Ce travail a été soutenu par le CIRM Prix Early recherche translationnelle II TR2-01821, NIH / NIDCR (subventions R21 DE0177711 et RO1 DE01607), UC subvention à la découverte 07-10677, AWJ et RKS ont T32 bourses de formation des prix (5T32DE007296-14), jnz a une bourse de formation CIRM (TG2-01169).

1. Périvasculaire Isolement de cellules souches Cette opération est décrite en détail dans l&#39;article «purification de cellules souches périvasculaires de tissu adipeux humain blanc&quot; à côté, par M. Corselli et al. 2. Création d&#39;échafaudage <ol><li> Les échafaudages sont fabriqués sur mesure selon le protocole précédemment publié à partir de poly (lactique-co-acide glycolique) (PLGA, Burmingham Polymer) avec revêtement d&#39;hydroxyapatite 4-6. Apatite revêtues échafaudages PLGA sont fabriqués de 85/15 PLGA par coulée en solvant et un processus de lessivage particulaire. Les échafaudages sont créés dans une forme sphérique (2 mm de diamètre) pour l&#39;implantation poche musculaire, une forme discoïde (4 mm de diamètre) pour l&#39;implantation crânienne, ou cylindrique (4 mm de diamètre, 6 mm de longueur) pour fémorales défauts segmentaires. </li><li> En bref, PLGA / chloroforme solutions mélangé avec du saccharose (rapport polymère / sucrose 5/95, w / w) sont coulés dans un moule de diamètre téflon de 200 à 300 um à créer les contre-mesuretruct. Après lyophilisation nuit, échafaudages sont retiré du moule en Téflon et immergé dans ddH 2 O pour dissoudre le saccharose. Les échafaudages sont désinfectés par immersion dans de l&#39;éthanol 70% pendant 30 min, suivie de trois rinçages de ddH 2 O. </li><li> Pour le revêtement d&#39;apatite, un corps simulée solution fluide (SBF) est préparé par dissolution de CaCl 2 de manière séquentielle, de MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3, et K 2 HPO 4 • 3H 2 O dans ddH 2 O. PH de la solution est abaissée à 6 par ajout d&#39;acide chlorhydrique 1M pour augmenter la solubilité. Na 2 SO 4, KCl, NaCl et sont ajoutés et le pH final est ajusté à 6,5 (SBF 1). </li><li> Mg 2 + et HCO 3 - libre SBF (SBF 2) est préparé par addition de CaCl 2 et K 2 HPO 4 • 3H 2 O dans ddH 2 O et le pH est abaissé à 6. KCl et NaCl sont ajoutés et le pH final est ajusté à 6,8. Toutes les solutions sont stériles filtré à travers un membr de 0,22 um PSEane (Nalgene). Immédiatement avant le processus de revêtement, les échafaudages séchées PLGA sont soumis à décharge luminescente de gravure par plasma d&#39;argon (Harrick scientifique) pour améliorer le mouillage et l&#39;uniformité du revêtement. </li><li> Échafaudages gravées sont ensuite incubés dans le SBF 1 pour 12 h et changé de Mg 2 + et HCO 3 - libre SBF 2 pour un autre 12 h à 37 ° C sous agitation douce. Échafaudages revêtus sont lavés avec ddH 2 O pour enlever l&#39;excès d&#39;ions et lyophilisé avant de poursuivre des études. </li></ol> 3. L&#39;implantation du modèle musculaire Pouch <ol><li> 100 ul d&#39;une suspension de la CFP dans du PBS (tampon phosphate salin) sont délicatement déposés sur le sphérique PLGA basée sur implant immédiatement avant l&#39;implantation. Cellules ont été pré-marquée par insertion lentivirale de luciole luciférase, de manière à permettre au poste d&#39;implantation in vivo de suivi. La densité cellulaire est de 2,5 x 10 5 par implant. </li><li> SCID (sévère immunodéprimé combiné) chez la souris sont utilisés à 6 semaines d&#39;âge. Les animaux sont anesthetized par inhalation d&#39;isoflurane et une prémédication par la buprénorphine (Bedford Labs). Après la préparation Bétadine standard, incisions bilatérales dans les membres postérieurs sont faits (longitudinale et 2 mm de longueur). </li><li> Les poches sont coupées dans les muscles biceps fémoral par dissection parallèle à l&#39;axe de la fibre musculaire de long. Pour chaque souris, l&#39;implant à base de PLGA avec PSC est inséré, et le fascia du muscle est suturé avec 5-0 Vicryl (Ethicon). </li><li> La peau est ensuite fermé avec 5-0 Vicryl dans un modèle sous-cutanée. Les animaux sont traités en post-opératoire avec la buprénorphine pendant 48 heures et le TMP / SMX (triméthoprime / sulfaméthoxazole; Qualitest) pendant 10 jours. </li></ol> 4. L&#39;implantation des défauts crânienne modèle <ol><li> Après anesthésie à l&#39;isoflurane des souris SCID (12-14 semaines), les cheveux est tondue et la peau désinfectée avec de la Bétadine par protocole. </li><li> Une incision cutanée de 8 mm se fait le long de la suture sagittale médiane de la voûte de la souris. Ensuite, le vêlagearial périoste est délicatement enlevé par Q-tip application. </li><li> Ensuite, en utilisant diamantés bits de trépan dans un forage en haute-vitesse dentaire, un défaut de 4 mm d&#39;os pariétal est créé. Le défaut est de pleine épaisseur - mais l&#39;on prend soin de ne pas blesser la dure-mère sous-jacente. </li><li> Le sur-mesure PLGA basée sur l&#39;implant avec les CSP greffées est ensuite placé en douceur dans le site de la lésion. La densité cellulaire est de 2,5 x 10 5 par implant. Enfin, la peau est suturée avec 6-0 Vicryl. Les animaux sont traités en post-opératoire avec la buprénorphine pendant 48 heures et TMP / SMX pendant 10 jours. </li></ol> 5. Le fémur Implantation segmentaire modèle de défaut <ol><li> Rats athymiques (12-14 semaines) sont anesthésiés sous inhalation d&#39;isoflurane. Le fémur est nettoyée et préparée selon le protocole standard avec de la Bétadine (Figure 1). </li><li> Une incision de 27 à 30 mm longitudinale est faite sur la face antéro-externe du fémur. La diaphyse fémorale est ensuite exposée en séparant le lat vastuseralis et les biceps fémoral muscles (figure 2). </li><li> Afin de maximiser la cohérence de la régénération osseuse, le périoste recouvrant le défaut du fémur est complètement enlevée avec la résection du segment fémoral. </li><li> Une plaque de polyéthylène (longueur, 23 mm, largeur de 4 mm, hauteur, 4 mm) est placé sur la surface antéro-latérale du fémur. La plaque contient six trous pré-percés pour recevoir 0,9 mm de diamètre filetées de Kirschner (Zimmer). Prenant la plaque, comme un modèle, six broches de Kirschner filetées sont percés à travers la plaque et les deux corticales (Figure 3). </li><li> Ensuite, avec une lame de scie oscillante de petite taille (Stryker, MI), un de 6 mm à mi-diaphysaire défaut est créé. Défauts segmentaires sont ensuite traités par l&#39;insertion d&#39;implants à base de PLGA qui ont été chargés avec des cellules selon le protocole (figure 4). </li><li> Le muscle sus-jacente et le fascia sont fermées par 4-0 Vicryl résorbables pour fixer l&#39;implant en place, et la peau est suturée. </li&gt; </ol> 6. Des évaluations in vivo <ol><li> Évaluations radiographiques sont effectués de manière longitudinale à la fois par haute résolution et haute résolution XR μCT (micro tomodensitométrie) l&#39;analyse. Pour une analyse μCT (Skyscan 1172F), les images sont numérisées à une résolution de 19.73 pm (100 kV et 100 mA source de rayonnement, en utilisant un filtre en aluminium de 0,5 mm). Les images sont analysées à l&#39;aide DataViewer, Recon, CTAN, et des logiciels CTVol. </li><li> Imagerie par bioluminescence est également faite d&#39;une manière série d&#39;évaluer la prise de greffe de cellules, la viabilité, la prolifération et la migration d&#39;exclure de l&#39;implant. Imagerie par bioluminescence est effectuée en utilisant un dispositif de IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Sorties de lumière sont quantifiés à l&#39;aide du logiciel Image habitable (Xenogen). De sortie totale de la lumière est enregistré dans photons / seconde / cm ² / stéradian. </li><li> L&#39;analyse histologique et histomorphométrique est réalisée post-mortem. Les taches courantes employées comprennent le trichrome de Masson, le bleu d&#39;aniline, pentachrome, et Picrosirius rouge. L&#39;analyse histomorphométrique est réalisée facilement avec soit le bleu d&#39;aniline ou de taches pentachrome, dans lequel apparaît ostéoïde bleu foncé et jaune, respectivement. Pixels par champ à haute puissance sont calculées en utilisant l&#39;outil Baguette magique dans Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Comme les deux défauts crânienne et fémorale sont essentiels entreprises, pas de guérison important doit être prévu sans traitement avec des facteurs de croissance ou de cellules souches exogènes. En termes de manoeuvres chirurgicales, la dissection poche musculaire devrait être le long des plans aponévrotiques et donc peu de saignements doivent être rencontrés. Même si le modèle poche musculaire est effectuée bilatéralement, la souris doit être marcher avec facilité le premier jour postopératoire 1. Pour le défaut crânienne, des saignements est rencontrée, mais peut être imbibé d&#39;un Q-tip. Un soin extrême doit être pris de ne pas blesser la dure-mère sous-jacente - car cela perturberaitavec la guérison normale. Pour le modèle DSE, on prend soin de ne pas léser les vaisseaux sanguins principaux afin de ne pas causer le saignement excessif ou le nerf fémoral pour prévenir des dommages neurologiques. Broches de Kirschner sont percés avec une légère pression de manière à ne pas endommager l&#39;os cortical dans le processus. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> Figure 1. La préparation préopératoire pour défaut segmentaire du fémur (DSE) chez des rats athymiques. Des rats mâles (12-14 semaines) sont anesthésiés sous inhalation d&#39;isoflurane. Le fémur est nettoyée et préparée selon le protocole standard avec de la Bétadine. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> Figure 2. Exposition chirurgicale pour fémur défauts (DSE) la création segmentaire. Une incision longitudinale 27-30 mm est faite sur la face antéro-externe du fémur. La face latérale de la diaphyse fémorale est ensuite exposée en séparant le vastus lateraliset biceps crural. muscles <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> Figure 3. Fixation pour fémur défauts (DSE) la création segmentaire. Une plaque de polyéthylène (longueur, 23 mm, largeur de 4 mm, hauteur, 4 mm) est placé sur la surface antéro-latérale du fémur. La plaque contient six trous pré-percés pour recevoir 0,9 mm de diamètre filetées des broches de Kirschner. Prenant la plaque, comme un modèle, six broches de Kirschner filetées sont percés à travers la plaque et les deux corticales. Ensuite, un de 6 mm à mi-diaphysaire défaut est créé. Une fois que ceci est effectué, un échafaudage sur mesure est directement inséré, qui correspond exactement à l&#39;emplacement de défaut (non représenté). <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> Figure 4. Exemple de défaut crânienne postopératoire. A 4 mm, une anomalie circulaire crânienne est créé dans l&#39;os pariétal droit chez des souris athymiques. Imagée est ici un site de défaut implantés avecCSP à 8 semaines post-opératoires. A noter la présence d&#39;un nouvel os dans le site de la lésion.

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KT, BP, et CS sont des inventeurs de périvasculaires de cellules souches liées à des brevets déposés à l&#39;UCLA. Drs. KT, et CS sont les fondateurs de cicatrice Laboratories Inc, qui sous-licences périvasculaires de cellules souches liées à des brevets de l&#39;UC Regents. Dr Chia Soo est également un officier des laboratoires cicatrice, Inc

L&#39;isolement des CSP est bien décrit par ailleurs 1-3, y compris une publication JoVE soumis séparément traitant spécifiquement protocoles d&#39;isolement de la CFP et les méthodes. L&#39;objectif spécifique de cet article est de décrire et démontrer 3 protocoles pour la CFP en application in vivo de la formation osseuse / régénération. La pochette de souris SCID muscle est un modèle couramment décrit pour la formation osseuse ectopique humaine 7. Des différences importantes existent entre les extra-utérines et orthotopique (défaut) pour les modèles des os, y compris l&#39;interaction avec l&#39;hôte paracrine formation de cellules osseuses 8 ainsi que l&#39;abondance des facteurs de signalisation ostéogéniques présents dans le microenvironnement défaut squelettique. Deux défauts sont présentés ici, un defect8 crânienne et fémorale défaut segmentaire 4. Les deux sont bien documentés pour être critique de taille (c.-à-pas guérir de leur propre). Des différences intéressantes existent entre les défauts crânienne et fémorale. La première, lacellulaire: interaction entre les cellules et les cellules CSP xénogreffées endogènes est très différente. En termes d&#39;un défaut crânienne, CSP interagir avec la dure-mère sous-jacente (la couche la plus externe des méninges), ainsi que les ostéoblastes et les cellules périostiques circonscrivant le site du défaut. Il est important, l&#39;interaction entre les cellules implantées et les ostéoblastes qui entourent 8, ou des cellules implantées et qui sous-tend-mère (Levi et al., Sous presse) sont essentiels pour les cellules souches normales médiation ostéogenèse de procéder. En ce qui concerne le défaut de fémur segmentaire (DSE), les CSP xénogreffées sont exposés à une cellule très différente et de l&#39;environnement de cytokines. Par exemple, le site DSE est composé de cellules de moelle et d&#39;accompagnement des souches mésenchymateuses, ainsi que l&#39;endoste, le périoste et des os longs des ostéoblastes. Théoriquement, chaque cellule a sa propre réaction à la blessure, et chaque cellule peut avoir: les interactions des cellules avec des xénogreffes de la CFP. Autres différences claires existent entre crânienneet les défauts du fémur. Les os crânienne forment d&#39;abord par ossification intramembranaire, tandis que les os longs former à travers un intermédiaire du cartilage (ossification endochondrale). En outre, le processus de réparation post-traumatique a également reproduit ces origines développementales. Poste-DSE, la formation de cal cartilage est observée, alors qu&#39;aucune intermédiaire du cartilage est formé dans un défaut osseux pariétal. Enfin, l&#39;origine embryonnaire du crâne peut différer de celle des os longs. La majorité du crâne (y compris les cellules périvasculaires - péricytes - dans la région de la tête entière) est dérivé de la crête neurale (mesectoderm), tandis que le squelette appendiculaire est de dérivation mésoderme paraxial 9. Toutes ces différences peuvent entraîner des différences importantes en termes de réparation osseuse médiée par la CFP. L&#39;utilisation de CSP a plusieurs avantages par rapport traditionnelles tissu adipeux cellules stromales (ASCS). CSP ne nécessitent pas de culture et sont un whi cellules purifiées de la populationch ne comprennent pas les autres cellules stromales qui ne participent pas au - et peut même réguler négativement - la différenciation ostéogénique, comme les cellules endothéliales 10. En revanche, par exemple, des analyses clonales de CSA montrent que seule une sous-population sont capables de subir une différenciation ostéogénique in vitro 11. En fin de compte, les efforts du squelette de l&#39;ingénierie tissulaire sera probablement incorporer une cellule souche osteocompetent (tels que les CSP) avec facteurs de croissance exogènes et un échafaudage ostéoconducteur (tels que HA-PLGA utilisé dans les méthodes actuelles) de manière à mieux guérir les défauts squelettiques.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

Les cellules souches périvasculaires (CSP) peuvent être isolés en nombre suffisant à partir de tissus à des fins multiples de l&#39;ingénierie tissulaire osseuse 1-3. CSP sont une population FACS-triés de «péricytes» (CD146 + CD34-CD45-) et des cellules adventice »(CD146-CD34 + CD45-), dont chacun nous l&#39;avons déjà signalé pour avoir des propriétés de cellules souches mésenchymateuses. CSP, comme MSC, sont capables de subir une différenciation ostéogénique, ainsi que sécrètent pro-ostéogénique 1,2 cytokines. Dans le présent protocole, nous démontrons l&#39;osteogenicity de CSP dans plusieurs modèles animaux, y compris une implantation poche musculaire dans SCID (immunodéficience combiné sévère) des souris, une souris SCID défauts crânienne et un défaut segmentaire du fémur (DSE) chez des rats athymiques. Le modèle poche cuisse musculaire est utilisé pour évaluer la formation d&#39;os ectopique. Défauts crânienne sont centrées sur l&#39;os pariétal et standard sont de 4 mm de diamètre (taille critique) 8. DSE sont bicorticale et sont stabilisées avecun bar en polyéthylène et K-fils 4. Le DSE décrit est aussi un défaut de taille critique, ce qui ne modifie pas significativement guérir ses 4 propre. En revanche, si les cellules souches ou des facteurs de croissance sont ajoutés à la site de la lésion, la régénération osseuse significative ne peut être apprécié. L&#39;objectif global de xénogreffe CFP est de démontrer la capacité ostéogénique de ce type de cellule à la fois extra-utérines et orthotopique modèles de régénération osseuse.

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Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Les cellules souches périvasculaires (CSP) sont une classe de cellules souches roman pour la régénération tissulaire du squelette similaire aux cellules souches mésenchymateuses (CSM). CSP peuvent être isolés par FACS (fluorescence tri cellulaire activé) à partir de tissu adipeux prélevés lors des procédures de liposuccion standard, puis combiné avec un ostéoinducteur échafaudage pour atteindre la formation osseuse<em&gt; In vivo</em&gt;.

L&#39;utilisation de cellules souches humaines périvasculaires pour la régénération osseuse

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

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20.3K vues.  School of Dentistry, UCLA. Les cellules souches périvasculaires (CSP) sont une classe de cellules souches roman pour la régénération tissulaire du squelette similaire aux cellules souches mésenchymateuses (CSM). CSP peuvent être isolés par FACS (fluorescence tri cellulaire activé) à partir de tissu adipeux prélevés lors des procédures de liposuccion standard, puis combiné avec un ostéoinducteur échafaudage pour atteindre la formation osseuse In vivo.

Vidéo: Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsules d&#39;alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Recherche

Bio-ingénierie

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Absorption de nouvelles nanoparticules lipides enduit contenant Falcarindiol par des cellules souches mésenchymateuses humaines

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Modelage de la géométrie des colonies de cellules souches embryonnaires humaines sur des substrats conformes pour contrôler la mécanique de niveau tissulaire

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolement et culture de cellules épithéliales gingivales humaines primaires à l’aide de Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...