Ce travail a été soutenu par le Centre pour les thérapies régénératrices, de la Faculté de médecine de l&#39;université technique de Dresde, et la DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 sous-projet). BA a été soutenue par une bourse du programme DIGS-BB, Dresde. Nous remercions les Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie, et Ravi Jagasia pour obtenir des conseils précieux lors de la mise en place d&#39;électroporation in utero et stéréotaxique injection virale.

Note préliminaire La chirurgie doit être réalisée par des enquêteurs formés intégralement sur l&#39;approbation des autorités locales pour le bien-être animal. Toutes les précautions doivent être prises pour minimiser la douleur et le stress infligé aux animaux, y compris une anesthésie profonde, l&#39;administration de l&#39;analgésie postopératoire et, pour les opérations qui durent plus de 10 minutes, l&#39;application d&#39;un lubrifiant oculaire pour prévenir la déshydratation de la cornée et la cécité. Souris anesthésiées doivent être constamment tenus au chaud à 37 ° C jusqu&#39;à la guérison complète et tous les outils chirurgicaux et la solution doit être stérile. Bien que l&#39;utilisation d&#39;une hotte biologique n&#39;est pas strictement nécessaire, l&#39;exploitant doit prendre toutes les précautions raisonnables pour réduire au minimum la possibilité d&#39;infecter l&#39;animal lors de l&#39;opération par le port d&#39;une blouse, un masque et des gants. De même, à chaque étape concernant la production et l&#39;utilisation de virus doit être autorisée et doit être exécuté dans les zones S2 selon les prescriptions des autorités locales.Enfin, une décontamination approfondie de tous les outils et les surfaces qui auraient pu être en contact avec des virus doit être effectuée conformément aux pratiques de désinfection des installations agréées (pour le VIH en les essuyant avec 70% Et-OH et / ou autoclave). Partie 1: Expansion des embryonnaire NSC 1. Dans électroporation in utero <ol><li> Après le clonage des transgènes (c.-à cdk4/cyclinD1) dans PCMS-EGFP (Clontech) ou PDSV-mRFPnls vecteurs 16, purifier les plasmides en utilisant Endofree kit et remettre en suspension dans du PBS stérile à une concentration de 3-5 pg / pl. Peu de temps avant la chirurgie, mélanger les plasmides avec 0,05% FastGreen dans du PBS à un ratio final de ca. 04:04:01 et centrifuger le mélange pendant 2 min à 16000 xg pour éliminer tout précipité. </li><li> Chargez le mélange d&#39;ADN dans un verre borosilicate déjà tiré capillaire. Tirer les paramètres à l&#39;aide d&#39;une pipette P-97 extracteur sont: traction: 200; vel: 140; durée: 140. La chaleur est donnée par un test de rampe et dépend de la spécificationbeaucoup ific des capillaires utilisés. Montez le capillaire sur le bout de la PicoPump qui est proche de la plate-forme dans électroporation in utero (figure 1A) et, sous un stéréomicroscope, plier sa pointe et nick il au point d&#39;inflexion. </li><li> Stériliser tous les outils de chirurgie dans un stérilisateur à billes de verre sec et profondément anesthésier une souris enceinte au jour 12-15 de la gestation à l&#39;aide d&#39;un vaporisateur d&#39;isoflurane. Placez l&#39;animal en décubitus dorsal sur une plate-forme de chauffage réglé à 37 ° C et à l&#39;isoflurane sous administration constante à travers un cône de nez. </li><li> Raser la peau de l&#39;abdomen, désinfectez-les avec de multiples fois Betaisodona, éventuellement essuyer entre les deux avec 70% d&#39;éthanol, et injecter la buprénorphine (dilué dans du PBS) par voie sous cutanée à raison de 0,1 mg / kg la concentration en préventive analgésique. L&#39;aide de ciseaux fins, faire une coupe longitudinale 2 cm de la peau et, par la suite, de la paroi musculaire sous-jacent pour accéder à la cavité péritonéale. Verser dans le ca cavité péritonéale. 2ml de solution IUE (D-PBS contenant 100 U / ml de pénicilline / streptomycine) préchauffé à 37 ° C et maintenir la solution sur un bloc chauffant. </li><li> Couvrir la souris avec drap stérile contenant une fissure à partir de laquelle l&#39;utérus sera supprimé. Rentrer l&#39;incision à l&#39;aide d&#39;un écarteur de tungstène, d&#39;identifier l&#39;utérus et le sortir en le tenant avec une pince entre les embryons adjacentes (figure 1B, à gauche), et enfin il se coucha sur le drap stérile. Pendant toute l&#39;opération, rincez l&#39;utérus avec une solution IUE pour hydrater la cavité d&#39;organes et du corps et de prévenir la déshydratation de l&#39;animal. </li><li> Manipulez soigneusement l&#39;utérus en le tenant entre le pouce et l&#39;index et tourner un embryon jusqu&#39;à sa tête est visible et orienté vers l&#39;opérateur. Identifier les hémisphères télencéphaliques et injecter un d&#39;entre eux du côté dorso-latéral. Relâchez 1-2 pi de la solution d&#39;ADN à l&#39;aide de la pédale d&#39;un PicoPump jusqu&#39;à ce que le ventricule est décrit par FastGreen (figure 1B, à droite). </li><li&gt; Lieu de l&#39;anode des électrodes placées sur le site d&#39;injection et la cathode du côté controlatéral (figure 1C) et d&#39;offrir 6 impulsions de 30 V pendant 50 ms à 950 ms d&#39;intervalle entre chaque impulsion en utilisant un électroporateur générer de forme carrée champs électriques exploités grâce à une pédale. Éviter de placer les électrodes près de la barrière placentaire, car cela pourrait provoquer une hémorragie et des lésions de l&#39;embryon. </li><li> Lorsque tous les embryons sont injectés et électroporation, placez l&#39;utérus dans la cavité abdominale et à proximité des parois musculaires avec une chaîne de suture suturer tous les 3-4 mm. Les nœuds doivent être bien ajustées au muscle mais pas trop serré pour permettre un peu de gonflement des tissus. Enfin, fermez la peau recouvrant l&#39;aide de pinces métalliques. Désinfecter la peau avec Betaisodona, retirez la souris à partir du masque de l&#39;isoflurane et le transférer dans une cage de logement lorsqu&#39;il est complètement éveillé. Surveiller le rétablissement de la souris jusqu&#39;à ce que le comportement locomoteur est normal. </li></ol> 2. Traitement de l&#39;échanexemple <ol><li> Un ou plusieurs jours après l&#39;électroporation, le sacrifice de la souris, la collecte des embryons et d&#39;identifier ceux correctement électroporation en utilisant un stéréomicroscope fluorescent (figure 1D). Disséquer les cerveaux sur PBS glacé, et les fixer nuit à 4% PFA (paraformaldéhyde dans du tampon phosphate pH 7,4). Finalement, BrdU peut être administré avant le sacrifice selon des paradigmes différents pour étudier la cinétique du cycle cellulaire et 3 prolifération cellulaire. </li><li> Les cerveaux sont ensuite traitées pour la coupe et l&#39;immunomarquage pour les plusieurs marqueurs de cellules gliales radiales, les progéniteurs basales et les neurones (Pax6, la nestine, tbr2, TBR1, Tuj1 etc) pour évaluer l&#39;effet des transgènes fonctionnels sur ciblé NSC et leurs descendants qui sont identifiée par l&#39;expression du gène rapporteur co-électroporation. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1.Électroporation in utero. (A) Représentation schématique d&#39;une plate-forme de électroporation in utero. (B) Les dessins indiquant la position de la souris enceinte pendant la chirurgie (à droite) et l&#39;injection du mélange ADN / FastGreen (bleu) dans l&#39;hémisphère télencéphalique d&#39;un embryon de souris (à gauche). (C) Schéma montrant le placement des électrodes en contact avec les parois de l&#39;utérus avec l&#39;anode (+) adjacent au site d&#39;injection (bleu). Les flèches indiquent la migration de l&#39;ADN vers l&#39;anode. (D) Image d&#39;un embryon de souris 24 heures après l&#39;électroporation avec des plasmides GFP au jour embryonnaire 13. La ligne pointillée délimite l&#39;hémisphère télencéphalique. Un régime en modifiées de Calegari et al., 2004 17. Partie 2: Expansion des adultes NSC 1. Production de VIH-particules virales issues <ol><li> Jour 1: plaque de 5 x 10 6 cellules 293T sur un 10 cmplat avec 8 ml de D-MEM contenant 10% de sérum inactivé de la chaleur de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine (milieu de culture). Utilisez 15 plats pour une préparation virale et culture d&#39;une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Jour 2: pour chaque plat, diluer dans 1 ml de plaine D-MEM 5 ug de chacune des 3 plasmides codant pour i) la protéine VSVG enveloppe (type de virus de la stomatite vésiculaire G), ii) gag / pol (antigène spécifique de groupe / polymérase) et iii) un polycistronique construction exprimant les transgènes et fonctionnels (par exemple reporter cdk4/cyclinD1/GFP) précédemment clonés dans un vecteur de transfert à base de VIH (p6NST90) 9. Mélanger cette solution avec 1 ml de D-MEM contenant 45 ul de polyéthylènimine qui a été préalablement dissous dans du PBS à 1 mg / ml de solution mère, et incuber pendant 15-30 min à température ambiante. Pendant ce temps, retirez le support des cellules et ajouter 4 ml par boîte de frais D-MEM contenant 15% de sérum inactivé chaleur de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine. Ajouter au m 2l de mélange de transfection et la nuit de la culture. </li><li> Jour 3: ajouter 120 ul de 500 mM de Na-butyrate par plat d&#39;améliorer l&#39;expression des transgènes, mélanger délicatement et la culture pendant 6-8 heures, après quoi remplacer le milieu de transfection avec 5 ml de milieu de culture. </li><li> Jour 4: recueillir les surnageants (environ 70 ml au total), passer à travers un filtre de 0,22 um et le transfert en 2 tubes à centrifuger polyallomère (35 x 89 mm). Ultracentrifugeuse à 110.000 xg pendant 90 min à 4 ° C en utilisant un rotor swing. Jeter le surnageant, ajouter 6 ml de PBS dans chaque tube et incuber sur de la glace pendant 1 heure. Reprendre le culot et le transférer dans un tube à centrifuger polyallomère (14 x 95 mm). Ultracentrifugeuse à 110.000 xg pendant 90 min à 4 ° C en utilisant un rotor swing. Jeter le surnageant, resuspendre le culot dans 50 ul de PBS, faire 5 aliquotes et conserver à -80 ° C. Titre viral est de l&#39;ordre de 10 8 -10 9 CFU / ml. (Remarque: les virus sont très sensibles à la température et le stockage, avoIdentifiant re-congélation, garder sur la glace sèche pendant le transport et décongeler rapidement avant de l&#39;utiliser.) </li></ol> 2. Injection stéréotaxique <ol><li> Anesthésier une souris 6-10 semaines à l&#39;isoflurane et placer l&#39;animal en décubitus ventral sur un cadre stéréotaxique (figure 2A) à l&#39;aide des barres d&#39;oreilles et la bouche d&#39;appui pour bien fixer la tête. L&#39;animal est gardé au chaud sur un coussin chauffant réglé à 37 ° C et sous administration isoflurane constante. </li><li> Injecter par voie sous cutanée 100 pl de solution buprénorphine travailler comme analgésique préventif, de se raser une bande de peau sur la tête de la souris, et désinfecter comme décrit en 1.4. Avec un scalpel, faire un ca. 1,5 cm de long incision longitudinale sur la peau du crâne tête d&#39;exposition au niveau de la suture sagittale. Rétracter la peau et nettoyez doucement la surface de l&#39;os avec un coton-tige stérile. </li><li> Remplir à moitié un verre capillaire (spécifications 1.2) avec de l&#39;huile de paraffine et le monter sur la pompe d&#39;injection insertionle capillaire jusqu&#39;à la seconde bague (figure 2B). Déplacer le support de tube capillaire dans l&#39;axe x, y et z jusqu&#39;à ce que la pointe du capillaire est positionné sur le bregma, le point de liaison entre les fils de suture sagittale et latérale (figure 2C) (à déterminer à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope), et re-ensemble x, y, et z de 0. </li><li> Déplacer le capillaire de ± 1,6 mm dans l&#39;axe médio-latéral (x) et -1,9 mm dans l&#39;axe antéro-postérieur (y) et marquer l&#39;os à l&#39;aide d&#39;un stylo marqueur chirurgical. Faire un trou d&#39;env. 0,5 mm de diamètre sur le crâne à l&#39;aide d&#39;une perceuse électrique veillant à ne pas endommager le cerveau. </li><li> Mettez une goutte de 5 ul de la suspension virale (1 aliquote) sur un morceau de parafilm placé sur les barres d&#39;oreilles et plonger la pointe du capillaire dans la gouttelette. Sucer ca. 3,5 pl de suspension virale à l&#39;aide d&#39;un injecteur nanolitre fixé à 55 nl / sec. Exécutez cette étape rapidement que la goutte s&#39;évapore. </li><li> Déplacez le capillaire à l&#39;emplacement oinjection f et vers le bas jusqu&#39;à ce que la pointe touche la surface de la pie-mère. Réinitialiser la valeur de l&#39;axe dorso-ventral (z) à 0. À ce stade, pénétrer dans le tissu avec le capillaire de -1,9 mm et relâchez 1,5 ul de la suspension virale à un taux de 4 nl / sec. Attendre 2-3 minutes pour minimiser le reflux de l&#39;auge suspension virale de la piste capillaire et puis rentrer le capillaire. Une deuxième injection peut être effectuée dans l&#39;hémisphère controlatéral. </li><li> Suturer la peau, désinfecter et permettre à l&#39;animal de se remettre de l&#39;anesthésie comme décrit précédemment pour l&#39;électroporation in utero (1,8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Stéréotaxique injection virale. (A et B) Représentation schématique des composants nécessaires pour effectuer l&#39;injection stéréotaxique (A) et un support démonté capillaire montrant l&#39;insertion d&#39;un capillary jusqu&#39;à ce que le second anneau (B). (C) Image de la tête de la souris immobilisé par les barres d&#39;oreilles et un soutien palais avec la peau coupée à exposer le crâne (à gauche). Le grossissement de la zone en pointillés (à droite) montre les sutures latérales et sagittales, le bregma, et le site d&#39;injection (cercle). 3. Traitement de l&#39;échantillon <ol><li> Une à trois semaines après l&#39;infection, perfuser la souris avec ca. 100 ml de PFA à 4%, disséquer le cerveau et post-fix it la nuit à 4% PFA. Finalement, BrdU et / ou le tamoxifène peut être administré avant le sacrifice selon des paradigmes différents pour étudier la cinétique du cycle cellulaire et de cesser de l&#39;expression des transgènes viraux flanqués par des sites loxP, respectivement 9. </li><li> Le cerveau peut alors être traitée pour immunocoloration en utilisant plusieurs marqueurs de cellules souches et progéniteurs et les neurones (par exemple Sox2, GFAP, la nestine, tbr2, doublecortine, etc.) </li></ol>

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

BA et FC ont déposé une demande de brevet décrivant l&#39;expansion conditionnelle des cellules souches somatiques adultes par cdk4/cyclinD1 virus (EP 10160288.6).

Une étape cruciale pour électroporation in utero est la qualité et la pureté de l&#39;ADN depuis sa migration directionnelle lors de la livraison des champs électriques dépend de sa charge. Les protocoles de purification de l&#39;ADN qui ne comprennent pas l&#39;élimination des autres molécules chargées, tels que les endotoxines, peuvent conduire à l&#39;masquage des charges d&#39;ADN naturels négatifs conduisant à une mauvaise prestation. De toute évidence, toucher les parois utérines avec les électrodes aussi près que possible de la zone à cibler permettra d&#39;améliorer l&#39;efficacité d&#39;électroporation. Tout aussi important est la qualité des électrodes utilisées depuis ce qui est fondamental pour la livraison de champs électriques optimales. Les micro-rayures même pas visibles à l&#39;œil nu et / ou des résidus organiques, tels que des traces de sérum, de lipides, et ainsi de suite, inévitablement s&#39;accumulent avec le temps conduisant à des électrodes perdent leurs propriétés. Electropes anciens et / ou sales sont la cause la plus probable d&#39;une baisse soudaine de l&#39;efficacité d&#39;électroporation et, par conséquent, devrait être replaced dès que cela est remarqué. Bien que relativement simple, électroporation in utero nécessite généralement quelques semaines de formation afin d&#39;atteindre de manière satisfaisante et des résultats reproductibles. Cette technique est très polyvalent car il peut être appliqué, pratiquement, à n&#39;importe quel organe et de tissus de l&#39;embryon en développement. Certes, les organes contenant une cavité, par exemple le cerveau, sont particulièrement faciles à cibler et permettre à une proportion élevée de cellules transfectées en raison de la facilité d&#39;injection d&#39;un volume relativement important de l&#39;ADN. Un problème fréquemment rencontré dans la mise en place stéréotaxique injection virale est d&#39;avoir quelques cellules infectées et / ou de cibler des zones indésirables. Le premier problème est essentiellement corrélée à l&#39;injection de faible titre de virus. Des cellules 293T avec diminution du nombre de passages en culture se développent plus rapidement et entraîner une hausse des titres viraux. En utilisant des cellules de plus de ca. 20 passages n&#39;est pas recommandée et les moyens de transfection avec moins de 80% d&#39;efficacité ne garantissent pas une bonneproduction virale. Remise en suspension du culot viral est également critique, la suspension virale doit comparaître massifs homogènes et virales qui pourraient obstruer les capillaires doivent être évités. Les virus sont très sensibles aux baisses de température et de stockage à long terme. Pour ces raisons, des aliquotes doivent être stockés de façon permanente à -80 ° C et ne peut pas être recongelé. Même dans ces conditions, une diminution de l&#39;infectiosité a pu être observée après 6-12 mois de stockage. Dans les phases d&#39;apprentissage, nous vous conseillons de tester le titre viral de chaque préparation virale et de le faire à nouveau après un stockage à long terme. La présence de cellules infectées dans les zones indésirables du cerveau peut dépendre d&#39;un positionnement sous-optimale de la tête de la souris sur le cadre stéréotaxique, ce qui nécessite un peu de pratique. En outre, il est essentiel de ne pas endommager la surface du cerveau, tout en ouvrant le trou sur le crâne parce que sinon il ne sera pas possible de réinitialiser le 0 correctement sur la surface de la pie-mère, résultant de l&#39;injection imprécis. Les coordonnéesque nous avons fourni dans ce protocole sont appelés C57/BL6 6-10 femelles semaines et nous vous suggérons de les optimiser pour la souche différente / âge / sexe. L&#39;acquisition de cette technique peut exiger plus de temps que électroporation in utero due aux phases plus nécessaires pour préparer les virus et analyser les échantillons. Nous recommandons fortement que les virus ne sont utilisés après la chirurgie de la souris et injection stéréotaxique sont devenus fiable et reproductible. La première étape pour atteindre cet objectif est d&#39;injecter les colorants ADN de cellules infiltrant, comme Hoechst 33342, chez les souris euthanasiées et d&#39;analyser les cerveaux immédiatement. Électroporation in utero et stéréotaxique injection virale sont deux systèmes puissants et aux aiguë du tissu-spécifique de manipuler l&#39;expression des gènes dans le SNC au cours du développement chez les mammifères et l&#39;âge adulte. En dépit de leur limitation dans le ciblage seulement une sous-population de cellules, ces systèmes fournissent une vitesse sans précédent et la facilité par rapport à des méthodes plus conventionnelles, in particulier la génération laborieuse et prend du temps de souris transgéniques. Pourtant, malgré cette similitude, il existe plusieurs différences entre les deux techniques qui méritent d&#39;être mentionnées. Tout d&#39;abord, en ce qui concerne le ciblage des différents types de cellules, électroporation in utero conduit d&#39;abord à la transfection de cellules souches appropriées (également appelés cellules gliales radiales) car ce sont les seules cellules délimitant le ventricule où l&#39;ADN est injecté. À la suite de la division cellulaire, les plasmides seront ensuite hérité de cibles, les cellules souches-mères à leur progéniteur et / ou des cellules filles neuronales conduisant à la redistribution des cellules transfectées dans le cortex en fonction du temps. En revanche, l&#39;utilisation de lentivirus VIH dans le cerveau adulte conduit à l&#39;infection simultanée de n&#39;importe quel type de cellules dont les cellules souches, les progéniteurs des neurones, ainsi que les cellules gliales matures. Il convient de noter, en ce qui concerne l&#39;utilisation des lentivirus VIH par opposition aux rétrovirus les plus couramment utilisés sont le faitque l&#39;intégration se produirait lentiviral indépendamment de l&#39;état mitotique de cellules, permettant ainsi le ciblage aussi des adultes, des cellules souches quiescentes. D&#39;autre part, une autre différence importante entre l&#39;électroporation et l&#39;infection virale est celle d&#39;un transitoire, l&#39;expression épisomique est atteint par le premier par rapport à l&#39;intégration irréversible de l&#39;ADN dans le génome des cellules infectées obtenus par celui-ci. À la suite de divisions cellulaires consécutives, la dilution des plasmides électroporation, et la dégradation des protéines extra-utérine cyclinD1, il s&#39;ensuivrait à chaque cycle cellulaire. Ainsi, l&#39;expansion du NSC au cours du développement embryonnaire a été démontré que pendant environ deux jours 15 tandis que dans le cerveau adulte cet effet a été constaté que dure plusieurs mois (résultats non publiés). Troisièmement, étant donné i) cdk4/cyclinD1 a un effet sur les cellules ayant une plus longue G1 et ii) commis progéniteurs neuronaux au cours du développement ont un cycle cellulaire plusque les cellules souches alors que l&#39;inverse est vrai à l&#39;âge adulte, nos deux manipulations ont été trouvés pour déclencher l&#39;expansion, principalement, des progéniteurs neuronaux au cours du développement des cellules souches et à l&#39;âge adulte. Dans les deux cas une augmentation de neurones ont été réalisés par les deux méthodes. Quatrièmement, l&#39;injection virale peut facilement être réalisé, de manière fiable et reproductible, dans de nombreuses régions du cerveau adulte en changeant simplement les coordonnées stéréotaxiques. En revanche, le ciblage précis de certaines régions du système nerveux central, comme le tronc cérébral, la formation hippocampique, ou la moelle épinière, par électroporation in utero peut-être plus difficile à réaliser de façon reproductible. En outre, tandis que l&#39;injection stéréotaxique peut être réalisée sur des souris de tout âge, des performances optimales de électroporation in utero est limitée d&#39;environ E11 à E16. Étapes préalables à E11, il faudrait soit l&#39;utilisation d&#39;un microscope à rétrodiffusion ultrasonore 18,19 ou un culte embryons entierssystème ure 17,20. Récemment, un intérêt croissant pour la biologie cellulaire fondamentale des cellules souches somatiques a été promu parce que leur étude et la manipulation sont considérées comme fondamentale pour le développement de nouveaux traitements cellulaires régénératives. En particulier pour la surexpression de cdk4/cyclinD1, notre protocole fournit les moyens pour augmenter transitoirement la dilatation de NSC in vivo (figure 3B et 4B et C et C) afin d&#39;augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau adulte. Nous croyons que ces manipulations peuvent être importantes dans un certain nombre de contextes différents afin de mieux comprendre le rôle du CCS dans le développement du cerveau, l&#39;évolution et l&#39;homéostasie, ainsi que leur contribution à la fonction cognitive ou la récupération de la dégénérescence neuronale ou des blessures.

<table border="1"><tbody><tr><td> Matériel / équipement </td><td> Fournisseur </td><td> Catalogue </td><td></td></tr><tr><td> Kit Endofree maxi plasmide </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / Brown pipette extracteur </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate capillaires à filament </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tableau super système d&#39;anesthésie des animaux de laboratoire </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germoir en verre de 500 stérilisateur à billes </td><td> Southpointe chirurgicale </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Pince à iris </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Solution Betaisodona </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Pompe Pico </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 électroporateur onde carrée </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> Électrodes rondes tweezer </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Matériel de suture </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> RéflexePince à clips pour la fermeture des plaies </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Solution injectable Temgesic </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> Fœtale Bovin Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture tissulaire </td><td> Faucon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polyéthylènimine 250 ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> n-butyrique, sel de sodium </td><td> Sigma </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Tube, à paroi mince, polyallomère </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Modèle 900 petit instrument stéréotaxique animaux </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope OPMI pico </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-MICRO4 contrôleur et Nanoliter2000 injecteur </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Verre de remplacement 3,5 nanolitre </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR exercice d&#39;application générale </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Anticorps </td><td> Fournisseur </td><td> Catalogue </td><td> Dilution </td></tr><tr><td> Doublecortine </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestine </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Table d&#39;anticorps. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Cellules souches somatiques peuvent se divisent pour produire des cellules souches supplémentaires (extension) ou des types cellulaires plus différenciés (différenciation), ce qui est fondamental pour la formation des tissus au cours du développement embryonnaire et l&#39;homéostasie tissulaire au cours de l&#39;âge adulte 1. Actuellement, de grands efforts sont investis pour la commande du commutateur de cellules souches somatiques de l&#39;expansion à la différenciation, car cela est considéré comme fondamental pour le développement de nouvelles stratégies de 1,2 médecine régénérative. Cependant, un défi majeur pour l&#39;étude et l&#39;utilisation des cellules souches somatiques, c&#39;est que leur expansion a été très difficile à contrôler. Ici, nous décrivons un système qui permet le contrôle de souches neurales / cellules progénitrices (mentionné comme NSC) l&#39;expansion dans le cortex embryonnaire de la souris ou l&#39;hippocampe adulte en manipulant l&#39;expression du complexe cdk4/cyclinD1, un régulateur majeur de la phase G1 du cycle cellulaire des cellules souches somatiques et différenciation 3,4. Plus précisément, deux approches différentes sont décrites par laquelle le complexe cdk4/cyclinD1 est surexprimé dans NSC in vivo. En première approche, la surexpression des régulateurs du cycle cellulaire est obtenue en injectant des plasmides codant pour cdk4/cyclinD1 dans la lumière du télencéphale de la souris suivie par électroporation in utero pour les livrer à NSC de la corticale latérale, par conséquent, le déclenchement de l&#39;expression épisomique transgènes 5-8. Par la seconde approche, fortement concentrés VIH virus dérivés sont stéréotaxique injecté dans le gyrus denté de l&#39;hippocampe de souris adultes, ainsi, déclenchant une expression constitutive des régulateurs du cycle cellulaire après intégration de la construction viral dans le génome des cellules infectées 9. Les deux approches, dont les principes de base ont déjà été décrites par des protocoles vidéo 10-14, d&#39;autres ont été ici optimisés pour i) réduire les dommages aux tissus, ii) des portions larges cibles du cerveau très spécifique regions, iii) obtenir un nombre élevé de cellules manipulées à l&#39;intérieur de chaque région, et iv) déclencher des niveaux élevés d&#39;expression de transgènes dans chaque cellule. Surexpression transitoire de transgènes à l&#39;aide des deux méthodes est obtenue par des moyens différents, à savoir en dilution naturelle des plasmides électroporées en raison de la division cellulaire ou le tamoxifène administration en exprimant Cre-NSC infectées par le virus portant cdk4/cyclinD1 flanqué par des sites loxP, respectivement 9,15 . Ces méthodes fournissent une plate-forme très puissante de façon aiguë et tissu-spécifique de manipuler l&#39;expression de n&#39;importe quel gène dans le cerveau de souris. En particulier, par la manipulation de l&#39;expression du complexe cdk4/cyclinD1, notre système permet le contrôle de l&#39;expansion temporelle NSC et leur passage à la différenciation, donc, en fin de compte l&#39;augmentation du nombre de neurones générés dans le cerveau des mammifères. Notre approche peut être d&#39;une importance capitale pour la recherche fondamentale et l&#39;utilisation de cellules souches somatiques pour la thérapiedu système nerveux central des mammifères, tout en offrant une meilleure compréhension de i) enrayer la contribution à la formation du tissu cellulaire au cours du développement, ii) l&#39;homéostasie tissulaire au cours de l&#39;âge adulte, iii) le rôle de la neurogenèse adulte dans les fonctions cognitives, et peut-être, iv) une meilleure utilisation somatique tige cellules dans des modèles de maladies neurodégénératives.

<ol><li> Dans l&#39;ensemble, électroporation in utero donne 60-80% des embryons électroporées affichent une forte expression du gène rapporteur dans une vaste zone du cortex latéral (figure 3A). Les protéines fluorescentes peuvent être facilement détectées sur des embryons entiers de montage dès que 3-6 heures après la chirurgie avec le signal d&#39;une durée supérieure à une semaine. Dans la zone ciblée, environ 30-50% des cellules expriment généralement le transgène (s) avec la proportion de cellules co-exprimant les deux (ou plusieurs) co-électroporation transgènes étant généralement supérieure à 90% (figure 3B, à gauche) 6,8 , 15. Même si un niveau minimal de l&#39;apoptose (environ 2,0-2,5%) a pu être observée au bout d&#39;environ 2 heures de l&#39;électroporation, cette valeur sera de retour à des niveaux physiologiques (ca. 0,5-1,0%) après environ 6 heures (FC, données non publiées). La proportion d&#39;embryons ou des souris enceintes meurent à cause de la chirurgie est généralement négligeable (&lt;5%). Co-électroporation avec cdk4/cyclinD1 dans ces conditions suivie par 48 heures de développement déclenche une augmentation de la dilatation de progéniteur neural de 30% (figure 3B, à droite, et C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. L&#39;expansion des progéniteurs neuronaux par cdk4/cyclinD1 surexpression. (A) image de fluorescence d&#39;une coupe à travers la corticale latérale d&#39;un embryon de souris 24 heures après électroporation avec des plasmides GFP et RFP à jour embryonnaire 13. (B) images fluorescentes comme dans un 48 heures après co-électroporation avec des plasmides cdk4/GFP et cyclinD1/RFP et immunomarquage pour le marqueur progéniteur basale tbr2. Rapporteurs fluorescents avec DAPI counterstainig (à gauche) et tbr2 (à droite) sont représentés. Lignes indique la surface apicale de la zone ventriculaire (VZ; ligne blanche) et les limites de la zone sous-ventriculaire (SVZ, jaune lignes pointillées). Notez l&#39;augmentation de thickness de la SVZ dans la partie électroporée du cortex (flèches blanches) en raison d&#39;une production accrue et l&#39;expansion des progéniteurs de base après la surexpression de cdk4/cyclinD1. (C) Quantification de l&#39;effet montré dans les bars B. = SD, p &lt;0,05, n = 3. Graphique à barres dans C est tiré de Lange et al., 2009 15. <ol start="2"><li> Après virale injection stéréotaxique, ca. 80% des souris fonctionnant afficher une forte expression des transgènes dans le gyrus denté entier. L&#39;expression constitutive de la GFP peut être facilement détecté sur 40 sections um dès 4 jours après la chirurgie. Long de l&#39;axe rostro-caudale à du gyrus denté, environ 10-30% des cellules (équivalent à un total d&#39;environ 10.000-30.000. Cellules) en général expriment le transgène (s) (figure 4A) 9. La proportion de souris meurent à cause de la chirurgie est négligeable (&lt;5%). Trois surexpression semaine de cdk4/cyclinD1 dans ces conditions provoque une augmentation de la CSN par plus de deuxplis (figure 4B) tout en diminuant la neurogenèse de 70% (figure 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Effets de l&#39;infection virale. (A) de reconstruction 3D de 7 images de fluorescence prises à partir de 40 um d&#39;épaisseur de série sections coronales (collecte de 1 toutes les 6) le long de l&#39;axe rostro-caudale à de l&#39;hippocampe. GFP + cellules infectées (vert) et DAPI coloration nucléaire (bleu) du gyrus denté sont présentés (en haut). Images en champ clair des coupes coronales correspondant à ceux représentés en A (au milieu) et de la représentation 3D (en bas) de tout l&#39;hémisphère cérébral avec l&#39;hippocampe surligné en vert pseudocouleur (modifié d&#39;après l&#39;Atlas Allen Brain; <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Les flèches blanches pointer du site d&#39;injection. Latérale (L), rostrale (R), et dorsal (D) des axes (x, y, et z les coordonnées stéréotaxiques) sont indiquées (à droite). (B et C) Proportion de la nestine + NSC (B) et DCX + nouveaux neurones (C) au sein de la population de cellules GFP + infectés 3 semaines après l&#39;injection stéréotaxique de la GFP (blanc) ou cdk4/cyclinD1/GFP (noir) virus. Bars = SD, p &lt;0,005, n = 3. Graphiques en B et C proviennent Artegiani et al., 2011.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Contrôle de l&#39;expansion des cellules souches somatiques est un facteur majeur qui pèse sur leurs études et leur utilisation en thérapie. Ici, nous décrivons un système à contrôler temporellement les cellules souches neurales l&#39;expansion au cours du développement et de l&#39;âge adulte, ce qui peut être utilisé pour augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau de souris.

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.6K vues.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. Contrôle de l'expansion des cellules souches somatiques est un facteur majeur qui pèse sur leurs études et leur utilisation en thérapie. Ici, nous décrivons un système à contrôler temporellement les cellules souches neurales l'expansion au cours du développement et de l'âge adulte, ce qui peut être utilisé pour augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau de souris.

Vidéo: Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

L&#39;isolement et expansion des cellules souches neurales de souris adultes utilisant le test Neurosphère

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Recherche

Neurosciences

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolement et culture de cellules de crêtes neurales de tube neural embryonnaire murin

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Génération de rats transgéniques par voie topique<em&gt; In utero</em&gt; L&#39;électroporation et<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence dépistage

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

In Vivo Reprogrammation directe des cellules gliales résidentes en interneurones par injection intracérébrale de vecteurs viraux

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

In Vivo Ciblage des cellules progénitrices neuronales dans le néocortex de Ferret par In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

Cultures organotypiques du cortex humain adulte comme modèle ex vivo pour la transplantation et la validation de cellules souches humaines

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...