Nous tenons à remercier le Dr George communes et le Dr Dean Vistnes pour leur soutien et la collaboration de nos recherches. Ce travail est soutenu par l&#39;Institut national de bourses de recherche dentaire et craniofaciale 1 R21 DE019274-01, RC2 et R01EB009689 DE020771-02, la Fondation Oak et Hagey Laboratoire de médecine régénérative de pédiatrie à MTL Dr Hyun est pris en charge par le Saint Joseph Mercy Hospital GME .

1. Isolement cellulaire et l&#39;expansion <ol><li> Tout le consentement du patient et des protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par l&#39;Université de Stanford institutionnel commission d&#39;examen (Protocole # 2188 et # 9999). </li><li> Obtenir humaine tissu adipeux sous-cutané des procédures électives lipoaspiration sous local / anesthésie générale. </li><li> Il y aura deux couches dans le lipoaspirate (figure 1A). Le surnageant contient la grande majorité de la matière traitée cellulaire. La couche inférieure est le plus souvent injecté une solution saline. Adipeuses cellules stromales peuvent être récoltées à partir de chaque couche, mais le rendement est beaucoup plus élevé dans le surnageant. </li><li> Pour isoler la fraction stroma vasculaire (SVF), laver abondamment avec de l&#39;lipoaspirate volumes égaux de 1X tampon phosphate salin (PBS) contenant 2,5% de bétadine (x2), suivi par un volume égal de PBS 1X (x1) sans bétadine. Laissez le lavage à précipiter. </li><li> Veillez à maintenir stérile technique tout au long du processus de la contamination avec les tissus humains transformés peut arriver. </li><li> Aspirer la couche de fond et jeter après chaque lavage. </li><li> Aliquote de 15 ml de tissu adipeux dans 50 ml tubes coniques Falcon BD. </li><li> Digérer le tissu adipeux avec un volume égal (15 ml) d&#39;eau filtrée 0,075% collagénase de type II dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 ° C dans un bain-marie pendant 60 min sous agitation constante (environ 180 secousses / min) - ventiler chaque tube toutes les 15 min. </li><li> Neutraliser l&#39;activité de l&#39;enzyme avec 15 ml de PBS contenant 10% (sérum de veau foetal) FBS, et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir une haute densité SVF granulés. Le culot sera un mélange de adipeuses cellules stromales et les érythrocytes. </li><li> Jeter le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Reprendre le culot dans 10 ml de milieu de culture traditionnels (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / FBS à 10% / 1% de pénicilline-streptomycine solution). </li><li> Filtrer suspension<html> sion à travers une passoire en nylon 100 um cellule pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Combinez 3 tubes dans un propre conique 50 ml. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Reprendre le culot dans 5 ml de milieu de culture traditionnels </li><li> Combinez deux 50 ml coniques, par une plaque de 10 cm ou cinq Coniques 50 ml pour une plaque 15 cm. </li><li> Mettre en place des cultures primaires pendant la nuit à 37 ° C/21% d&#39;O 2, 5% de CO 2. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, laver les assiettes abondamment avec du PBS pour éliminer résiduels non adhérentes globules rouges. Les populations de cellules adipeuses qui en résultent sont dérivées de cellules stromales. </li><li> Maintenir les cellules en sous-confluentes les niveaux pour prévenir la différenciation spontanée à 37 ° C/21% d&#39;O 2, 5% de CO 2 dans les milieux de croissance. Les cellules doivent généralement être divisés tous les trois à quatre jours dans un milieu de croissance réguliers lorsque étalées à 50% de confluence. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Préparation d&#39;échafaudage <ol><li> Les échafaudages ont été faites par le Dr Min Lee de l&#39;Université de Californie, Los Angeles - School of Dentistry. </li><li> Échafaudages ont été fabriquées à partir de PLGA 85/15 de poly (acide lactique-co-acide glycolique) (viscosité inhérente = 0,61 dl / g, Birmingham Polymers) par coulée en solvant et un processus de lessivage particulaire. </li><li> PLGA / chloroforme solutions ont été mélangées avec du saccharose 200-300 um de diamètre pour obtenir 92% (fraction volumique) la porosité et comprimé en feuilles minces dans un moule en téflon. </li><li> Après lyophilisation du jour au lendemain, les échafaudages ont été immergés dans trois changements de bidistillée (dd) H 2 O pour dissoudre le saccharose, et doucement retiré de la plaque en téflon avec une spatule fine pointe. </li><li> Après le lessivage de particules, tous les échafaudages ont été désinfectés par immersion dans 50%, 60% et 70% d&#39;éthanol pendant 30 minutes chacun, suivis par trois rinçages de ddH 2 O. </li><li> Tous les échafaudages ont été séchés sous une hotte à flux laminaire. </li><li> Après échafaudage fabrication, scaffolds ont été revêtues d&#39;apatite. <ol class="ualpha"><li> SBF (fluide corporel simulé) On prépare une solution avec des concentrations en ions qui sont 5 fois supérieure à celle du plasma sanguin humain. Toutes les solutions sont stérilisées par filtration à travers une membrane de 0,22 um PSE (Nalgene). Immédiatement avant l&#39;opération de revêtement, on sèche échafaudages PLGA ont été soumis à une décharge luminescente, le plasma d&#39;argon-gravure (Harrick Scientific) pour améliorer le mouillage et l&#39;uniformité du revêtement. </li><li> Gravées échafaudages PLGA ont ensuite été incubées dans du SBF à 37 ° C dans un incubateur à chemise d&#39;eau pendant 12 heures, suivie par Mg 2 + et HCO 3 - libre SBF 2 pour un autre h 12 à 37 ° C sous agitation douce. </li><li> Enduits échafaudages PLGA ont été rincés doucement avec ddH 2 O stérile pour laver l&#39;excès de solution de chlorure de sodium, séchées dans une hotte à flux laminaire et désinfectés avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> L&#39;intégrité du revêtement d&#39;apatite ont été analysées avec un microscope électronique à balayage (MEB). Apatite enduit scaffolds ont été montés sur les talons de SEM (Ted Pella) et revêtue de carbone pour améliorer la conductivité. Le mode électrons secondaires a été appliqué pendant SEM (FEI / Phillips XL-30) d&#39;observation. Dispersion d&#39;énergie de rayons X du spectre a été obtenu pour les composition élémentaire des structures d&#39;apatite. </li></ol></li></ol> 3. L&#39;ensemencement de cellules <ol><li> Après avoir atteint des niveaux sous-confluence, laver les cellules avec du PBS (x2) et trypsiniser. </li><li> Compter les cellules de quantifier pour l&#39;ensemencement </li><li> Semences sur échafaudages 4,0 prédécoupées mm de diamètre avec 1,5 x 10 5 cellules. <ol class="ualpha"><li> Place de l&#39;individu échafaudage dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance réguliers avec une concentration d&#39;environ 1,5 x 10 5 cellules par 20 pi de médias </li><li> Pipeter 20 pl directement sur l&#39;échafaud, puis placer en incubateur de culture cellulaire pendant 30 min. </li><li> Après 30 minutes, ajouter 200 ul de médias et de permettre aux cellules à incubersur l&#39;échafaud pendant la nuit avant la chirurgie </li><li> Il n&#39;est pas nécessaire pour assurer l&#39;adhérence des cellules sur l&#39;échafaud comme l&#39;ensemencement d&#39;un nombre suffisant de cellules veillera à ce que la majorité se fixer sur l&#39;échafaud. Ceci a été validé dans notre laboratoire in vivo avec la bioluminescence et l&#39;analyse histologique. </li></ol></li></ol> 4. Création de défauts crânienne et une implantation in vivo <ol><li> Anesthetize adulte (60 jours d&#39;âge) CD-1 souris nude avec cocktail anesthésiant. (Kétamine / xylazine / acépromazine) à une concentration de 50% (1:1 dilution avec 0,9% de NaCl) ou par recommandé régime anesthésique selon les protocoles institution. Ces souris sont athymiques si les hASCs ne sera pas provoquer une réaction immunitaire. <ol class="lalpha"><li> Dosage: Le chlorhydrate de kétamine (80 mg / kg), xylazine (2,5 mg / kg) acépromazine (2,5 mg / kg) </li><li> Durée de l&#39;effet: environ 30 min </li></ol></li><li> Chirurgicale drapent l&#39;animal et stériliser la chirurgiele site avec de la bétadine et de l&#39;alcool (x3) et couvrir les yeux de souris avec une pommade avant de faire une incision médiane sagittale dans le cuir chevelu de l&#39;animal pour exposer l&#39;os pariétal droit. Retirez le péricrâne de l&#39;os pariétal droit avec grattage pointu (figure 1B). </li><li> Créer un unilatéral de 4 mm d&#39;épaisseur totale défaut dans le droit fil de suture non-pariétal associée en utilisant une solution stérile diamanté foret trépan. Précautions extrêmes doivent être prises pour ne pas perturber la dure-mère sous-jacente (figure 1B) que l&#39;épaisseur crânienne de souris est &lt;0,3 mm. </li><li> Avant l&#39;implantation, rincer échafaudages avec du PBS stérile pour empêcher le transfert de facteurs de croissance à moyen dérivés. </li><li> Placez l&#39;échafaud dans le défaut. </li><li> Enfin, suturer la peau ferme et de surveiller l&#39;animal par les protocoles établis postopératoires. </li><li> Utilisez une analgésie établi selon les directives de vos protocoles de soins aux animaux, au besoin en post-opératoire, par exemple-. buprénorphine 0,1 mg / kg. </li></ol> 5. Quantification de la formation ostéoïde <ol><li> Après microCT a été réalisée sur la souris, l&#39;image en trois dimensions a été reconstruite en utilisant un logiciel tel que décrit précédemment MicroView 1. </li><li> Utilisation d&#39;Adobe Photoshop, les images ont été dimensionnés pour une hauteur standard. </li><li> Utilisation de la fonction Magic Wand, les pixels ont été mesurées de la défectuosité crânienne. </li><li> Pourcentage de guérison de la lésion a été déterminée par la suite tomodensitométrie mesure de la zone de défaut crânienne et de déterminer le nombre de pixels et en le divisant par le nombre de pixels le défaut original </li><li> Par conséquent, si le microCT n&#39;est pas disponible, une alternative est d&#39;utiliser Adobe Photoshop et la récolte de la calvaria à des moments déterminés pour l&#39;histologie. </li><li> Utilisation colorations histologiques comme le bleu d&#39;aniline et Pentachrome qui dénotent formation ostéoïde, plusieurs sections le long de la durée du défaut doit être teinté </li><li> Utilisation d&#39;Adobe Photoshop, culture sur tous les domaines qui ne sont pasdans le défaut crânienne </li><li> Utilisez la fonction de baguette magique et déterminer le nombre de pixels de la formation de l&#39;os novo dans la zone de la lésion et de comparer à des contrôles ou d&#39;autres variables. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Le tissu adipeux a le potentiel de jouer un rôle essentiel dans la production de cellules souches pour une application clinique. Le tissu adipeux a un avantage unique en ce qu&#39;il est une source facilement disponible qui peut être récoltée dans une procédure relativement simple qui consiste à la morbidité et de la mortalité minime. Une fois que le tissu est récolté et recueilli, notre protocole est décrit dans la figure 2. Adipeuses cellules stromales sont isolés par une série d&#39;étapes de lavage, digestion à la collagénase, et la centrifugation. Une fois que les cellules sont étalées dans la culture, ils peuvent être étendus, placés dans des protocoles de différenciation in vitro différents, ou placés directement in vivo. Le création de la critique 4 mm taille de défaut crânienne offre un accès facile et reproductible modèle in vivo pour tester la capacité de différenciation ostéogénique de nos tissus adipeux provenant des cellules stromales. Grâce à l&#39;utilisation de microCT, nous sommes en mesure de suivre la formation de tissu osseux in vivo et suivre l&#39;évolution de nos interventions (figure 3). Le défaut de taille critique crânienne ne guérit pas dans la vie de l&#39;animal et l&#39;on voit à peu près 90% de l&#39;anomalie reste de brevets autour de 8 semaines. L&#39;échafaud lui-même (voir la discussion) a ostéogéniques propriétés inductives et a démontré sa capacité à induire une régénération osseuse. Les résultats typiques de placement échafaudage sans cellules montre que près d&#39;un tiers de la défectuosité aura formation de l&#39;os novo à 8 semaines. Avec l&#39;augmentation du tissu adipeux dérivés de cellules stromales, plus des deux tiers ou plus du défaut indique la régénération osseuse autour de 8 semaines, mais il est variabilité entre chaque animal et de la chirurgie. La formation de tissu osseux peuvent être quantifiés par l&#39;histologie et montrent des résultats typiques augmentation de la formation ostéoïde dans les échantillons avec ASC par le bleu d&#39;aniline et la coloration Pentachrome (figure 3C). En outre, nous montrons que les cellules implantées humaines contribuent à la formation sous-jacente de novo osseuse grâce à l&#39;utilisation de hASCs GFP-étiquetés qui montrent une coloration in vivo à 2 semaines près de la zone de formation de l&#39;os novo dans le défaut crânienne (figure 3D) . En outre, nous utilisons immunohistochimie avec un anticorps spécifique de l&#39;homme pour montrer la survie des cellules humaines et de la contribution dans le domaine de l&#39;anomalie (figure 3E). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> Figure 1 -. L&#39;lipoaspirate a deux couches. La couche supérieure contient les adipocytes et la majorité de la processes matériel cellulaire tandis que la couche inférieure contient la solution saline utilisée lors de la procédure lipoaspiration. B - la création de l&#39;anomalie crânienne par une incision médiane sur le péricrâne d&#39;isoler l&#39;os pariétal droit, de la création ultérieure d&#39;un défaut critique 4 mm taille crânienne sans interruption de la dure-mère sous-jacente. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> Figure 2. Vue d&#39;ensemble de la récolte et l&#39;application de lipoaspirate de l&#39;isolement de adipeuses cellules stromales à leur expansion, la différenciation et l&#39;utilisation in vitro et in vivo. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> La figure 3. MicroCT-A montre la cicatrisation in vivo de la taille critique défaut crânienne avec l&#39;application de l&#39;ASC à travers une hydroxyapatitie échafaudage (rangée du bas). Les contrôles comprennent pas d&#39;échafaudage et de défauts (rangée du haut) et le défaut de mise en place de l&#39;échafaud sans cellules (rangée du milieu) B - Quantification de la cicatrisation osseuse de la microCT montrant la guérison significativement augmenté dans le groupe ASC. C - Histologie montrant augmentation de la formation ostéoïde du groupe ASC (rangée du bas) par le bleu d&#39;aniline et la coloration Pentachrome. Pour le bleu d&#39;aniline, les taches ostéoïdes bleu foncé et Pentachrome, les taches ostéoïdes jaune. D - hASCS étiquetées avec la GFP ont été ensemencées sur un échafaudage et placé dans un défaut crânienne et sacrifiés à 2 semaines. La coloration a été fait avec une GFP anticorps marqué pour montrer les cellules humaines qui contribuent à la régénération dans la zone du défaut. E -. Human immunohistochimie montrant la prévalence antigène nucléaire des cellules humaines dans le domaine de la défectuosité à 2 semaines <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-integrating+knockdown+and+customized+scaffold+design+enhances+human-adipose-derived+stem+cells+in+skeletal+repair.">Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair.</a> Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Depuis l&#39;isolement de tissu adipeux dérivé des cellules stromales de 2 lipoaspirate, ces cellules ont été différenciées en une grande variété de lignées cellulaires. Le tissu adipeux est d&#39;origine mésodermique et, par conséquent, multipotentes dérivées du tissu adipeux cellules stromales sera probablement plus efficace avec une application vers un lignage mésodermique. La capacité à générer du tissu squelettique est particulièrement important compte tenu de la pénurie de sites donn...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif: </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lipoaspirate récolte </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Hank Balanced Salt Solution </td><td> Cellgro </td><td> 21-023 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> Sigma </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Crépine cellule 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-dessus 500 ml 0,22 um filtre </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Défaut crânienne </td></tr><tr><td> Z500 Brushless MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> Couteau circulaire 4,0 mm </td><td> Xemax chirurgicale </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate

Craniofaciale réparation et la régénération osseuse offre la promesse de la formation de novo des tissus grâce à une approche basée sur des cellules en utilisant des cellules souches. Adipeuses cellules stromales (ASC) se sont révélés être une source abondante de cellules souches multipotentes capables de subir ostéogénique, chondrogénique différenciation, adipogénique et myogénique. De nombreuses études ont exploré le potentiel ostéogénique de ces cellules in vivo avec l&#39;utilisation de biomatériaux divers échafaudages pour la livraison cellulaire. Il a été démontré qu&#39;en utilisant une ostéoconducteur, recouverte d&#39;hydroxyapatite poly (acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA-HA) échafaudage ensemencé avec CSA, un défaut critique entreprises crânienne, un défaut qui est défini par son incapacité à subir spontanée la guérison au cours de la vie de l&#39;animal, peuvent être effectivement montrer robuste régénération osseuse. Ce modèle in vivo démontrent la base de l&#39;approche translationnelle visant à régénérer le tissu osseux - le cellulairecomposant et la matrice biologique. Cette méthode sert de modèle pour l&#39;application ultime clinique d&#39;une cellule souche vers la réparation d&#39;un défaut spécifique au tissu.

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Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

Ce protocole décrit l&#39;isolement de tissu adipeux dérivé des cellules stromales de lipoaspirate et la création d&#39;une 4 mm de taille critique défaut crânienne pour évaluer la régénération osseuse.

Réparation d&#39;un modèle de critique des défauts de taille crânienne Utilisation adipeuses cellules stromales prélevés sur des Lipoaspirate

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

repair-critical-sized-calvarial-defect-model-using-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K vues.  Stanford University. Ce protocole décrit l'isolement de tissu adipeux dérivé des cellules stromales de lipoaspirate et la création d'une 4 mm de taille critique défaut crânienne pour évaluer la régénération osseuse.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

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A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Un modèle de contusion unilatérale des blessures moelle épinière cervicale aide de l&#39;impacteur Infinite Horizon

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role in healing of bone injuries. In the worst-case scenario mechanical instability can lead to delayed or non-union in humans. However, motion can also stimulate the healing process. In fractures that have motion cartilage forms to stabilize the fracture bone ends, and this cartilage is gradually replaced by bone through recapitulation of the developmental process of endochondral ossification. In contrast, if a bone fracture is rigidly stabilized bone forms directly via intramembranous ossification. Clinically, both endochondral and intramembranous ossification occur simultaneously. To effectively replicate this process investigators insert a pin into the medullary canal of the fractured bone as described by Bonnarens4. This experimental method provides excellent lateral stability while allowing rotational instability to persist. However, our understanding of the mechanisms that regulate these two distinct processes can also be enhanced by experimentally isolating each of these processes. We have developed a stabilization protocol that provides rotational and lateral stabilization. In this model, intramembranous ossification is the only mode of healing that is observed, and healing parameters can be compared among different strains of genetically modified mice 5-7, after application of bioactive molecules 8,9, after altering physiological parameters of healing 10, after modifying the amount or time of stabilization 11, after distraction osteogenesis 12, after creation of a non-union 13, or after creation of a critical sized defect. Here, we illustrate how to apply the modified Ilizarov fixators for studying tibial fracture healing and distraction osteogenesis in mice.

This article describes a method for stabilizing long bone fractures that is based on the application of modified Ilizarov external fixators 1-3. After application of the fixators and creation of the bone injury, healing can be assessed, distraction osteogenesis can be performed, or non-union or critical sized defect can be created and used to study therapeutic interventions.

Création fractures Rigidement stabilisées pour l&#39;évaluation de l&#39;ossification intramembranaires, ostéogenèse par distraction, ou de guérison des défauts critiques Sized

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Un modèle de la peau de souris fœtale de Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Une simple critique de taille fémorale défauts modèle chez la souris

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

Création et la Transplantation d’une feuille adipeux dérivées de cellules souches (ASC) dans un modèle de cicatrisation diabétique

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem cells can be obtained from different tissues and several methods for isolation have been described. The presented method for the isolation of adipose-derived regenerative cells (ADRCs) can be used within many therapeutic areas because the method is a general procedure and, therefore, not limited to erectile dysfunction (ED) therapy. ED is a common and serious side effect to radical prostatectomy (RP) since ED often is not well treated with conventional therapy. Using ADRC&#8217;s as treatment for ED has attracted great interest due to the initial positive results after a single injection of cells into the corpora cavernosum. The method used for the isolation of ADRC&#8217;s is a simple, automated process, that is reproducible and ensures a uniform product. Furthermore, the sterility of the isolated product is ensured because the entire process takes place in a closed system. It is important to minimize the risk of contamination and infection since the stem cells are used for injection in humans. The whole procedure can be done within 2.5-3.5 hours and does not require a classified laboratory which eliminates the need for shipping tissue to an off-site. However, the procedure has some limitations since the minimum amount of drained lipoaspirate for the isolation device to function is 100 g.

Precise disclosure of methods and protocols is crucial for large scale uptake of stem cell therapies. Here, we present a protocol to isolate adipose-derived regenerative cells, used for a single intracavernous injection as treatment of erectile dysfunction (ED) following radical prostatectomy (RP).

Isolement des cellules régénératives dérivées adipeuses pour le traitement de la dysfonction érectile après une prostatectomie radicale

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight infants, with high mortality and unclear pathogenesis. The cause of NEC may be related to inflammatory immune regulatory system abnormalities. An NEC animal model is an indispensable tool for NEC disease immune research. NEC animal models usually use C57BL/6J neonatal mice; BALB/c neonatal mice are rarely used. Related studies have shown that when mice are infected, Th2 cell differentiation is predominant in BALB/c mice compared to C57BL/6J mice. Studies have suggested that the occurrence and development of NEC are associated with an increase in T helper type 2 (Th2) cells and are generally accompanied by infection. Therefore, this study used neonatal BALB/c mice to induce an NEC model with similar clinical characteristics and intestinal pathological changes as those observed in children with NEC. Further study is warranted to determine whether this animal model could be used to study Th2 cell responses in NEC.

Un modèle murin BALB/c néonatal d’entérocolite nécrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is the most severe gastrointestinal (GI) disease that often occurs in premature infants, especially very low birth weight ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fraction vasculaire stromale mécanique dans l’hydrogel de fibrine pour la médecine régénérative

The Combination of Mechanically Isolated Stromal Vascular Fraction and Fibrin Hydrogel: A Processing Protocol

The regenerative potential of adipose-derived stromal cells (ASCs) has gained significant attention in regenerative and translational research. In the past, the extraction of these cells from adipose tissue required a multistep enzyme-based process, resulting in a heterogenous cell mix consisting of ACSs and other cells, which are jointly termed the stromal vascular fraction (SVF). More recently introduced mechanical SVF (mSVF) isolation protocols are less time-consuming and bypass regulatory concerns. We recently proposed a protocol that generates mSVF rich in stromal cells based on a combination of emulsification and centrifugation. One current issue in mSVF application for wound therapy application is the lack of a scaffold providing protection from mechanical manipulation and desiccation. Fibrin hydrogels have been shown to be a useful adjunct in cell transfer for wound healing purposes in the past. In the work herein, we delineate the preparation steps of an mSVF-fibrin hydrogel construct as a novel approach for translational research and clinical application.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Explorer le potentiel de la fraction vasculaire stromale dérivée de la graisse pour la cicatrisation des plaies

Mechanically isolated stromal vascular fraction (SVF) in combination with a fibrin hydrogel offers an easy and efficient carrier for viable adipose-derived stromal cells for various indications, including tissue engineering and or wound healing purposes. Here, we present the preparation of a mechanical SVF (mSVF)-fibrin hydrogel construct for translational research and clinical application.

La combinaison d’une fraction vasculaire stromale isolée mécaniquement et d’un hydrogel de fibrine : un protocole de traitement

The regenerative potential of adipose-derived stromal cells (ASCs) has gained significant attention in regenerative and translational research. In the ...