Les auteurs tiennent à remercier Jane Johnson pour la Math1, Ngn1, et des anticorps PTF1A et Connie Cepko pour la pCAG :: GFP plasmide. Ce travail a été financé par le NIH R15 1R15HD059922-01.

1. La préparation avant l&#39;électroporation <ol><li> Amplifier l&#39;ADN pour l&#39;électroporation par une préparation maxi (Prime-It ou Qiagen). La concentration de l&#39;ADN doit être au minimum de 1 mg / mL pour une absorption efficace. </li><li> Retirer 495 uL d&#39;ADN et mélanger avec 5 pi de Green Fast 0,01% dans du 1 x PBS (tampon phosphate salin) dans un microtube. </li></ol> 2. Récolte embryonnaire <ol><li> Établir accouplements chronométrés de souris CD-1 (Harlan). Vérifier la présence de bouchons vaginaux et considérer la date un bouchon vaginal est observé comme le jour embryonnaire (E) 0,5. Les embryons seront récoltés 11 jours après la visualisation fiche (E11.5). </li><li> Placez les outils stérilisés dans de l&#39;éthanol 70%. Traiter une hotte à écoulement laminaire avec une lumière UV pendant au moins une heure avant l&#39;utilisation. Capote de roof, bac de dissection, et la dissection étendue à l&#39;éthanol 70%. Pré-chauffer 1 X PBS à 37 ° C. </li><li> Sur E11.5 euthanasier la femelle à des conditions agréées par l&#39;InstitutComité ional pour le soin et l&#39;utilisation des animaux (ICCUA). Placer le plateau de dissection dans la hotte à flux laminaire. Vaporiser vers le bas de l&#39;abdomen de la femelle avec de l&#39;éthanol 70%. </li><li> Ouvrez la cavité péritonéale et épinglez les murs sur le plateau de dissection. Tirez sur les cornes utérines afin qu&#39;il repose dans la cavité péritonéale. </li><li> Découper soigneusement la paroi de la corne utérine. Utilisez une cuillère 20 mm (Beaux-outils scientifiques) pour enlever délicatement l&#39;embryon dans le sac vitellin loin de la barrière placentaire. Embryons déposer dans un plat de 100 mm de culture de tissus pré-remplie avec 10 ml de PBS stérile 1 X qui a été préchauffé à la section 2.2. </li><li> Répétez l&#39;opération pour tous les embryons présents. </li></ol> 3. Électroporation d&#39;embryons E11.5 (Figure 1) <ol><li> Avec une cuillère 20 mm, transfert de l&#39;embryon d&#39;abord à un nouveau 100 mm plat pré-remplie avec 10 ml de 1XPBS stériles qui a été préchauffé à 37 ° C. </li><li> Utilisez une pince 11 cm avec une pointe de 0,05 x mm 0,02 (Beaux-outils scientifiques) à réexaminer avec soindéplacer et jeter le sac vitellin. </li><li> Embryon position de telle sorte que sa face dorsale est tournée vers le haut afin qu&#39;il ressemble à la bande dessinée dans la figure 1A. Utilisez 7 palettes d&#39;électrodes mm (Harvard Apparatus) pour tenir doucement l&#39;embryon. Les électrodes doivent être positionnés de chaque côté du tube neural au niveau du ventricule rhombencéphale quatrième. Le ventricule est visible à l&#39;œil nu mais en utilisant un microscope à dissection peut faciliter le placement pagaie précis. Positionnement des palettes est essentiel pour déterminer la région qui reçoit l&#39;ADN électroporé. Si la lèvre inférieure rhombique (LRL) du cerveau postérieur dorsal embryonnaire est souhaitée, pagaies doivent être lieu de telle sorte qu&#39;ils sont directement flanquant la partie la plus large de l&#39;ouverture du quatrième ventricule. </li><li> Utilisez une seringue de 1 cc de dresser l&#39;ADN plasmidique mélangé avec Green Fast 0,01%. 500 ul du mélange doit être suffisante pour l&#39;électroporation d&#39;au moins 8-10 embryons (voir 3.5). </li><li> Délicatement percer la ov roofplateerlying quatrième ventricule avec une aiguille tuberculine 25G 5/8 fixée à la seringue 1 cc et injecter le mélange d&#39;ADN-colorant dans le ventricule. Injections retenus sont caractérisés par le mélange d&#39;ADN-colorant de remplissage du système ventriculaire ensemble (figure 1C). La quantité d&#39;ADN de colorant mélange généralement injecté est inférieure à 50 pL. Montants exactes sont variables entre les embryons en tant que partie du mélange a tendance à s&#39;écouler du ventricule dans le PBS entourant l&#39;embryon. Un autre moyen de fournir le mélange d&#39;ADN de colorant serait en accédant au système ventriculaire par ponction du voile recouvrant le mésencéphale. À nouveau, les injections sont retenus caractérisé par le mélange d&#39;ADN-colorant de remplissage du système ventriculaire ensemble. </li><li> Donner cinq impulsions carrées en utilisant un générateur d&#39;impulsions électriques (BTX) et 7 palettes d&#39;électrodes mm. Chaque impulsion est de 50 V durable 5 ms par impulsion avec 500 ms entre chaque impulsion. Le tissu le plus proche de l&#39;électrode chargée positivement sera alors take le plasmide. </li></ol> 4. Culture des embryons <ol><li> Dans une hotte à flux laminaire, remplir les puits extérieurs d&#39;une boîte de culture de 12 puits avec 2 ml de DMEM/F12 des milieux supplémentés avec 10% de sérum de veau foetal, 5% de sérum équin, de la glutamine à 1%, 1% de pénicilline / streptomycine qui a été préchauffé à 37 ° C. Les conditions de culture ont été adaptés à partir de Diego et ses collègues 15. </li><li> Dans les embryons de flux laminaire hotte à pincée section médiane (ci-dessous du cœur) avec une pince et retirer la partie postérieure de l&#39;embryon. Placer la partie antérieure dans l&#39;une des puits rempli de la boîte de culture à 12 puits. </li><li> Répétez l&#39;opération pour tous les embryons. Remplissez seulement les puits extérieurs de la plaque à 12 puits pour éviter la contamination des cultures. </li><li> Culture d&#39;embryons dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Expression du plasmide électroporé devrait être observable dans les 24 heures. </li><li> Si plus temps de culture désirer, remplir les puits sur un nouveau plateau 12 et avec 2 ml deles médias utilisés dans 4.1. Avec une cuillère stérilisée transférer les embryons à un puits dans la nouvelle plaque. Remettre dans l&#39;incubateur à 37 ° C. Culture pour un maximum de 48 heures est possible. </li><li> Lorsque le temps de culture désirée est atteinte, fixer des embryons pour l&#39;analyse (voir ci-dessous). </li></ol> 5. Préparation d&#39;embryons pour l&#39;analyse <ol><li> Rincer embryons en 1 X PBS à 4 ° C pendant cinq minutes. Répéter. </li><li> Fixer embryons pour l&#39;analyse de paraformaldéhyde 2% (PFA) dans 1XPBS pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Rincer embryons en 1 X PBS à 4 ° C pendant cinq minutes. Répéter. </li><li> Equilibrer embryons de saccharose à 30% en 1 X PBS pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Intégrer les embryons in Température de coupe optimale (PTOM) composé en utilisant un sèche glace / éthanol bain. Les embryons peuvent être conservés à -20 ° C. </li><li> Section embryons sur un cryostat (Leica) dans 30 sections um et monter sur des lames (VWR, Superfrost Plus). Conserver à -20 ° C. </li></ol> 6. ImmuAnalyse nohistochemistry <ol><li> L&#39;immunohistochimie a été réalisée comme décrit dans 16. Dilutions d&#39;anticorps primaires utilisés pour cette étude comprennent lapin α-GFP (Invitrogen) 1:2500; souris α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; lapin α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000, lapin α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500; lapin Math1 (Jane Johnson) 1:100. Incuber diapositive côté plat spécimen, sur un plateau de coloration à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Les lames ont été analysées sur un microscope composé (Olympus BX51). </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Un schéma de la figure 1A représente l&#39;expérience d&#39;électroporation. Figure 1B montre une vue sagittale d&#39;un embryon E11.5 avant la manipulation. Le même embryon après injection de l&#39;ACG plasmide contenant :: GFP dans Green Fast 0,01% est illustré à la figure 1C et un embryon présentant représentant non fixée GFP unilatéraleexpression dans le rhombencéphale culture de 24 h dorsale suivante est affichée dans la figure 1D. L&#39;étendue de la zone de la LRL qui est avec succès par électroporation est variable et semble être très dépendante sur le positionnement des électrodes. Dans nos études, il a été constaté que 52 des 65 (80%) des embryons électroporées exprimé avec succès la GFP. Le tissu a été réputé être avec succès par électroporation si elle a été positive pour la GFP dans des régions localisées sur plusieurs sections après la fixation et l&#39;analyse immunohistochimique (voir ci-dessous). Les embryons qui ne répondaient pas aux critères ont été marqués ce que les tentatives infructueuses de l&#39;électroporation. Une évaluation plus poussée de l&#39;efficacité d&#39;électroporation peut être déterminée en effectuant immunohistochimie contre la GFP sur des coupes transversales d&#39;embryons électroporées au niveau du quatrième ventricule. La figure 2 montre représentatives des coupes sériées de l&#39;embryon affichage unilatéraleExpression de la GFP. La figure 2A montre un schéma idéalisé qui illustre que le côté gauche de l&#39;embryon était vers l&#39;électrode positive. Les sections transversales (à des niveaux représentés par le dessin animé milieu de la figure 2A) révèlent expression de la GFP localisée exclusivement sur ​​le côté gauche du tissu du cerveau postérieur (Figures 2C et 2D). La zone de l&#39;électroporation LRL ne s&#39;étend pas l&#39;ensemble axe antéro-postérieur du tube neural que l&#39;examen des articles 300 um rostrales ou supérieure à celle montrée à la figure 2C ne expriment la GFP (figure 2B). L&#39;utilité de cet essai pour la manipulation de l&#39;expression génique est dépendante de la stabilité des domaines d&#39;expression pour les protéines endogènes. Le LRL a été caractérisé comme possédant domaines progénitrices unique caractérisé par l&#39;expression différentielle des facteurs de transcription proneural (revue dans 1).Un sous-ensemble de ces facteurs (Mash1, Math1, Ngn1, et Ptf1a) ont été choisis pour l&#39;analyse en raison de leur projet et / ou des rôles caractérisés dans la spécification des sous-types de neurones précérébelleux dans le LRL, un objet d&#39;études futures 16-18. Tous les quatre protéines ont des domaines d&#39;expression très caractéristiques dans le cerveau postérieur caudale à E11.5 16-18. Nous avons observé que les embryons qui ont été placés cultures n&#39;a pas augmenté en taille et en a également omis de lancer la production de l&#39;épithélium du plexus choroïde et l&#39;invagination des LRL et roofplate, des événements morphologiques qui se produisent entre E11.5 E12.5 et 5. Sur la base de ces observations, il a été déterminé que le développement normal de ces embryons a été interrompue ou retardée grossièrement et le contrôle comparable pour les embryons cultivés devrait être embryons incultes à E11.5. Pour veiller à ce que la culture et l&#39;électroporation ne pas déranger les niveaux de protéines endogènes, nous avons analysé quatre protéines différentes par immunohistochemistry (IHC) dans 34 embryons différents qui ont été électroporés puis cultivées pendant au moins 24 heures. Le tableau I montre le nombre d&#39;embryons analysés pour chaque marqueur et le pourcentage des embryons analysés qui ont conservé des taux de protéines normales. La figure 3 montre les données représentant IHC de deux des protéines analysées, Mash1 (figures 3A et 3B) et Math1 (figures 3C et 3D). Nous avons observé que la majorité des embryons conservés des niveaux normaux d&#39;expression à la suite d&#39;électroporation et la culture (figures 3B et 3D) par rapport aux embryons de contrôle à E11.5 (figures 3A et 3C). Fait important, les domaines d&#39;expression caractéristiques de ces protéines ne sont pas perturbés. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Électroporation d&#39;embryons à E11.5. (A) Schéma d&#39;eexpérience électroporation e. Un embryon E11.5 est isolé et le plasmide d&#39;expression dans le vert rapide 0,01% est injecté dans le quatrième ventricule. L&#39;embryon est ensuite flanqué par des palettes d&#39;électrodes et soumis à une impulsion de 50 V avant d&#39;être placé dans la culture (B) Coupe sagittale d&#39;un embryon E11.5 avant l&#39;injection. (C) Le même embryon E11.5 suite à l&#39;injection de plasmide dans Green Fast 0,01%. (D) l&#39;expression unilatérale de la GFP rhombencéphale observée dans l&#39;embryon E11.5 après 24 h de la culture. mb-mésencéphale; 4v-quatrième ventricule. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Expression de la GFP dans les tissus électroporé. (A) La bande dessinée sur la gauche représente le placement des électrodes autour d&#39;un embryon E11.5. Moyen dessin représente l&#39;absorption et l&#39;expression de plasmide codant la GFP sur le côté gauche de l&#39;embryon. Caricature sur le droit est schématique d&#39;une section transversale prise à travers idéalisée de l&#39;embryon à lES NIVEAUX notée par des lignes noires dans la bande dessinée du milieu. (B-D) immunohistochimie pour la GFP sur des coupes transversales à travers un embryon électroporé E11.5 après 24 h de la culture. Les flèches indiquent la roofplate (rp) qui piège l&#39;anticorps secondaire. Les images sont prises à un grossissement de 10X. Les niveaux relatifs des sections indiquées sont représentés par les lignes horizontales par le biais du dessin animé du milieu dans (A). mb-mésencéphale; l 4v-quatrième ventricule; rp-roofplate. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Expression de protéines endogènes dans la lèvre inférieure rhombique immunohistochimie pour Mash1 (A et B) ou Math1 (C et D) en comparant des coupes transversales d&#39;embryons E11.5 qui n&#39;étaient pas cultivées (A, C) avec des embryons qui ont été électroporés avec l&#39;ACG.: : GFP et cultivé pendant 24 heures (B et D). Images prises à un grossissement de 10X. <table border="1"><tbody><tr><td> Proneural Transcriptisur une analyse factorielle </td><td> Nombre d&#39;embryons analysés </td><td> Pourcentage de retenue profils d&#39;expression normales </td></tr><tr><td> Math1 </td><td> 15 </td><td> 86,7% </td></tr><tr><td> Mash1 </td><td> 12 </td><td> 83,3% </td></tr><tr><td> Ngn1 </td><td> 7 </td><td> 71,4% </td></tr><tr><td> Ptf1a </td><td> 6 </td><td> 100% </td></tr></tbody></table> Tableau I. Pourcentage d&#39;embryons et d&#39;élevage de soutènement électroporées normales Proneural Domaines facteur de transcription dans le LRL.

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	<li>Ray, R. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rautenlippe+Redux+--+toward+a+unified+view+of+the+precerebellar+rhombic+lip.">Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip.</a> Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).</li><li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors.">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li><li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development.">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li><li>Wingate, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+rhombic+lip+in+avian+cerebellum+development.">The role of the rhombic lip in avian cerebellum development.</a> Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , (1997).</li><li>Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindbrain+rhombic+lip+is+comprised+of+discrete+progenitor+cell+populations+allocated+by+Pax6.">Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6.</a> Neuron. 48, 933-947 (2005).</li><li>Hoshino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ptf1a,+a+bHLH+transcriptional+gene,+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum.">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47, 201-213 (2005).</li><li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+climbing+fiber+neurons+and+their+developmental+dependence+on.">Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on.</a> Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La technique d&#39;électroporation in vitro dans présentés dans cette étude est une nouvelle méthodologie qui peut être efficacement utilisée pour manipuler l&#39;expression des gènes dans les embryons de moins de 12 jours de gestation. Placement des embryons dans la culture permet l&#39;expression du gène introduit et contourne la létalité observée lorsque les embryons électroporées sont autorisés à rester in vivo. Cette technique permet pour la manipulation de l&#39;expression des gè...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Leica </td><td> CM-1850 </td><td></td></tr><tr><td> Biologie pointe Dumoxel traitée DUMONT pince </td><td> Beaux-outils scientifiques </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mm MORIA cuillère perforée </td><td> Beaux-outils scientifiques </td><td> 10370-17 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 générateur de signaux carrés électroporation Vague </td><td> BTX (VWR) </td><td> 47745-928 </td><td></td></tr><tr><td> Harvard Apparatus 7 Tweezertrodes mm * Electrodes </td><td> BTX (Fisher) </td><td> BTX450165 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher Isotemp incubateur à CO 2 </td><td> Pêcheur </td><td> 1325525 </td><td></td></tr><tr><td> NAPCO CO 2 Régulateur de gaz </td><td> Pêcheur </td><td> 15497020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 plaques à puits de culture de tissus </td><td> BD Falcon (Fisher) </td><td> 877229 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone liquide médias DMEM/F-12 (1:1); Avec L-glutamine et HEPES; 500 ml </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3002301 </td><td></td></tr><tr><td> * HyClone donateurs sérum équin </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau foetal, qualifié, inactivé par la chaleur </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-063 </td><td></td></tr><tr><td> Cellgro * 10.000 UI de pénicilline, 10.000 pg / ml de streptomycine </td><td> Mediatech (Fisher) </td><td> MT-30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * L-Glutamine L-glutamine, 200mm en NaCl à 0,85% </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3003401 </td><td></td></tr><tr><td> Fast-Vert </td><td> Pêcheur </td><td> AC41053-0250 </td><td> 0,01% </td></tr></tbody></table>

in vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos

La lèvre rhombique est un neuroépithélium embryonnaire situé dans le cerveau postérieur à la jonction entre le tube neural et le roofplate du quatrième ventricule (commentaire dans 1). La lèvre rhombique peut être subdivisé en la lèvre supérieure rhombiques (URL), qui englobe une rhombomère (r1) et génère neurones du cervelet et la lèvre inférieure rhombiques (Fmin) qui donne lieu à diverses lignées tronc neuronales 2-4. Dérivés LRL comprennent des neurones auditifs du noyau cochléaire et ceux de l&#39;noyaux précérébelleux qui sont impliqués dans la régulation de l&#39;équilibre et de commande de moteur 5-8. Neurogenèse de la LRL se produit sur ​​une grande fenêtre temporelle qui englobe jours embryonnaires (E) de 9,5 à 16,5 5, 9. Différentes lignées neuronales sortir de la LRL que les cellules post-mitotiques (ou qui sont nés) au cours distincts jours de développement au cours de cette fenêtre neurogène. L&#39;électroporation de constructions d&#39;expression des gènes peut être utilisé pourmanipuler l&#39;expression des gènes dans les progéniteurs LRL et peut potentiellement changer le destin des neurones produits à partir de cette région 10-12. L&#39;expression des gènes Modification des progéniteurs LRL chez la souris via électroporation in utero a été couronnée de succès pour la manipulation de lignées nés le jour embryonnaire E12.5 ou plus tard, 10, 12-14. Dans électroporations in utero avant E12.5 ont échoué en raison principalement de la létalité associé à la perforation de la roofplate quatrième ventricule, une étape nécessaire dans la prestation de l&#39;ADN exogène qui est électroporation dans le LRL. Cependant, de nombreuses lignées dérivées LRL découlent de la LRL plus tôt que E12.5 9. Ces lignées tôt nés comprennent les neurones qui composent le réticulaire latéral, cunéiforme externe, et inférieure noyaux olivaires du système précérébelleux qui fonctionnent pour connecter les entrées de la moelle épinière et du cortex du cervelet 5. Dans le but de manipuler l&#39;expression dans le LRLd&#39;embryons âgés de moins de E12.5, nous avons développé un système in vitro dans lequel les embryons sont placés dans la culture à la suite d&#39;électroporation. Cette étude présente une méthode efficace et utile pour manipuler l&#39;expression des gènes des progéniteurs LRL à E11.5. Embryons électroporés avec la protéine fluorescente verte (GFP) entraînée par le promoteur CAG large actif reproductible exprimé la GFP après 24 heures de culture. Un aspect essentiel de cet essai est que l&#39;expression des gènes ne sont modifiées en raison de l&#39;expression du gène exogène et non à cause des effets secondaires qui résultent de l&#39;électroporation et les techniques de culture. Il a été déterminé que les modèles endogènes d&#39;expression des gènes ne sont pas perturbés dans des embryons de électroporées et cultivé. Ce test peut être utilisé pour modifier le destin des cellules issues de la LRL d&#39;embryons âgés de moins de E12.5 grâce à l&#39;introduction de plasmides pour la surexpression ou d&#39;assommer (par ARNi) de différents pro-des facteurs de transcription neuronaux.

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In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

Cette étude décrit le développement d&#39;un<em&gt; In vitro</emTechnique d&#39;électroporation&gt; qui permet pour la manipulation de l&#39;expression des gènes dans la lèvre inférieure en losange d&#39;embryons midgestation.

En électroporation in vitro de la lèvre inférieure rhombique d&#39;embryons de souris Midgestation

The rhombic lip is an embryonic neuroepithelium located in the hindbrain at the junction between the neural tube and the roofplate of the fourth ventricle ...

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Research

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Neuroscience

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

10.3K vues.  University of Illinois at Springfield. Cette étude décrit le développement d'un In vitro

Vidéo: In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Neurosciences

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Quantifier l&#39;activité des Cis Éléments de la réglementation-dans la rétine de souris par électroporation explantation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transfert de gènes à l&#39;oreille de souris en développement intérieur par<em&gt; In Vivo</em&gt; Électroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.