Double électroporation in utero est une méthode puissante pour étudier les aspects importants de la corticogenèse des mammifères tels que l’interaction entre les cellules des neurones, généré à différents endroits et âges de développement. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’examiner les interactions non perturbées entre ces différentes populations cellulaires d’une manière rapide, détaillée et peu coûteuse. Une implication frappante de notre méthode est qu’elle facilite une meilleure compréhension de la façon dont notre câblage est modifié dans les troubles neuronaux comme l’autisme et la schizophrénie.
Cette étude n’est pas limitée au néocortex, mais elle peut également être utilisée pour analyser les interactions cellule à cellule, dans les zones exocortico comme le sépale ou le cervelet. L’une des étapes les plus difficiles est l’injection d’ADN dans les ventricules latéraux des embryons précoces. L’utilisation d’une source de lumière vive est essentielle pour réussir les injections.
Pour chaque chirurgie d’abord préparer une solution de 10 microlitres contenant un microlitre de colorant vert rapide, un microgramme par microlitre solution d’ADN plasmide d’intérêt pour chaque plasmide, et le volume approprié sur endotoxine tampon TE libre. Et préchargez une pipette microcapillaire en verre avec la solution d’ADN préparée appropriée. Pour la première chirurgie d’électroporation in utero, appliquez de l’onguent sur les yeux d’une souris enceinte anesthésiée à temps approprié et utilisez un rasoir pour raser l’abdomen.
Désinfecter la peau exposée deux fois avec des lingettes séquentielles à 70 % d’éthanol et d’iode avant de procéder à l’incision sur le côté droit de l’abdomen. Une fois que l’utérus est accessible utiliser des forceps anneau pour extraire soigneusement l’organe. À l’aide d’un tube d’aspirateur contrôlé par la bouche, injecter environ 0,5 microlitres de solution dans le ventricule latéral de l’hémisphère gauche des embryons E11.5 pour la stratégie A.Or dans le ventricule latéral de l’hémisphère droit des embryons E13,5 pour la stratégie B, jusqu’à ce que le colorant vert rapide soit visible à l’intérieur du ventricule.
Lorsque toute la solution a été injectée, placez les électrodes de platine de type forceps latéralement autour de la tête des embryons injectés, avec le pôle positif orienté vers la paroi médiale pour cibler l’ourlet cortical pour la stratégie A, ou orienté vers le cortex latéral pour la stratégie B, en prenant soin d’éviter le cœur et le placenta. Utilisez un électroporater à ondes carrées pour appliquer la séquence appropriée d’impulsions électriques pour chaque âge embryonnaire, comme indiqué dans le tableau. Lorsque tous les embryons ont été injectés et électroporés, utilisez des forceps pour retourner soigneusement l’utérus dans la cavité abdominale et remplir l’abdomen d’une solution saline chaude.
À l’aide d’une suture 6-0 à l’aiguille, fermez la paroi abdominale et fermez soigneusement l’incision cutanée. Ensuite, retournez l’animal dans sa cage d’origine avec surveillance jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement. Deux jours après la chirurgie initiale, confirmer que la souris présente un comportement normal, et ne présente aucun signe de douleur ou de détresse.
Avant de préparer l’animal pour la deuxième électroporation in utero comme il vient de le démontrer. Injecter 0,5 microlitres de la solution d’ADN désirée dans le ventricule latéral gauche du cerveau des embryons E13.5 pour la stratégie A, et dans le ventricule latéral gauche du cerveau des embryons E15.5 pour la stratégie B.Après chaque injection, placez les électrodes avec le pôle positif orienté vers le cortex latéral de l’hémisphère injecté pour la stratégie A et la stratégie B.Et électroporer les embryons comme indiqué dans le tableau. Lorsque l’électroporation est terminée, retourner l’utérus à la cavité abdominale, et terminer la chirurgie et les soins post-chirurgicaux comme démontré.
Lors de la mise en œuvre de la stratégie A, quatre jours après la deuxième électroporation, récolter l’utérus du jour embryonnaire 17,5 souris femelle enceinte dans une boîte de Pétri de PBS sur la glace. Et utilisez des pinces à épiler pour transférer les embryons dans un nouveau plat de PBS sous un microscope disséquant. À l’aide de forceps, saisir soigneusement la tête de chaque embryon pour faciliter l’ablation de la peau sur la tête et le crâne.
Utilisez des forceps ou une spatule pour soulever les cerveaux exposés. Ensuite, utilisez une cuillère pour transférer chaque cerveau dans des puits individuels d’une plaque de puits de 48 contenant environ 600 microlitres de solution fixative par puits. Lorsque tous les cerveaux ont été recueillis, fixer le cerveau à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker orbital, suivie de trois lavages de dix minutes dans PBS.
Après le dernier lavage, intégrer le cerveau dans 4% faible point de fusion agarose dans PBS pendant environ dix minutes. Après que l’agarose se soit solidifiée, utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer chaque cerveau à un support de tissu vibratoire côté ampoule olfactive vers le haut. Placez le support à l’intérieur du récipient vibratome et remplissez le récipient de PBS.
Ensuite, utilisez le vibratome et une brosse pour obtenir 100 micromètres d’épaisseur sections de série coronale. Transfert d’un jusqu’à sept sections par puits et de six puits par embryon, dans une nouvelle plaque de puits de 48 contenant 600 microlitres par puits de PBS frais, complétée par des agents de conservation antifongiques au fur et à mesure qu’ils sont recueillis. Lorsque toutes les sections ont été acquises, utilisez une brosse fine pour monter chaque section sur une lame de microscope en verre, et couvrez-les d’un couvercle en verre pour évaluer l’efficacité de l’électroporation sur un microscope à épifluorescence verticale.
Lors de la mise en œuvre de la stratégie B, le jour postnatal 15, après avoir confirmé un manque de réponse au topinch, fixer la souris dans la position supine, et utiliser des ciseaux pour faire une incision de la peau midline pour exposer la cage thoracique et le diaphragme, et couper le diaphragme pour accéder au cœur. À l’aide de ciseaux fins, faire une incision dans l’oreillette droite et utiliser une aiguille de 25 gages reliée à un tube flexible à une pompe de perfusion périssaltique pour pénétrer dans le ventricule gauche. Lorsque l’aiguille est en place, livrer au moins 25 millilitres de 4% de paraformaldéhyde par perfusion transcardique, à un flux constant à 5,5 millilitres par minute.
Après environ cinq minutes, arrêter la perfusion, et utiliser des ciseaux pour enlever la peau sur la tête. Retirez le crâne et utilisez une spatule pour enlever le tissu cérébral. Placez le cerveau dans un puits d’une plaque de puits de 24 contenant 1,5 millilitres de paraformaldéhyde frais de 4 %, pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius sur un shaker orbital.
Puis acquérir 40 sections de micromètres du cerveau postnatal comme vient de le démontrer. Pour l’imagerie embryonnaire et postnatale des tranches cérébrales, placez les diapositives contenant les sections cérébrales montées d’intérêt sur un porte-diapositives au microscope. Introduisez le porte-curseur dans le microscope confocal et sélectionnez le canal approprié pour les fluorofores utilisés dans l’expérience.
Effectuez le balayage d’échantillon pour obtenir des images de carte de chaque section de cerveau à deux longueurs d’onde différentes pour une vue générale de la sortie double d’électroporation. Une fois terminé, sélectionnez l’objectif 10x, dans le mode d’observation multi-zone Z-stack time lapse. Dans chacune des régions XY sélectionnées, définissez les périmètres d’imagerie appropriés ainsi que la profondeur de la numérisation le long de l’axe Z selon les plans de l’échantillon, dans lesquels la fluorescence est visible.
Obtenez des images à faible grossissement de toutes les régions choisies et exportez les images de l’OIF au format TIFF dans le logiciel de visionneuse au microscope. Sélectionnez ensuite l’objectif 60x et capturez des images à grossissement élevé comme nous venons de le démontrer, afin d’observer les interactions cellule à cellule à un niveau plus détaillé. L’écart temporel entre les chirurgies d’électroporation in utero double permet aux cellules torésiales CAG ciblées le jour embryonnaire 11,5 dans l’un de ses lieux d’origine d’atteindre la zone marginale du néocortex latéral, y compris la zone somatosensory, à temps pour établir des contacts avec les neurones de projection corticale, étiquetés le jour embryonnaire 13,5.
Les principaux processus des neurones de projection exprimant GFP amélioré abondamment uprise dans la zone marginale du cortex, et se mêlent aux processus de M-cherry exprimant les cellules cataretziales. L’électroporation in utero au jour embryonnaire 13.5, utilisant un plasmide exprimant BFP facilite l’étiquetage des neurones de projection à travers différentes couches corticales. Une deuxième électroporation du côté contralatéral du jour embryonnaire 15,5 cible la sous-population des neurones de projection callosale de la couche supérieure, mais pas les neurones de projection de la couche inférieure qui se développent aux stades antérieurs.
Les neurones ciblés de la couche supérieure étendent leurs axones à l’hémisphère contralatéral, avec le modèle caractéristique d’arborisation. Le grossissement élevé permet une visualisation plus détaillée de l’innervation callosale d’axone des neurones de projection ciblés dans l’hémisphère contralatéral. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de planifier le moment de l’électroporation, l’hémisphère à injecter, et la position des électrodes en fonction des populations cellulaires à cibler.
Suivant cette procédure toutes les méthodes, telles que l’électroporation est la plus intéressante. Pour les deux types de cellules peuvent être effectuées pour étudier les modifications possibles du circuit in vivo. En utilisant cette technique, il est possible d’étudier les interactions fines entre deux cellules ciblées différentes.
Y compris de nouvelles informations scientifiques in vivo, par l’électroporation des protéines synaptiques fluorescentes.
