Un merci tout spécial à Yves Couder pour de nombreuses discussions utiles. Nous remercions Atef Asnacios pour l&#39;étalonnage des consoles et des discussions. Nous remercions Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, et Oliver Hamant pour la lecture critique. Ce travail a été financé en partie par Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C de subvention; Projets de l&#39;Agence Nationale de la Recherche&#39;&#39; Growpec,&#39;&#39; et&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. Préparer lames de verre pour l&#39;échantillon de montage <ol><li> Préparer plongement médias agarose: 0,7% d&#39;agarose à faible point de fusion dans 10% de mannitol (dans l&#39;eau). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un instrument de métal solide (par exemple pointe de forage, de la chaux), graver un cm x 0,5 0,5 zone dans le centre d&#39;une lame de verre de microscope. Ou plutôt, coller un petit morceau de lamelle de verre (environ 20 x 200 um) à la lame de verre avec de la colle Araldite. REMARQUE: Cette rugosité de la surface, afin de faciliter l&#39;adhérence de l&#39;agarose afin de s&#39;assurer que les bâtonnets de médias d&#39;agarose ou des corrections à la diapositive. Cette glissière peut être réutilisé. </li><li> Positionner une gouttelette d&#39;environ 20 pi d&#39;agarose à insérer de support sur la région gravée de la lame de verre. On obtient ainsi un film mince d&#39;agarose. </li><li> Conservez la lame de verre dans une boîte humide et attendre que les médias d&#39;agarose à solidifier. </li></ol> 2. Dissection et montage échantillons méristèmes <ol><li> Microdissect méristèmes pour imagination confocaleng: supprimer les boutons floraux, un par un à partir de la tige en les tirant vers le bas avec des pincettes ultra-fines. Il est important d&#39;enlever tous les bourgeons floraux à les bourgeons qui ne présentent pas de sépales (c&#39;est à dire les ébauches de P1 14). </li><li> En utilisant une lame de rasoir ou la pointe de la pince à épiler, couper le méristème loin de la tige. La coupe doit être parallèle à la région de la surface du méristème qui doit être mesurée à l&#39;aide de l&#39;AFM. Le sommet obtenu doit être comprise entre 300 um et 600 um haute pour passer sous la pointe de l&#39;AFM. </li><li> Poussez le sommet dans le film de médias agarose préparés à l&#39;étape 1.1.4. Choisir un emplacement sur la lame de verre / agarose et pousser doucement de telle sorte que le méristème est à la fois directement en contact avec la lame de verre et fait saillie hors de l&#39;agarose. Il est essentiel de positionner le méristème dans la gélose dans les quelques secondes qui suivent sa coupe de la tige. NOTE: Ceci est pour éviter le méristème de séchage. A ce stade, le méristème sera debout dans un crack parce que l&#39;agarose fracturé lors de l&#39;application de la pression. </li><li> Préparer plusieurs méristèmes de cette manière pour l&#39;imagerie par lots, à condition qu&#39;ils soient de la même hauteur et sont placées à moins de 500 pm les unes des autres sur la diapositive. Gardez les méristèmes préparés dans la zone humide tandis que la dissection des échantillons supplémentaires. NOTE: Il limite la variation venant de l&#39;étalonnage. Idéalement 2 échantillons de chaque état peuvent être préparés et mesurés de façon aléatoire. Jusqu&#39;à présent, il est sans effet observé de l&#39;imagerie de lot sur la mesure (stress induit une réponse). Cela pourrait être, grâce à la dilution de molécules de signalisation de stress dans l&#39;agar-agar et / ou de la solution de montage. En variante, la réaction de stress est la même quelle que soit la quantité de l&#39;échantillon préparé. </li><li> Avant de passer à l&#39;étape suivante, assurez-vous que la frontière entre le méristème et les boutons floraux est sec. Sinon, retirez délicatement l&#39;excès d&#39;eau avec un papier filtre. Cela devrait éviter dans l&#39;étape suivante que le fonduagarose inonde l&#39;échantillon en raison de forces de capillarité. </li><li> Avec une pipette 20 ul, ajouter suffisamment fondu de montage agarose à remplir la fissure créée à l&#39;étape 1.2.3. et à entourer chaque méristème. L&#39;agarose devrait atteindre le niveau de la cicatrice de bourgeon de fleur enlevé (de primordium). Pour ce faire, il peut être nécessaire d&#39;ajouter d&#39;agarose à chaque extrémité de la fissure. </li><li> Lorsque la gélose est ajouté, il va rapidement inonder dans la fissure; à l&#39;aide de la pipette, aspirer une partie de l&#39;agarose fondu de montage afin de s&#39;assurer que le méristème est le point le plus haut sur le coulisseau. Cela corrige le méristème de sorte qu&#39;il ne peut pas se déplacer au cours de l&#39;imagerie. </li></ol> 3. Montage des racines ou hypocotyle échantillons <ol><li> Pour les racines et les hypocotyles, aucune dissection est nécessaire. Dans le film mince d&#39;agarose sur la lame de verre préparées, faire une rainure, soit directement au-dessus d&#39;une gravure dans le verre ou le long d&#39;une lamelle de verre. Positionner la racine ou de l&#39;hypocotyle dans cette rainure en s&#39;assurant qu&#39;il est en contact avec leverre sur toute sa longueur. </li><li> Avant de passer à l&#39;étape suivante, assurez-vous que l&#39;échantillon est sec à sa surface. Sinon, retirez délicatement l&#39;excès d&#39;eau avec un papier filtre. </li><li> Ajouter fondu de montage agarose autour de l&#39;échantillon comme dans l&#39;étape 1.2.6. </li></ol> 4. AFM Préparation et Calibrage de la sensibilité (pour un JPK Nanowizard AFM) <ol><li> Monter un porte à faux sur l&#39;AFM. Le cantilever doit être monté avec pénétrateur de forme ronde. Le rayon détermine les coordonnées x, y, z de résolution et la profondeur de pénétration au cours de laquelle une mesure précise puisse être archivée. <ol><li> Pour prendre des mesures méso-échelle nanométrique à la surface de l&#39;épiderme, utiliser un pénétrateur ronde rayon de 50 nm; de prendre des mesures méso-échelle, utiliser un rayon um pénétrateur ronde 0,5; de prendre des mesures micrométriques (dans 2-3 cellules), utiliser un pénétrateur ronde 2,5 um de rayon. </li></ol></li><li> Positionner le laser à la pointe de la poutre. Aligner le laser au milieudu capteur à l&#39;aide du miroir. </li><li> Placez un verre propre sous l&#39;AFM. Remarque: le texte suivant est réglé pour transformer le signal de la position du laser sur le récepteur AFM en une déformation de la poutre et, par l&#39;évaluation de la constante de rappel du levier, pour la traduire en une force. </li><li> Approche avec une force de cible &quot;consigne&quot; de 1 V. </li><li> Sélectionnez «spectroscopie de force&quot;. Faites une entaille en réglant le maximum &quot;point de consigne par rapport&quot; à 2 V, la &quot;étendre vitesse&quot; à 40 um / s, et le &quot;z longueur&quot; à 5 um. </li><li> Dans le menu &quot;calibrage gestionnaire&quot;, sélectionnez la partie linéaire de la courbe vers l&#39;avant pour s&#39;adapter à la sensibilité à l&#39;aide du bouton «sélectionner gamme ajustement&quot;. Le &quot;point de consigne par rapport&quot; devrait être transformé de &quot;V&quot; pour &quot;mètre&quot;. </li><li> Dans le menu «gestionnaire d&#39;étalonnage&quot;, sélectionnez &quot;constante de rappel» pour évaluer l&#39;elasticity du cantilever, avec des fluctuations thermiques. Appuyez sur &quot;Exécuter&quot; pour obtenir le tracé de la densité spectrale de la poutre. Trouver le pic de résonance à la fréquence la plus basse. Monter à l&#39;aide de la touche «select gamme ajustement&quot;. NOTE 1: Pour plus de détails sur le réglage des fluctuations thermiques, lu Cook et al 15. NOTE 2: Il est préférable d&#39;utiliser une méthode directe pour évaluer l&#39;élasticité de la poutre à l&#39;aide d&#39;une console de référence (ou matériau de raideur connue). Celle utilisée ici a été gracieusement offert par Atef Asnacios 16. </li><li> Ajouter 200 pi de solution de mannitol à 10% sous la pointe du cantilever. Réaligner le laser au moyen du capteur à l&#39;aide du miroir. </li><li> Recalibrer la sensibilité: à partir du menu &quot;calibrage gestionnaire&quot;, cliquez sur le bouton «inconnu»; répétez les étapes 2.3 à 2.5. </li></ol> . 5 Acquisition de données: module de Young apparent de Cartographie <ol&gt; <li> Placer les échantillons montés sous l&#39;AFM et ajouter une goutte de 500 pl d&#39;une solution de mannitol à 10% sur l&#39;échantillon. La solution de mannitol plasmolyzes les cellules en quelques minutes. </li><li> Approche avec une force de cible (&quot;consigne&quot;) de 20 nN (&quot;de point de consigne&quot; ne devrait pas être plus de 3 V) </li><li> Retrait d&#39;un &quot;point de consigne relative» de 200 nN, un &quot;étendre vitesse&quot; de 40 um / s, et &quot;z longueur&quot; de 5 um. </li><li> Réglez le &quot;point de consigne relative&quot; afin d&#39;obtenir une empreinte de 100 nm pour le 200 nm monté en porte à faux ou 0,5 um pour la 1 pm / 5 um cantilever monté. </li><li> En mode &quot;cartographie de la force&quot;, sélectionnez une région à numériser: pour méristèmes, 70 um x 70 um avec une résolution (&quot;pixels&quot;) de 64 x 64; pour les hypocotyles et les racines, 100 um x 100 um avec une résolution de 64 x 64. </li><li> Appuyez sur SCAN pour lancer les expériences. Enregistrez la sortie. </li&gt; </ol> 6. Analyse des données: calculs de l&#39;apparente module d&#39;Young <ol><li> Ouvrir le fichier de données dans le logiciel d&#39;analyse de données. </li><li> Sélectionnez &quot;traitement par lots&quot; pour appliquer la même analyse à toutes les courbes d&#39;une seule carte. </li><li> Sélectionner &quot;corriger la hauteur de la flexion de la poutre&quot; afin d&#39;extraire la profondeur de pénétration. </li><li> Sélectionnez &quot;module fonction d&#39;ajustement de Young» qui suppose la force est proportionnelle à la surface de l&#39;indentation. Réglez la &quot;forme de pointe&quot; pour paraboliques de supposer que la forme d&#39;indentation est une parabole. </li><li> Indiquez le rayon de la pointe. </li><li> Sélectionner préférentiellement le &quot;retract&quot; courbe de l&#39;analyse, car il est moins sensible à la topographie de la courbe &quot;étendre&quot;. Cependant, si il ya adhérence importante de la sonde au cours de la &quot;rentrée&quot;, utilisez la courbe «prolonger», qui est insensible à coller. </li><li> Setle coefficient de Poisson de 0,5. Appuyez sur analyser et enregistrer la sortie. </li></ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+(Creep)+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin.">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25 (2009).</li><li>Suslov, D., Verbelen, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TipChip:+a+modular,+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells.">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li><li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xyloglucan+endotransglucosylase/hydrolase+(XTH)+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls.">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li><li>Byrne, M. 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A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Chez les plantes, la modification des propriétés mécaniques jouent un rôle majeur dans la direction de la croissance et de la morphogenèse. À ce jour, il ya eu de grands progrès dans le décryptage des réseaux génétiques et chimiques qui contrôlent la croissance des plantes, mais notre connaissance de la façon dont ces réseaux contribuent à et sont affectés par les changements des propriétés mécaniques est rudimentaire. Cette méthode devrait nous permettre de combler cette lacune, et il devrait donc ?...

La croissance des plantes est obtenue par l&#39;expansion coordonnée des parois cellulaires rigides qui entourent chacune des cellules de l&#39;organisme. L&#39;accumulation de preuves indique que c&#39;est grâce à la modification de la chimie de la paroi cellulaire des plantes qui contrôlent localement cette expansion. L&#39;expansion est pensée pour être entraînée principalement par pression sur les parois des cellules, provoquée par la haute pression de turgescence de la cellule; cette réponse en déformation à la pression de turgescence est régie par les propriétés mécaniques des parois cellulaires 1. On sait peu de ces propriétés mécaniques et comment ils changent au cours du développement. Par ailleurs on sait peu de la façon dont ces propriétés mécaniques sont contrôlés et si des évaluations contribuent à modifier la chimie de la paroi cellulaire d&#39;une manière qui est apparemment coordonné à travers un tissu. Si nous voulons comprendre le lien entre les changements chimiques et mécaniques dans les parois cellulaires de la plante au cours du développement, et, finalement, comment ces interactions microscopiques régissent une planteDe croissance macroscopique, une méthode qui peut surveiller les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes à l&#39;échelle cellulaire ou tissulaire est nécessaire. La méthode microscopie à force atomique (AFM) décrit ici, qui est basé sur micromètre ou du nanomètre compressions de tissus ou entailles, a été développé précisément pour mesurer les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes simultanément à des résolutions sub-cellulaires et dans des régions entières du tissu. D&#39;autres méthodes ont soit une résolution qui est trop bas ou trop élevé: l&#39;extensomètre est seulement capable de mesurer les propriétés mécaniques moyennes d&#39;un tissu tout à l&#39;échelle du millimètre 2-4, une échelle qui est par exemple trop grande pour mesurer les événements précoces l&#39;organogenèse; la microindenter peut prendre des mesures à la résolution subcellulaire à l&#39;échelle du nanomètre, mais il est limité à la mesure des cellules isolées et non des groupes de cellules ou d&#39;organes 5-7. Avec l&#39;AFM, le besoind tissulaire, cellulaire et subcellulaire des résolutions peuvent être atteints 8-10. Récemment, plusieurs protocoles ont été développés spécifiquement pour mesurer la mécanique de plantes tissus qui pourraient également être utilisés 11, 12. Nous allons présenter ici comment évaluer l&#39;élasticité des tissus grâce à la mesure du module de Young apparent 13. Le module d&#39;Young est couramment utilisé pour décrire la rigidité du matériau. Pendant petite déformation de la force requise pour déformer un matériau est proportionnelle à la surface de l&#39;indentation. Le module d&#39;Young est ce coefficient. Dans le cas d&#39;un matériau homogène continu le même coefficient sera mesuré, indépendamment du type d&#39;indentation (de taille et la forme) mais va changer avec la vitesse de la mesure. Dans le cas de la structure complexe de tissus végétaux, nous avons observé que la mesure de la force est proportionnelle à la déformation permettant la détermination deun coefficient de proportionnalité que l&#39;on nomme «module de Young apparent». En contraste à partir de supports continus dans les plantes, ce module de Young apparent est sensible à la taille de l&#39;indentation. Elle ne correspond pas à la jeune modules d&#39;une paroi cellulaire pure. Il décrit le mieux l&#39;élasticité de l&#39;échafaudage de la paroi cellulaire du tissu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

Nous décrivons une méthode récemment développée pour mesurer les propriétés mécaniques des surfaces de tissus végétaux en utilisant microscopie à force atomique (AFM) micro / nano-indentations, pour un JPK AFM. Plus précisément, dans ce protocole, nous mesurons le module de parois cellulaires de Young apparent à des résolutions sub-cellulaires à travers les régions de jusqu&#39;à 100 um x 100 um de méristèmes floraux, hypocotyles et les racines. Cela nécessite une préparation minutieuse de l&#39;échantillon, la sélection correcte de micro-pénétrateurs et des profondeurs d&#39;indentation. Pour tenir compte des propriétés de la paroi cellulaire seulement, les mesures sont effectuées dans des solutions fortement concentrées de mannitol en vue de plasmolyser les cellules et ainsi supprimer la contribution de la pression de turgescence des cellules. Contrairement à d&#39;autres techniques existantes, en utilisant différents pénétrateurs et les profondeurs d&#39;indentation, cette méthode permet la mesure simultanée de plusieurs échelles, <em&gt; C&#39;est à dire à des résolutions sub-cellulaires et sur ​​des centaines de cellules comprenant un tissu. Cela signifie qu&#39;il est maintenant possible de caractériser spatialement-temporellement les changements qui ont lieu dans les propriétés mécaniques des parois cellulaires au cours du développement, l&#39;activation de ces modifications pour être en corrélation avec la croissance et la différenciation. Cela représente une étape clé pour comprendre comment les changements cellulaires microscopiques coordonnées apporter sur les événements morphogénétiques macroscopiques. Toutefois, plusieurs limitations persistent: le procédé ne peut être utilisé sur des échantillons relativement petits (autour de 100 um de diamètre) et seulement sur des tissus externes; la méthode est sensible à la topographie de tissu; il ne mesure que certains aspects des propriétés mécaniques complexes du tissu. La technique se développe rapidement et il est probable que la plupart de ces limitations seront résolus dans un proche avenir.

Dans la figure 1, nous présentons des cartes de modules jeunes typiques de méristèmes floraux (Figures 1A et 1B), jeunes et vieux hypocotyles (figures 1C-F), et méristème de la racine (figure 1G et 1H). Dans toutes les expériences, le pénétrateur est hémisphérique, mais son rayon est différent de sorte que différentes résolutions spatiales peuvent être atteints figures 1C et 1D</st...

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AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vues.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Recherche

Biologie

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Méthodes Single Molecule pour surveiller les changements dans les propriétés élastique bicouche

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Analyse de la composition globale de la paroi cellulaire végétale (biomasse lignocellulosique) Partie II: Glucides

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissection de l&#39;Auditory Bulla chez les souris postnatale: Isolation des os de l&#39;oreille moyenne et l&#39;analyse histologique

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

Quantification des densités cellulaires et des propriétés antigéniques par lévitation magnétique

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...