutes. Immédiatement après l&#39;induction, le ballon est mis en incubation dans un bain de bouillie de glace d&#39;eau pendant au moins 30 min sous agitation. </li><li> La culture glacée est immédiatement transféré en pré-réfrigérés tube de 50 ml en polypropylène et soumis à une centrifugation à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 50 ml d&#39;eau glacée stérile et centrifugé de nouveau à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est alors remis en suspension dans 1 ml d&#39;eau froide et transféré dans un tube de 1,5 ml Effendorf, et centrifugé à une vitesse maximale de 20 secondes à 4 ° C. Après deux ou trois étapes de lavage avec de l&#39;eau glacée, le culot cellulaire est remis en suspension dans 700 ul enfin de l&#39;eau glacée stérile, résultant en des cellules électro-compétentes. </li><li> Grâce à l&#39;électroporation, une pi de l&#39;amplicon purifié est introduit dans 40 pl de cellules électro-compétentes. Les cellules sont électroporation dans un Bio-Rad II GenePulser avec les paramètres suivants: 2,5 kV, 25 uF avec impulsionContrôleur de 200 Ω. Après recombinaison homologue et de l&#39;intégration, les transformants qui ont réussi à recombiner l&#39;étiquette / cassette dans le chromosome sont choisis en fonction de la résistance à Kan (figure 1A). Plusieurs transformants sont sélectionnés pour Western blot pour vérifier la génération correcte (c&#39;est à dire un signal positif) de la SPA taggés protéines de fusion avec anticorps anti-FLAG M2 qui est sélective contre les épitopes drapeau de la SPA-tag. </li><li> Confirmé souche carboxy terminal de fusion SPA-tag est cultivé sur une grande échelle afin d&#39;isoler des complexes de protéines solubles à partir des cellules récoltées en utilisant le protocole de purification SPA. Les grandes lignes des étapes de la procédure de purification par affinité tag est montré dans la figure 1B. </li></ol> 2. La culture et la sonication <ol><li> Inoculer 100 pi d&#39;une étiquette E. SPA- stock de glycérol coli dans 50 ml de bouillon terrible (TB) milieu liquide supplémenté avec 50 ul de 25 pg / ml of Kan solution dans une fiole conique de 250 ml. Cultiver la culture pendant la nuit à 32 ° C. Remarque: Comme la cassette λ inductible par la température dans la souche DY330 rouge est sous le contrôle d&#39;un répresseur sensible à la température 10, la souche de SPA-marqué E. coli est cultivée à 32 ° C. </li><li> Transférer 10 ml de la culture d&#39;une nuit dans 990 ml tuberculose frais additionné de 25 pg / ml de Kan dans un ballon de 4 litres. La culture est développée à 32 ° C avec agitation constante à 250 tours par minute, pendant 5 à 6 heures, jusqu&#39;à ce que la DO 600 atteigne 2 à 3 ~. </li><li> Transférer le 1 litre E. coli SPA-tag culture pour nettoyer les bouteilles de centrifugation et tourner les cellules à 4 ° C dans Beckman J6-HC centrifugeuse @ 3993 xg pendant 15 min. </li><li> Le surnageant est éliminé des bouteilles de centrifugation. Reprendre le E. culots cellulaires coli avec 25 ml de tampon de sonication. Assurez-vous de garder les bouteilles de centrifugation sur la glace en tout temps. </li><li> Le culot remis en suspension esttransféré à tube de 50 ml en polypropylène Falcon et congelés à l&#39;azote liquide. Les cellules congelées sont conservées à -80 ° C pour utilisation à long terme. </li><li> Avant de sonication, décongeler les cellules congelées complètement en gardant les boulettes sur la glace. Les échantillons décongelés sont transférés à une coupelle en acier inoxydable stérile placé sur de la glace pendant la sonication. La sonde est immergée dans l&#39;échantillon et soumis aux ultrasons pendant 3 min. Encore 2 min, on laisse refroidir l&#39;échantillon de surchauffe. </li><li> Le lysat cellulaire est traitée aux ultrasons transmis dans le tube de pré-réfrigéré centrifugation stérile, et on le soumet à une centrifugation à 4 ° C en utilisant une centrifugeuse Beckman JA-17 @ rotor 35.267 xg (16.000 rpm) pendant 15 min à deux reprises. Remarque: Dans le cas de la purification des protéines membranaires, le lysat cellulaire soniqué est centrifugé qu&#39;une seule fois pendant 15 minutes parce que nous ne savons pas dans quelle fraction des protéines membranaires sont, c&#39;est, que ce soit dans le culot ou dans la fraction surnageante. Donc, pour éviter la perte de plus de membresprotéines membranaires, nous tournons les cellules pendant 15 min à grande vitesse de centrifugation et le surnageant est ensuite traité pour la purification (voir les étapes ci-dessous), où 1% de détergent est utilisé pour solubiliser les protéines membranaires. </li><li> Le surnageant du tube de centrifugation est soigneusement transférée dans un tube Falcon de 50 ml en polypropylène et congelés à l&#39;azote liquide. L&#39;extrait de cellules congelées soniqué est stocké pour une période maximale de 6 mois à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 3. Purification par affinité <ol><li> Avant d&#39;utiliser, 100 pi de Anti-Flag M2 perles sont lavées par 10 volumes de tampon AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de détergent, et 0,1-0,5 mM PTCE [tris (2-carboxyéthyl) phosphine - l&#39;acide chlorhydrique]) sans le détergent et l&#39;agent de réduction TCEP (tris (2-carboxyéthyl) phosphine). </li><li> Le congelés, extrait cellulaire soniqué est décongelé en plaçant le tube dans l&#39;eau froide. L&#39;extrait cellulaire décongelée est incubé avec 3 pi de benzonase nucléase pendant 30 min à 4 ° C. A ce mélange, ajouter un détergent non ionique Triton X-100 (concentration finale du détergent devrait être de 0,1%) et 200 pi de suspensions anti-FLAG M2 billes d&#39;agarose. Remarque: Pour toutes les purifications de protéines solubles, 0,1% de Triton X-100 est utilisé pour minimiser l&#39;adsorption non spécifique, alors que pour la purification d&#39;une protéine membranaire, différents doux détergents non ioniques, tels que C12E8 (octaéthylène dodécyl éther de glycol), DDM ( n-dodécyl β-D-maltoside) et le maltose-néopentylglycol (MNG) peut être utilisé à une concentration de 1% de détergent pour améliorer la solubilisation. Depuis différents détergents ont une efficacité variable solubilisation des protéines membranaires, il est recommandé d&#39;effectuer des purifications de protéines indépendantes en utilisant plus d&#39;un détergent. </li><li> Le contenu est mélangé doucement en tournant le tube pendant 3 heures à 4 ° C en utilisant un agitateur LabQuake. Après 3 h de rotation, le tube est centrifugé à 1.700 g pendant 6 minutes. Le surnageant est alors removed soin, autant que possible, sans perturber le cordon lâche granulés. </li><li> Le culot est remis en suspension dans le surnageant restant, puis transféré dans un 0,8 x 4 cm colonne de Bio-Rad polypropylène de préparation. S&#39;assurer de retirer les bouchons de vidange par le bas de la colonne, afin de permettre les éluats à vidanger par gravité. Laver la colonne 5 fois avec étape de clivage TEV. </li><li> Après la vidange des éluats lavés, la sortie de fond de la colonne est fermée. À la même colonne, le clivage est réalisée par l&#39;addition de 5 à 10 ~ pi (50 unités) de protéase TEV et 400 pl de tampon 1X AFC sur la colonne. S&#39;assurer de fermer la partie supérieure de la colonne avec un capuchon. La colonne contenant les billes sont tournés doucement une nuit à 4 ° C pendant la nuit à l&#39;aide d&#39;un agitateur LabQuake. </li><li> Enlever le bouchon sur le dessus et le bouchon de sortie au bas de la colonne, et égoutter les éluats récupérés après clivage TEV dans une colonne contenant 200 suspensions frais ul de billes de sépharose-calmoduline qui est lavé par 10volumes de tampon de liaison calmoduline. </li><li> À la fois le haut et le bas de la colonne sont fixées hermétiquement, et le contenu de la colonne sont mélangées doucement par rotation pendant 3 heures à 4 ° C à l&#39;aide d&#39;un agitateur LabQuake. </li><li> Après 3 h de rotation, l&#39;éluat est évacué en retirant le couvercle supérieur et le bouchon de fond de la colonne. La colonne est lavée quatre fois avec 200 pi de tampon de liaison 1X calmoduline suivie d&#39;un lavage rigoureux avec 400 pl de tampon de lavage calmoduline. </li><li> La protéine liée est éluée en quatre fractions de 50 ul dans un nouveau tube Eppendorf en utilisant 1X tampon d&#39;élution calmoduline. La fraction éluée est distribué dans deux tubes Eppendorf propres dans des volumes égaux. Les deux tubes sont ensuite séchés sous vide à l&#39;aide d&#39;une vitesse. </li><li> L&#39;éluat séché d&#39;un tube est utilisé pour l&#39;exécution d&#39;un gel coloration à l&#39;argent, tandis que l&#39;autre est stocké dans -80 ° C, avant d&#39;utiliser la spectrométrie de masse. </li></ol> 4. Coloration à l&#39;argent <ol><li> Pour l&#39;argent staining, la moitié du volume de SDS 3X (dodécyl sulfate de sodium) tampon d&#39;échantillon est ajouté à 50 ul de l&#39;éluat séché. Après avoir fait bouillir le mélange pendant 5 min, les échantillons sont chargés sur un gel de polyacrylamide SDS. </li><li> Après le gel a fini de s&#39;exécuter, il est soigneusement placé dans une solution de fixation (méthanol à 50% et 10% d&#39;acide acétique) et agité doucement sur un agitateur rotatif pendant 20 min. Le gel est ensuite rincé à l&#39;éthanol à 20% pendant 10 min. </li><li> Le gel fixe est lavée deux fois à fond avec 500 ml d&#39;eau bidistillée pendant 10 minutes pour assurer fond uniforme faible. </li><li> Le gel est ensuite agité doucement dans 500 ml de thiosulfate de sodium pendant 1 min, suivie de deux étapes de lavage avec de l&#39;eau distillée pendant 20 sec. </li><li> L&#39;eau est éliminée, et le gel est incubé dans 200 ml de nitrate d&#39;argent 0,1% pendant 30 min. Après ce temps, le nitrate d&#39;argent est éliminé et le gel est lavé avec de l&#39;eau distillée pendant 20 secondes pour éliminer l&#39;excès de nitrate d&#39;argent. </li><li> Le gel est finalement la main agitée dans 75 mlde la solution de développement. Lorsque l&#39;intensité désirée est atteinte, la solution de développement est éliminé et 80 ml d&#39;acide acétique est ajouté pour arrêter la réaction. Assurer à incuber le gel dans l&#39;acide acétique pendant une période minimale de 20 minutes pour une visualisation correcte des bandes de gel. </li></ol> 5. Protéolyse et préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse <ol><li> Pour l&#39;échantillon séché, ajouter 50 ul du tampon de digestion et 0,9 ul de 100 mM PTCE-HCl (tris (2-carboxyéthyl) phosphine - acide chlorhydrique) et incuber le mélange pendant 45 min à température ambiante pour l&#39;étape de réduction. Ensuite, 1 pl de 500 mM d&#39;iodoacétamide est ajouté et incubé dans l&#39;obscurité pendant 40 min un autre pour permettre d&#39;alkylation échantillon. </li><li> Après le second tour de l&#39;incubation, ajouter 1 ug de trypsine immobilisée sur le mélange et incuber soit à 37 ° C pendant 5 heures ou toute la nuit à température ambiante. Assurez-vous d&#39;arrêter la réaction en ajoutant 1 ul d&#39;acide acétique. </li><li> Pré-humide, la Millipore Zip-Tip pointe de la pipette en aspirant 10 ul de la solution de mouillage et d&#39;équilibrage. Distribuer la solution à perdre. Par la suite aspirer 10 ul de la solution de lavage et distribuer la solution à perdre. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Pour une fixation efficace du mélange peptidique à l&#39;extrémité, d&#39;une pipette mélanger le mélange de peptides de 20 fois. Le mélange de peptides qui ont adhéré à la pointe est lavé par aspiration et la distribution de la solution de lavage. Répétez cette procédure deux fois pour une fixation efficace du mélange de peptides à la pointe. </li><li> Avec le bout contenant le peptide lié, aspirer 10 ul de la solution de mouillage et d&#39;équilibration, et distribuer dans un tube eppendorf propre. Répétez cette étape deux fois. Après séchage, les échantillons élués dans le vide de vitesse, les échantillons peuvent être analysés par spectrométrie de masse immédiatement ou conservés à -80 ° C avant utilisation. </li></ol> 6. Identification des protéines par LTQ Velos Orbitrap spectromètre de masse Thcomposants électroniques polypeptidiques des complexes isolés sont identifiés à l&#39;aide d&#39;un Orbitrap LTQ Velos hybrides spectromètre de masse en tandem. L&#39;exception des Orbitrap pouvoir de résolution (&gt; 60.000 maximum intégral moitié de la largeur, ou FWHM) et la précision de masse (&lt;2 ppm) qui minimise MS / MS échantillonnage de contaminants non pertinentes fond non spécifiques détectés dans purifications de commande, tandis que la vitesse élevée à piège à ions Velos composant peut détecter et peptides de fragments de faible abondance en utilisant à la fois le transfert d&#39;électrons et de dissociation induite par collision modes de dissociation. Matchs de confiance élevé entre résultant spectres MS / MS sont mappés à la référence E. séquences de protéines coli en utilisant l&#39;algorithme de recherche de base de données comme SEQUEST et chaque séquence correspondant évaluée au cours d&#39;un algorithme de probabilité comme STATQUEST 11. Le nombre total de spectres, l&#39;unicité séquence peptidique et les contaminants de fond communs détectés dans le contrôle négatif (c.-à-maquette.) Purifications sont envisagées pour atteindre un bas empirique faux-distaux de découverte. Les étapes suivantes sont effectuées pour l&#39;identification des protéines: <ol><li> Les micro-colonnes sont emballées avec ~ 10 cm de 3 pm Luna-C 18 et de résine sont en interface avec une source d&#39;ions Proxeon nanoélectronébulisation qui est placé en ligne avec l&#39;instrument Orbitrap. </li><li> Un Proxeon flux binaire nano HPLC pompe est utilisée pour délivrer un taux stable de flux pointe d&#39;environ 300 -1 nl min pendant les séparations de peptides. </li><li> Pour parvenir à élution peptide, un gradient de tampon organique est mis en place selon la complexité de l&#39;échantillon. Par exemple, le gradient suivant est généralement mis en place pour E. échantillons SPA coli: le solvant B est passée de 2% à 6% en 1 min, à 24% en 38 min, à 100% dans la prochaine 4 min, détenue à 100% pendant 1 min, puis a diminué à 2% en 1 min, et dernière maintenir à 2% pendant 15 min. Le solvant de phase mobile A a 95% HPLC gradient d&#39;eau et 5% ACN avec de l&#39;acide formique 0,1%, tandis que le solvant B a 5% HPLC gradient d&#39;eau et 95% d&#39;ACN avec 0,1% d&#39;acide formique acid. Le débit à la pointe de l&#39;aiguille est fixée à 300 nl min -1 pendant 60 min. </li><li> Comme les cycles de spectrométrie de masse de fonctionner grâce à un balayage complet de masse à 60.000 résolutions, 10 concomitants scans en tandem fragmentation de masse sont recueillies pour les ions précurseurs les plus intenses. L&#39;exclusion dynamique, la sélection massale monoisotopique, et en temps réel des données dépendantes de caractéristiques de l&#39;instrument d&#39;acquisition sont activés. </li><li> Les spectres sont recherchés en utilisant un algorithme de recherche de base de données tels que SEQUEST contre une base de E. séquences de protéines coli, et le résultat est statistiquement filtré en utilisant un algorithme probabiliste comme STAQUEST 11 pour assurer un taux faible de faux découverte. Seuls les candidats de confiance élevé (99% de probabilité) sont sélectionnés, tandis que les matchs montrant plus de 10 ppm en masse d&#39;erreur par rapport à la masse des peptides théoriques sont éliminés sans autre considération. </li></ol>

<ol>
	<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli.">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li><li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins.">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).</li><li>Krogan, N. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un aspect essentiel de l&#39;approche basée sur APMS SPA décrit ici est que le marquage est effectué dans le cadre naturel chromosomique, assurant ainsi la régulation des gènes normale est maintenue (. Promoteur natif appât préservé, où les niveaux d&#39;expression n&#39;est pas perturbé) et natif stable associée à complexes protéiques sont récupérés à court endogènes niveaux. Questions polarité opéron sont également évités par un promoteur comprenant orientée vers l&#39;extérieur dans ...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Vendor</td>
			<td>and Catalog Numbers</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>I. Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#KAN201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMP201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Terrific-Broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Tryptone</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRP 402</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#YEX 555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#GLY 002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#PPM 303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. Bacterial Strain and Plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DY330</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Yu et al. (2000)10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJL148</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Zeghouf et al. (2004)7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. PCR and Electrophoresis Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PCR buffer</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mM MgCl2</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td># EP0281</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AGA002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#B7021S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># ETB444</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#28355</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TRS001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#BOR001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># E6768</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>#N3232L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. Plasmid isolation and Clean-up Kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Midi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#28104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. PCR and Transformation Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>iCycler</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>GenePulser II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 cm electroporation cuvette</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>42 &deg;C water bath shaker</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Innova 3100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter TJ-25 centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TS-5.1-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C large Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 &deg;C plate incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>7. Electrophoresis and Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td># AMP001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># B7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#TEM001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman No. 1 filter paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#09-806A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean 3 cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#165-3301</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot gel transfer device</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#IB1001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#162-0115</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Flag M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F3165</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>#NA931V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained protein molecular weight standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#161-0363</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence reagent</td>
			<td>PIERCE</td>
			<td>#1856136</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoradiography film</td>
			<td>Clonex Corp</td>
			<td>#CLEC810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Draw blotting paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P7796</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2 platform rocking shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>8. Sonication Equipment and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonic</td>
			<td>#23395</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOD001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#800-363-5887</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mM TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#20490</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>9. Affinity Purification Reagents and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#732-6008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>#70746</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FLAG M2 agarose beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A2220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin-sepharose beads</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#17-0529-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV protease</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#12575-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2661</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabQuake Shaker</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>#59558</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>10. Silver Staining Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#MET302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>t#ACE222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-thiosulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#S-7143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>#S181-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#FOR201</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#SOC512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>11. Reagents and Equipment for Protein Identification </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td># V5280</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM NH4HCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#AMC555</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>#CCL302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A998-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F0507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#95304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#16125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Zip-Tip</td>
			<td>Millipore</td>
			<td># ZTC18M960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~10 cm of 3 &mu;m Luna-C18 resin</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proxeon nano HPLC pump</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>12. Labware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 liter conical flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#89000-372</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml polypropylene falcon tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml conical flaks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#29140-045</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile culture tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#366052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#479-3221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &deg;C freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#13-990-14</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed vacuum system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Buffers and Solutions
			1. 1 liter Terrific Broth (TB) media
			11 g Bio-Tryptone 
			22 g Yeast Extract 
			2% Glycerol 
			50 ml potassium salt stock solution
			2. Potassium Salt Stock Solution
			1.5 M K2HPO4 
			0.35 M KH2PO4
			3. Sonication Buffer
			20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			10% Glycerol 
			Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP
			4. AFC buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			5. TEV cleavage buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			0.2 mM EDTA 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			6. Calmodulin binding buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1% detergent 
			Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP
			7. Calmodulin wash buffer
			30 mM Tris-HCl pH 7.9 
			150 mM NaCl 
			2 mM CaCl2 
			0.1-0.5 mM TCEP
			8. Calmodulin elution buffer
			30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 
			100 mM NaCl 
			10 mM EGTA 
			0.1-0.5 mM TCEP
			9. Developing solution (1L)
			37% Formaldehyde 
			30 g sodium carbonate 
			1000 ml distilled water
			10. Digestion buffer
			50 mM NH4HCO3 
			1 mM CaCl2
			11. Wetting and Equilibration solution
			70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid
			12. Washing solution
			100% H2O in 0.1% formic acid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein complexes in escherichia coli using sequential peptide affinity purification in combination with tandem mass spectrometry

Comme la plupart des processus cellulaires sont médiés par des assemblages macromoléculaires, l&#39;identification systématique des interactions protéine-protéine (PPI) et l&#39;identification de la composition de sous-unité du complexe multi-protéique peut donner un aperçu de la fonction des gènes et améliorer la compréhension des systèmes biologiques 1, 2. Interactions physiques peuvent être mis en correspondance avec confiance vialarge échelle haute isolation et la caractérisation des complexes de protéines endogènes dans des conditions proches des conditions physiologiques basés sur la purification par affinité des protéines chromosomiques marqués en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS). Cette approche a été appliquée avec succès dans les organismes évolutivement divers, y compris les levures, les mouches, les vers, les cellules de mammifères, et les bactéries 1-6. En particulier, nous avons généré une affinité carboxy-terminale de peptides séquentielle (SPA) pour système de marquage double affinité de purification des complexes protéiques natifs de culture d&#39;Escherichia coli à Gram négatif, en utilisant genetically-traitables souches de laboratoire d&#39;accueil qui sont bien adaptés à l&#39;échelle du génome des enquêtes sur la biologie fondamentale et les processus conservées des procaryotes 1, 2, 7. Notre SPA-tagging système est analogue à la méthode de purification d&#39;affinité en tandem développé à l&#39;origine pour la levure 8, 9, et se compose d&#39;un peptide liant la calmoduline (CBP), suivi par le site de clivage pour la protéase du virus hautement spécifique du tabac etch (TEV) et trois copies du FLAG (FLAG 3X) épitope, ce qui permet deux cycles consécutifs d&#39;enrichissement par affinité. Après amplification de cassette, spécifiques d&#39;une séquence linéaire des produits de PCR codant pour la SPA-tag et un marqueur de sélection sont intégrés et sont exprimées en tant que cadre carboxy-terminaux dans un fond fusions DY330 qui est induite à exprimer de façon transitoire un système hétérologue est performant bactériophage lambda recombinaison 10. Après deux étapes de purification utilisant la calmoduline et billes d&#39;affinité anti-FLAG permet sélective hautementet une récupération efficace de même de faibles complexes protéiques d&#39;abondance des cultures à grande échelle. Spectrométrie de masse tandem est ensuite utilisé pour identifier de façon stable les co-purification de protéines avec une sensibilité élevée (faibles limites de détection nanogramme). Ici, nous décrivons détaillées étape par étape, les procédures communément utilisés pour le marquage des protéines systématique, la purification et la spectrométrie de masse basée sur l&#39;analyse des complexes protéiques solubles de E. coli, qui peuvent être étendus et potentiellement adaptée à d&#39;autres espèces bactériennes, y compris certains agents pathogènes opportunistes qui se prêtent à recombineering. Les interactions physiques qui en découlent peuvent souvent révéler intéressantes composants et des connexions inattendues suggérant de nouveaux liens mécanistes. Intégration des données PPI avec remplacement des données d&#39;association moléculaire, tels que génétiques (gène-gène) les interactions et la génomique contexte (GC) des prédictions peuvent faciliter l&#39;élucidation de l&#39;organisation mondiale moléculaire de complexes multi-protéiques dans les deuxvoies méthodologiques. Les réseaux générés pour E. coli peuvent être utilisées pour mieux comprendre l&#39;architecture fonctionnelle des produits des gènes orthologues dans d&#39;autres microbes dont annotations fonctionnelles font actuellement défaut.

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry at JoVE.co

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d&#39;interactions protéiques et d&#39;enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d&#39;affinité (SPA) procédure APMS développé pour la bactérie<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Qui peut être utilisé pour isoler et caractériser stables complexes multi-protéiques jusqu&#39;à homogénéité à partir de près de même faible nombre de copies par cellule.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

identification-protein-complexes-escherichia-coli-using-sequential

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

48.2K vues.  University of Toronto. La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d'interactions protéiques et d'enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d'affinité (SPA) procédure APMS développé pour la bactérie Escherichia coli Qui peut être utilisé pour is...

Vidéo: Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Recherche

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

L&#39;analyse des complexes protéiques par spectrométrie de masse Grande structurels

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Les avantages multiples de la protéine co-expression dans<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...