VN est pris en charge par la Royal Society. JPR est un futur membre (FT0992129) Conseil australien de la recherche. Nous remercions le Dr Miriam Gifford pour la lecture critique du manuscrit.

Remarque: toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Une. Préparation des matières végétales et tampons <ol><li> Pour N. benthamiana <ol><li> La croissance de l&#39;Agrobacterium tumefaciens souches d&#39;intérêt pour l&#39;expression transitoire (dans cet exemple Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG et vecteur vide comme contrôle) par agitation (200 rpm) en culture liquide (L moyen des antibiotiques appropriés) à 28 ° C jusqu&#39;à ce que la phase stationnaire. </li><li> Recueillir et culot agrobactéries par centrifugation (3000 g pendant 5 min). Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans un tampon agrobactéries granulés d&#39;infiltration. </li><li> Mesurer la quantité d&#39;agrobactéries par l&#39;obtention de la densité optique (DO) de la valeur à une absorbance de 600 nm (Abs 600 nm). Régler la DO de bactéries à 0,1-0,8. </li><li> Infiltrez âgé de 4 semaines N. plantes benthamiana (22 ° C, 16 h de lumière) avec agrobactéries par hand (avec une seringue sans aiguille 1 ml) ou par le vide (ajouter 0,02% v / v de tensio-actif). Remarque: Utilisez la première feuille quasi intégralement étendu, et les deux feuilles immédiatement âgés d&#39;expression plus efficace des protéines. Pour la détection des protéines ubiquitinées ou acétylés infiltrer feuilles avec 100 nM MG-132 ou 100 ng / ml de trichostatine A, respectivement, à 1 et 2 jours après infiltration. </li><li> Récolter les feuilles infiltrées 2-5 jours post-infiltration et gel dans de l&#39;azote liquide. Conserver les échantillons dans un congélateur à -80 ° C. Remarque: déterminer le meilleur niveau d&#39;expression de la protéine d&#39;intérêt à l&#39;avance par prélèvement d&#39;échantillons au cours d&#39;une évolution dans le temps de 5 jours et de détecter les niveaux de protéine par immunotransfert. </li></ol></li><li> Pour A. thaliana lignées transgéniques stables <ol><li> Cultivez A. thaliana graines dans des plaques 6 puits complétés avec 5 ml de milieu liquide MS (1% w / v) de saccharose par puits. Mettez trois à cinq graines (stérilisés et stratifiés) de la lignée transgéniqued&#39;intérêt ou de la ligne de commande non transformé par puits. Agiter à 200 rpm pendant deux jours avant de transférer la plaque dans une chambre de croissance et laisser reposer pendant 2 semaines (22 ° C, 10 h de lumière). </li><li> échantillons de récolte et de congélation dans l&#39;azote liquide. Remarque: Vous pouvez utiliser comme un contrôle une lignée transgénique exprimant une protéine sans rapport avec la même étiquette que la protéine d&#39;intérêt. </li></ol></li><li> Tampons <ol><li> Préparer le tampon A. De-gaz tampon pendant 1-2 heures (pour RLKS, d&#39;autres protéines liées à la membrane et des protéines nucléaires, ajouter 1% v / v IGEPAL CA-630 53). Remarque: Vous pouvez conserver le tampon A à 4 ° C indéfiniment. Vous pouvez utiliser 1% v / v de Triton au lieu de IGEPAL CA-360. </li><li> Préparer 80 ml de tampon B froid au moins 1-2 heures avant l&#39;extraction. Note: Le rapport idéal de tissu par rapport à un tampon d&#39;extraction est de 1:4 (p / v). </li></ol></li></ol> 2. Extraction des protéines <ol><li> Juste avant l&#39;extraction préparer 80 ml de tampon froid C. <li> Broyer 20 g de N. tissu benthamiana (environ 15 feuilles) ou A. thaliana semis (2-4 g par plaque de 6 puits) dans l&#39;azote liquide à l&#39;aide d&#39;un mortier et un pilon. </li><li> Ajouter 80 ml de tampon froid C à 20 g de tissu du sol, bien mélanger et fondre sur la glace. Remarque: Broyer tous les échantillons en même temps (protéine d&#39;intérêt et de contrôle). </li><li> Homogénéiser avec 3 salves de 10 secondes à chaque à pleine vitesse avec un homogénéisateur de tissu (préalablement refroidie à 4 ° C). Filtrer à travers un tissu de 22 à 25 um et centrifuger à 30 000 g pendant 30 min à 4 ° C. Remarque: vous pouvez homogénéiser avec un mortier et un pilon préalablement refroidi frais. </li><li> Pour les étapes blocage et de lavage de la matrice d&#39;affinité, de préparer 20 ml de tampon D. </li><li> Bloc 100 ml de matrice d&#39;affinité appropriée à l&#39;aide de 500 ml de tampon froid contenant du D BSA à 1% pendant 5 min à 4 ° C. Remarque: af privilégiéesmatrices de Finity comprennent anti-FLAG M2 agarose, la streptavidine agarose, GFP-Trap_A et anti-HA agarose. </li><li> Laver 3 fois avec 1 ml de tampon froid D. </li><li> Retirer le surnageant de l&#39;extrait de feuille et le filtre à travers un filtre à seringue de 0,45 um dans un nouveau tube sur glace. Note: La couleur de l&#39;extrait doit être vert ou jaune, si l&#39;échantillon a viré au brun, le jeter et recommencer. </li><li> Prendre une aliquote de l&#39;extrait brut pour immunoblot, ajouter 5x tampon SDS-PAGE chargement, vortex et dénaturer par des échantillons bouillante pendant 10 min à 80-100 ° C dans un bloc chauffant. </li></ol> 3. Protéine immunoprécipitation <ol><li> Fractionner l&#39;extrait de protéine dans deux tubes de 50 ml et ajouter 50 ul de la matrice d&#39;affinité en suspension dans du tampon D à chaque tube. Incuber avec une légère rotation pendant 2 h à 4 ° C. Remarque: incubations plus longues n&#39;ont pas été trouvés à augmenter le rendement. </li><li> Préparer 600 ul (6x de volume de la bille de matrice d&#39;affinité) de tampon d&#39;élution par l&#39;addition deTampon D (concentrations finales): 0,5% de BSA, 0,25 mg / ml de peptide FLAG (pour les anti-FLAG M2 agarose) ou 10 mM de D-biotine (pour la streptavidine agarose). Remarque: élution n&#39;est pas recommandé dans le cas de la GFP-Trap_A et anti-HA matrices, afin de passer directement à ébullition en 1x tampon SDS-PAGE chargement, l&#39;étape 3.11. </li><li> Précipiter la matrice d&#39;affinité par centrifugation à 4 ° C (5 min à 1000 xg). </li><li> Prendre une aliquote de l&#39;extrait non consolidé pour immunoblot, jeter le reste du surnageant, laissant environ 500 pi dans le fond du tube. </li><li> Reprendre la solution de suspension avec une pointe de gros calibre. </li><li> Transférer la solution de suspension mixte des deux tubes à un seul tube de 1,5 ml. Remarque: A partir de maintenant, utiliser 1,5 ml faible teneur en protéines microtubes de liaison. </li><li> Pulse 3x pendant 5 s à l&#39;aide d&#39;une centrifugeuse de paillasse pour précipiter la matrice d&#39;affinité et d&#39;éliminer le surnageant. </li><li> Lavez 3-5x avec 1 ml de tampon froid D. Entre les lavages précipiter le matri d&#39;affinitéx de la manière décrite précédemment et jeter le surnageant. Dans le dernier lavage, éliminer l&#39;excès de tampon D avec l&#39;aiguille d&#39;une seringue. Note: Un lavage final à l&#39;aide de tampon D avec 0,1% de IGEPAL peut être utilisé pour réduire encore la liaison non spécifique. </li><li> Éluer avec 200 pi de tampon d&#39;élution approprié (par anti-FLAG M2 ou streptavidine étape d&#39;agarose 3,2 see 3x), 5 min à chaque fois avec une agitation constante. </li><li> Réunir les trois éluats dans un seul tube. Concentrer les protéines en utilisant 30 ul de résine d&#39;absorption. Vortex, laisser reposer pendant 5 min et précipiter la résine (2 min à 10000 xg). Jeter le surnageant. Remarque: Pour GFP-Trap_A et anti-HA agarose, sauter les étapes 3.9 et 3.10. </li><li> Ajouter 50 ul de 1 x tampon de chargement SDS-PAGE à la matrice d&#39;affinité ou une résine précipitée d&#39;absorption. Vortex et faire bouillir pendant 10 min à 80-100 ° C dans un bloc chauffant. </li><li> Centrifuger la matrice d&#39;affinité ou une résine bouilli pendant 2 min à 10 000 x g. Aliquote 5 pl de la supernatant pour immunoblot, et de fonctionner avec d&#39;autres fractions sur une ~ 10 cm de long gel SDS-PAGE (figure 2). </li><li> Pour la séparation et l&#39;identification des protéines phosphorylées par spectrométrie de masse, de charger les 45 ul restants sur un gel SDS-PAGE de 19 ~ cm de long, si la séparation supplémentaire est nécessaire (figure 2). Remarque: Une voie vierge peut être comprise entre tous les échantillons pour réduire la contamination des échantillons. </li></ol> 4. La digestion des protéines <ol><li> Colorer le gel SDS-PAGE avec du bleu de Coomassie colloïdal (CCBB) tache. Remarque: Réduire la manipulation du gel afin de réduire la contamination par les kératines. Assurez-vous qu&#39;aucun des appareils ou des outils ont été utilisés pour immunoblot ou d&#39;autres activités qui auraient quitté la contamination de protéines résiduelles. </li><li> Destain le gel avec lave copieux dans l&#39;eau, de préférence O / N. Couper la bande d&#39;intérêt à partir du gel avec une lame de rasoir propre. Remarque: Alignez le gel avec le immunoblot si necessary pour localiser la zone correcte. Comme la phosphorylation peut retarder la migration des protéines sur SDS-PAGE découper la zone située immédiatement au-dessus et au-dessous de la bande d&#39;intérêt. </li><li> Couper la tranche de gel en cubes de 2-4 mm (ce qui garantit que le gel sera couvert par des solutions dans le tube sans blocage des embouts de pipette). Placer dans un tube. </li><li> Estimer le volume nécessaire pour maintenir le gel bien immergée. Utilisez ce montant pour la dérivation, l&#39;incubation avec la protéase et l&#39;extraction de peptide, puis utiliser le double des volumes triples pour le lavage. Remarque: Dans un typique digérer avec environ 100 pi des morceaux de gel de taille, d&#39;utiliser une solution de 500 pl pour le lavage, 2 x 180 ul de la déshydratation, la réduction de 150 ul, 120 ul d&#39;alkylation, et 120 ul de la digestion. </li><li> Laver les morceaux de gel 2 x 20 minutes (ou jusqu&#39;à ce que décoloré) en ajoutant 50% d&#39;acétonitrile (dans du bicarbonate d&#39;ammonium 50 mM, ABC). Introduire à la pipette, enlever la solution en prenant soin de ne pas enlever des morceaux de gel. </li><li> Déshydrater à 100% acétonitrile pendant 5 min et éliminer le liquide libre. Remarque: Le gel doit apparaître rétréci et blanc. Si la couleur bleue persiste, plus incuber dans de l&#39;acétonitrile / ABC et / ou à température élevée (45-55 ° C). </li><li> Réduire les liaisons disulfure de la protéine en ajoutant 10 mM de DTT dans l&#39;eau et incuber pendant 30 à 45 min à 56 ° C avec agitation par secousses. Retirer le liquide libre. </li><li> Alkyler des résidus de cystéine par addition de 55 mM chloroacétamide (en mM ABC 50) pendant 20-30 min (température de la pièce, foncé). Retirer le liquide libre. </li><li> Laver les morceaux de gel 2 x 10 min avec 50% d&#39;acétonitrile (en mM ABC 50). Retirer le liquide libre. </li><li> Déshydrater morceaux de gel avec 100% d&#39;acétonitrile pendant 5 min et éliminer le liquide libre. </li><li> Pour la digestion trypsique, ajouter 40 ul de solution de travail de la trypsine (100 ng de trypsine dans un tampon de digestion: mM ABC 50, 5% acétonitrile pour une bande moyenne Coomassie teinté). Permettre aux morceaux de gel se réhydrater pendant 10 min. Ajouter suffisamment de tampon de digestion pour couvrir des morceaux de gel si nécessaire. Incuber à 37 º CO / N. </li><li> Pour arrêter la digestion et l&#39;extraction des peptides à partir des morceaux de gel, ajouter de l&#39;acide formique à 5% (50% dans l&#39;acétonitrile) (ajouter le même volume que le volume de la digestion). Soniquer pendant 5-10 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Répéter l&#39;extraction 3x. </li><li> Sécher les peptides par lyophilisation (de préférence) ou un concentrateur sous vide (comme Speed-Vac ou Savant). Conserver à -20 ° C. </li><li> Soumettez votre échantillon pour la spectrométrie de masse. Note: Nous avons présenté notre échantillon à l&#39;installation de spectrométrie de masse au laboratoire Sainsbury (Norwich, Royaume-Uni). Protocoles dans les installations de spectrométrie de masse varient considérablement, mais typiquement peptides sont dissous dans de l&#39;acide trifluoroacétique à 0,2% avec 2% d&#39;acétonitrile avant chargement sur un système de chromatographie liquide couplée à l&#39;électro-pulvérisation couplée à la spectrométrie de masse. </li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts (financiers ou autres).

Élucider le mécanisme d&#39;activation du récepteur par les PAMP et les effecteurs peut grandement contribuer à notre compréhension de l&#39;immunité de la plante. Au cours des 20 dernières années, les écrans de deux hybrides génétiques et la levure ont contribué à la découverte de PRR et protéines NB-LRR. Plus récemment, des protocoles basés sur la spectrométrie de masse ont été établies pour l&#39;identification de protéines réglementée différemment au cours de signalisation 55-58 immunitaire, leurs MEA 11,33,59,60, la composition de complexes immuns 61 et effecteur cible 62. Ici, nous décrivons un protocole simple pour l&#39;identification des PTM régulation de l&#39;activation des complexes immuns. En comparaison avec les protocoles décrits précédemment, ce protocole permet l&#39;identification détaillée des changements dynamiques de PTM. Protocoles des approches de protéomique à grande échelle peuvent identifier MEA de protéines, mais ne sont pas en mesure de révéler le site plasticité de PTM en raison de limitered quantités de protéines. Dans le cas de la phosphorylation des protéines, à grande échelle approches protéomiques en général seulement d&#39;identifier les sites de phosphorylation prédominantes 11,33,59. La caractérisation détaillée d&#39;un statut de phosphorylation de protéine nécessite une quantité importante de protéine qui peut être obtenue seulement par purification partielle de la protéine cible 47. Le protocole décrit ici des couples d&#39;une approche de purification de protéine qui produit une quantité substantielle de la protéine cible, avec analyse par spectrométrie de masse de la protéine purifiée. Après ce protocole, l&#39;événement de phosphorylation unique de prise de force a été attribuée principalement à la Ser-198 comme décrit précédemment 52 mais certains spectres de spectrométrie de masse a également soutenu un événement unique phosphorylation sur Thr-195 ou Thr-199. Lorsque doubles événements de phosphorylation de Pto ont été observés, la combinaison prédominante des acides aminés phosphorylés a Ser-198 et Thr-199 bien que des combinaisons sur d&#39;autres sites ont également été observées (Le tableau 1). Ces résultats démontrent clairement le site de phosphorylation de la plasticité des protéines kinases et la capacité du protocole décrit en détails pour caractériser tous les sites de phosphorylation possibles. Les étapes les plus importantes de ce protocole sont: 1) l&#39;extraction suffisante de protéines; 2) la protection des PTM, et 3) une quantité suffisante de protéine cible. Tout d&#39;abord, pour l&#39;extraction suffisante des protéines, il est important de broyer le tissu dans de l&#39;azote liquide et par la suite d&#39;utiliser un homogénéiseur de tissus tel que décrit dans le protocole. Si un homogénéisateur de tissu n&#39;est pas disponible, un mortier et un pilon peuvent être utilisés. Il est également important d&#39;utiliser un rapport de un à trois (ou quatre) de grammes de tissu au volume de tampon d&#39;extraction. Ce tissu de tamponner rapport et le tampon à haute résistance que nous proposons permettra d&#39;assurer que le pH restera neutre durant le processus d&#39;extraction. Nous avons trouvé que cela est d&#39;une importance particulière pour A. thaliana et tomate supplémentairections 52. Protection de MEA peut être obtenue en incluant dans tous les tampons des inhibiteurs d&#39;enzymes appropriées qui peuvent éliminer MEA. Il est également essentiel d&#39;effectuer toutes les étapes à 4 ° C et à prérefroidissement tampons et des instruments. Des rendements plus élevés de la protéine cible peuvent être obtenus en utilisant des plantes exprimant la protéine dans des quantités suffisantes et en utilisant des quantités élevées de tissu (environ 20 g). L&#39;étape la plus importante pour l&#39;obtention de quantités suffisantes de protéine cible concentre la protéine cible par immunoprécipitation directe. L&#39;importance de cette étape est mise en évidence par notre incapacité à identifier les PTM de Pto après une immunoprécipitation Prf en raison de la quantité limitée de coimmunoprecipitated Pto (figure 2B). En revanche, une immunoprécipitation directe de peptides a abouti à Pto sensiblement plus mesurables (Figure 2C) menant à une couverture d&#39;environ 80% de la séquence de la protéine et l&#39;identification des MEA (tableau 1). Nous avons également strecommander rongly l&#39;utilisation des épitopes-tags pour les protéines immuno-précipitation. En comparaison avec des anticorps dirigés contre les protéines matrice épitope-tags affinité native peut produire de plus grandes quantités de protéine partiellement purifiée. En utilisant un anticorps dirigé contre la protéine native de prise de force 51 (figure 2A) pour immunoprécipitation, nous avons pu identifier que la phosphorylation seul des deux sites de phosphorylation prédominantes de Pto. Ce protocole a été principalement développé pour la purification partielle de N. benthamiana protéine cytoplasmique et l&#39;identification ultérieure de leurs sites de phosphorylation. Cependant, en utilisant les modifications décrites ici, ce protocole peut être facilement adapté pour A. protéines thaliana et des protéines membranaires. L&#39;objectif principal de ce protocole est de produire des quantités suffisantes de la protéine cible pour l&#39;identification des PTM et de ne pas atteindre la plus grande pureté du complexe. Si une plus grande puretédu complexe est requise une deuxième étape de purification peut être ajouté à ce protocole 52. Dans ce cas, une première étape va permettre l&#39;élution de la protéine cible à partir de la matrice d&#39;affinité sans l&#39;utilisation de sels élevées ou à l&#39;acide et l&#39;étape ultérieure peut comporter une matrice, ce qui nécessite des conditions d&#39;élution dures. Il est important de souligner que nous avons seulement testé ce protocole pour l&#39;identification des sites de phosphorylation et que nous testons actuellement sa capacité d&#39;identification détaillée des PTM supplémentaires. Nos résultats démontrent clairement représentatives du site de phosphorylation de la plasticité des protéines kinases et la capacité du protocole décrit pour caractériser les sites de phosphorylation. Surtout, ils soulignent que l&#39;identification des sites de phosphorylation s&#39;appuyant en basse quantité de protéines par spectrométrie de masse et par des mutations ponctuelles de sites auto-phosphorylation peut donner des résultats étonnants. Nous montrons ici et auparavant 47 </sup&gt; Que la double phosphorylation de Ser-Pto sur 198 et Thr-199 est associée à l&#39;activation du complexe Prf / Pto. En revanche, les résultats publiés antérieurement 47,63 ont montré que des mutations ponctuelles de Ser et Thr-198-199 par l&#39;alanine, ce qui empêche la phosphorylation de ces sites, sont en mesure de signaler ce qui suggère que la phosphorylation de ces sites n&#39;est pas une condition préalable à l&#39;activation complexe . Ces résultats peuvent maintenant être expliquées par la phosphorylation du site secondaire Thr-195. Idée similaire dans le site de phosphorylation de la plasticité d&#39;une autre protéine kinase peut être obtenu suivant ce protocole. En outre, une approche combinée en utilisant les sites de phosphorylation mutations ponctuelles, des protéines qui peuvent inhiber les kinases spécifiques (effecteurs) couplés avec immunoprécipitation de protéines et analyse par spectrométrie de masse conduira à une meilleure compréhension de l&#39;importance de l&#39;évolution du site de phosphorylation plasticité des protéines kinases.

Voies immunitaires s&#39;appuient sur ​​diverses modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines pour la transduction de signaux et rapidement activer des réponses immunitaires 1. Les MEA sont rapides, réversibles, et hautement spécifiques des altérations chimiques de la structure des protéines qui peuvent affecter la conformation des protéines, l&#39;activité, la stabilité, la localisation, et des interactions protéine-protéine 4.2. Chez les plantes, plus de 300 types de PTM ont été identifiées, notamment ubiquitination, sumoylation, sulfatation, glycosylation, phosphorylation et 2,5. Un nombre croissant de preuves met en évidence l&#39;importance de la MEA dans différents aspects de l&#39;immunité des plantes 1,5,6. La phosphorylation des protéines, la fixation réversible d&#39;un groupe phosphate à une sérine, thréonine ou tyrosine résidu est un régulateur de nombreuses fonctions cellulaires et sans surprise le plus fortement étudié PTM dans la défense des plantes cascades de signalisation 5-11. La phosphorylation de la signalisation dépendante est une partie intégrale de plante féactivation nse lancé après perception extracellulaire des microbes par des récepteurs transmembranaires, ou la reconnaissance intracellulaire par des protéines de résistance multidomaines 5,8. Dès plantes envahissantes, les microbes sont détectées par des récepteurs de la membrane plasmique appelées motif reconnaissance récepteurs (PRR) 12. PRR connus sont soit des protéines de type récepteur (RLPS) ou des kinases de récepteurs-like (RLKS), chacune ayant un ectodomaine de liaison au ligand et un domaine transmembranaire à passage unique. Contrairement à RLPS, RLKS ont un domaine kinase intracellulaire 13-15. L&#39;ectodomaine de PRR se lie à des molécules conservées microbe éliciteurs appelées motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) principaux, dans le cas de RLKS, à l&#39;autophosphorylation et transphosphorylation dans le domaine intracellulaire 6, 16. En aval de la phosphorylation induite par la perception de-PRR, la phosphorylation ultérieure de protéines kinases cytoplasmiques, notamment 17, </sup&gt; 18, E3 ligases 19, protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) 20, 21, protéines kinases dépendantes du calcium (CDPK) 22, 23, et les facteurs de transcription 24, 25 conduit à l&#39;immunité PAMP déclenché (PTI). En plus de la perception par les PRR extracellulaire, intracellulaire reconnaissance des pathogènes est obtenue grâce à des récepteurs cytoplasmiques. Ces protéines résistance multidomaine (R) contiennent un domaine variable N-terminale, un nucléotide contraignant (NB) motif central, et des répétitions riches en leucine C-terminaux (LRR) et donc appelés protéines NB-LRR 26, 27. R protéines directement ou indirectement reconnaissent les molécules de virulence pathogène dérivé appelées effecteurs, également connus pour cibler PRR et d&#39;autres noeuds du système immunitaire. Reconnaissance induit de fortes défenses conduisant à l&#39;immunité effecteur déclenchée (ETI) 28-31. Protéines NB-LRR ont une réquisitionmotif te ATP-binding dans le domaine NB 30, 32, mais ils n&#39;ont pas un domaine kinase. La phosphorylation de domaines conservés de NB-LRR a été rapporté dans un sondage à grande échelle protéomique 33, mais sa pertinence pour ETI n&#39;est pas claire. De même pour PTI, l&#39;activation de protéines NB-LRR conduit à la phosphorylation de protéines cytoplasmiques dont MAPK 34-37 et 38-40 CDPKs. Plus important encore, la reconnaissance d&#39;effecteur peut conduire à une phosphorylation de protéines accessoires qui interagissent directement avec les protéines NB-LRR 41. Quelques exemples incluent RIN4 (Arabidopsis thaliana) et Pto (tomate, Solanum lycopersicum) protéines qui interagissent avec des protéines NB-LRR, RPM1 42, 43 et 44 Prf, respectivement. Au cours de l&#39;infection par les bactéries Pseudomonas syringae, la protéine effectrice AvrB induit la phosphorylation RIN4, très probablement par la kinase de type récepteur RIPK 45, <sup&gt; 46. De même, dans la tomate P. syringae effecteurs AvrPto et AvrPtoB induisent la phosphorylation de Pto 47. Contrairement à RIN4 qui manque un domaine kinase et doit être trans-phosphorylée, Pto est une kinase active capable d&#39;auto-phosphorylation 48 et trans-phosphorylation de substrats 49, 50. Alors que Pto nécessite son activité kinase pour effecteur dépendant initiation de la signalisation, des mutants de Pto kinase-dead sont encore en mesure de signaler d&#39;une manière effecteur indépendant 51. Nous avons récemment expliqué ces observations en démontrant que le complexe Prf / Pto est oligomères, contenant plusieurs Prf et Pto molécules 52 et que les molécules Pto dans le même complexe peuvent trans-phosphorylation de l&#39;autre 47. Nous avons proposé un modèle dans lequel une molécule de Pto (capteur) interagit avec la protéine effectrice, provoquant un changement de conformation de la protéine NB-LRR (Prf) qui active à son tour une seconde molécule de Pto (auxiliaire) de l&#39;esprithin complexe. Par la suite, l&#39;assistant Pto molécule trans-phosphoryle le capteur Pto conduisant à l&#39;activation complète de la résistance complexe 47. Ces exemples montrent que l&#39;identification des composants de complexes immuns et leurs MEA potentiels sur la reconnaissance de l&#39;effecteur peut conduire à une meilleure compréhension de la façon dont les signaux sont transduction de la perception d&#39;effecteur des cibles en aval. Ici, nous décrivons un procédé de purification de la protéine pour les protéines NB-LRR n&#39;interagissent et l&#39;identification ultérieure de leurs MEA. Nous utilisons Nicotiana benthamiana et le complexe tomate Prf / Pto comme un modèle, mais le même protocole peut facilement être appliquée à RLKS de N. benthamiana et A. thaliana 53 avec de petites modifications comme nous le décrivons dans le protocole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

Les plantes s&#39;adaptent rapidement à l&#39;évolution des environnements dus à élaborer perception et des systèmes de signalisation. Au cours de l&#39;attaque pathogène, les plantes réagissent rapidement à l&#39;infection par le recrutement et l&#39;activation de complexes immuns. L&#39;activation des complexes immuns est associée à des modifications post-traductionnelles (PTM) de protéines, telles que la phosphorylation, la glycosylation, ubiquitination ou. Comprendre comment ces MEA sont chorégraphiés conduira à une meilleure compréhension de la façon dont la résistance est atteint. Nous décrivons ici une méthode de purification de protéines pour la leucine-riche répétition de nucléotides de liaison (NB-LRR) interagissant avec des protéines et l&#39;identification ultérieure de leurs modifications post-traductionnelles (PTM). Avec de petites modifications, le protocole peut être appliqué pour la purification d&#39;autres complexes de protéines végétales. La méthode est basée sur l&#39;expression d&#39;une version à marquage épitopique de la protéine d&#39;intérêt, b, qui est ensuite partiellement purifiéy immunoprécipitation et soumis à la spectrométrie de masse pour l&#39;identification de protéines et de MEA en interaction. Ce protocole démontre que: i). Des changements dynamiques dans MEA comme la phosphorylation peuvent être détectées par spectrométrie de masse, ii). Il est important de disposer de quantités suffisantes de la protéine d&#39;intérêt, ce qui peut compenser le manque de pureté de l&#39;immunoprécipité, iii). Afin de détecter MEA d&#39;une protéine d&#39;intérêt, cette protéine doit être immunoprécipitée à obtenir une quantité suffisante de protéine.

Nous décrivons ici un protocole pour la purification de protéines marquées de stable transgénique A. thaliana lignes ou après l&#39;expression transitoire de protéines dans N. benthamiana. Comme illustré sur la figure 1, la purification de la protéine ciblée est couplée à la spectrométrie de masse pour permettre l&#39;identification de protéines interagissant et le MEA de la protéine ciblée. Le protocole a été conçu pour la purification des protéines impliquées dans l&#39;immunité de la plante et l&#39;identification de leurs MEA, mais peut être appliqué à la purification de toute protéine de plante étiquetée. A titre d&#39;exemple, nous utilisons la purification du complexe Prf / Pto de N. benthamiana. L&#39;transgénique N. ligne benthamiana 38-12 54, exprimant 35S: Pto, a été transitoirement transformée avec 35S: Prf-FLAG et le complexe a été immunoprécipités avec anti-FLAG M2 agarose (figure 2A). Les immuno-empreintes (IB) de la figure 2Aillustrent le fait que la majeure partie de la protéine ciblée (Prf) a été immunoprécipitée. Pto et la protéine effectrice interagissant avec AvrPtoB ont été copurifiés Prf et détectée en utilisant des anticorps et analyse par spectrométrie de masse (figures 2A et 2B). Nous avons constaté que la prise de force que copurifiés avec Prf migré plus lente sur gel SDS-PAGE quand coexprimé avec l&#39;effecteur construit 35S: AvrPto et 35S: AvrPtoB (figure 2A). Les deux protéines effectrices induites migration plus lente de la prise de force interagissant avec Prf (Figure 2A). Cette reconnaissance effecteur dépendant lente migration de Pto a déjà été attribué à la phosphorylation comme il pourrait être éliminé par traitement avec la phosphatase 44. Pour détecter les sites de phosphorylation qui contribuent à la lente migration de prise de force, nous avons soumis le copurifying Prf Pto pour analyse par spectrométrie de masse. Malgré la forte expression de Pto et sa détection facile avec immunoblots nous pourrions récupérer peptides cOvering seulement 57% de la séquence Pto et nous pas réussi à identifier des sites de phosphorylation (figure 2B). Par la suite, nous avons changé les stratégies pour cibler la protéine Pto anti-FLAG. N. plantes benthamiana WT ont été transformées de façon transitoire avec 35S: Prf-3HA et 35S: Pto-FLAG, avec ou sans 35S: AvrPto et 35S. AvrPtoB Le montant total de la protéine Pto, comprenant à la fois le Prf complexé et les formes libres, était immunoprécipité avec anti-FLAG M2 agarose et soumis à une SDS-PAGE, le fractionnement, en-gel digestion trypsique et analyse par spectrométrie de masse (Figure 2C). Avec cette approche, nous avons identifié des peptides Pto couvrant environ 80% de sa séquence et un 100 kDa protéine interagissant inconnu. Nous avons identifié un ensemble de sites de phosphorylation simples et doubles pour les peptides 187-202 et 188-202 Pto (tableau 1). Ser et Thr-198-199 sont les sites de phosphorylation, mais prédominantes autre phosphorylation sites ont également été détectés (tableau 1). Le plus important à double phosphorylation sur Ser et Thr-198-199 a été identifié seulement en présence de l&#39;une protéine effectrice (tableau 1). Nous avons récemment identifié un ensemble similaire de sites de phosphorylation Pto et illustré l&#39;importance de l&#39;événement double phosphorylation de signalisation 47. En suivant le protocole décrit ici, nous avons pu identifier les changements dynamiques dans l&#39;état de la protéine cible de la phosphorylation. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> Figure 1. Conception expérimentale général. L&#39;protéine cible pour l&#39;immunoprécipitation (IP) est étiqueté et exprimé dans la plante, de manière transitoire dans Nicotiana benthamiana ou stable chez Arabidopsis thaliana. Après l&#39;extraction de la protéineprotéine cible est immunoprécipité avec une matrice d&#39;affinité. Les protéines sont séparées sur un gel d&#39;acrylamide par électrophorèse. bandes de gel sont excisées. Les protéines sont extraites à partir des bandes de gel et soumis à une spectrométrie de masse. les sites de phosphorylation et les protéines qui interagissent sont identifiés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> Figure 2. Prf et Pto immunoprécipitation. A). La construction 35S: Prf-FLAG a été transitoirement exprimé dans 38-12 ligne (35S: PTO) avec vecteur vide (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Trois jours après l&#39;infiltration Prf a été immunoprécipité utilisant des anticorps anti-FLAG matrice d&#39;affinité. Immunoblots (IB) pour Prf, AvrPtoB et Pto ont été réalisées. Comme indiqué par les flèches en bas de tableau de immunoblot Pto, AvrPto et AvrPtoB induisent une migration plus lente de la prise de force. B). La construction 35S: Prf-FLAG a été transitoirement exprimé dans 38-12 ligne (35S: PTO) avec vecteur vide (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Trois jours après l&#39;infiltration Prf a été immunoprécipité en utilisant l&#39;agarose anti-FLAG et séparés sur SDS-PAGE. Le gel a été coloré avec du bleu de Coomassie Brilliant colloïdale (CCBB) et le Prf visible, prise de force et AvrPtoB protéines bandes ont été excisées du gel et analysées par spectrométrie de masse. La couverture de peptide de pourcentage de prise de force et Prf séquences identifiées par spectrométrie de masse est indiquée. C). Les constructions 35S: Prf-3xHA et 35S: Pto-FLAG ont été exprimés transitoirement avec 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto ou vecteur vide (EV) en N. benthamiana. Trois jours après l&#39;infiltration du montant total dePto-FLAG a été immunoprécipité utilisant des anticorps anti-FLAG agarose et résolu sur SDS-PAGE. Le Pto visible et Pto-interagissant bandes de protéine ont été excisées du gel et analysées par spectrométrie de masse. Prise de force et la bande de protéine de 100 kDa Pto-interaction sont clairement visibles sur la Coomassie colloïdal Brilliant Blue (CCBB)-gel teinté, alors que Prf est un peu moins visible (comme indiqué par les flèches). IP: immunoprécipitation; IB: immunoblot; CBB: Coomassie coloration bleu; CCBB: colloïdal Coomassie coloration bleue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Prf </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> Pto peptide 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [p T 195] HLSTVVK </td><td&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> Pto peptide 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [p T 199] VVK </td&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Peptides 187-202 et 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Pourcentage de peptides avec deux événements de phosphorylation </td><td> 0% </td><td> 26,9% </td><td> 11,2% </td></tr><tr><td> Pto couverture séquence </td><td> 78% </td><td> 79% </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> Tableau 1 double phosphorylation d&#39;un peptide Pto lors de l&#39;activation de la signalisation 35S:.. Prf-3xHA et 35S: Pto-FLAG ont exprimé de façon transitoire avec luipty vecteur (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB en N. benthamiana. Trois jours après l&#39;infiltration de la quantité totale de protéine Pto-FLAG a été immunoprécipité utilisant des anticorps anti-FLAG matrice d&#39;affinité et résolu sur SDS-PAGE. Les bandes visibles de Pto sur le gel colloïdal Coomassie colorée en bleu ont été excisées et analysées avec la spectrométrie de masse. Le nombre de peptides identifiés Pto avec 0, 1, et 2 événements de phosphorylation est indiqué. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Table des tampons </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L milieu </td><td> Tryptone </td><td> 10 g / L </td></tr><tr><td></td><td> Extrait de levure </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> D-glucose </td><td> 1 g / L </td></tr><tr><td> Tampon agro-infiltration </td><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Ajuster à pH 5,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acétosyringone (facultatif) </td><td> 150 uM </td></tr><tr><td> Tampon A </td><td> Tris-HCl pH 7,5 </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glycérol </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Tampon B </td><td> Tampon A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2% (p / v) </td></tr><tr><td> Tampon C </td><td> Tampon B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothréitol (DTT) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Usine d&#39;inhibiteur de protéase Cocktail </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) </td><td> 0,5 mM </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Un calyculine </td><td> 50 nM </td></tr><tr><td></td><td> Le fluorure de sodium (NaF) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td></td><td> molybdate de sodium (Na 2 MoO 4) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Sodium orthovanadate </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td></td><td> Acide okadaïque </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Tampon D </td><td> Tampon C sans PVPP </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de chargement 5x SDS-PAGE </td><td> Tris-HCl pH 6,8 </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2% </td></tr><tr><td></td><td> Glycérol </td><td> 0,15% </td></tr><tr><td></td><td> Bleu de bromophénol </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td></td><td> TNT (ajouter juste avant utilisation) </td><td> 50 mM </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Tampon et recettes des médias.

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Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Nous décrivons ici un protocole pour la purification et la caractérisation de complexes de protéines végétales. Nous démontrons que par immunoprécipitation une seule protéine dans un complexe, afin que nous puissions identifier ses modifications post-traductionnelles et ses partenaires d&#39;interaction.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K vues.  University of Warwick.  Nous décrivons ici un protocole pour la purification et la caractérisation de complexes de protéines végétales. Nous démontrons que par immunoprécipitation une seule protéine dans un complexe, afin que nous puissions identifier ses modifications post-traductionnelles et ses partenaires d'interaction. 

Vidéo: Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Recherche

Biologie

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l&#39;expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Détection des modifications des histones dans les feuilles des plantes

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Méthode pour l&#39;isolement et l&#39;identification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d&#39;extraits cellulaires utilisant RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l&#39;étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...